Alternative Methoden zum Nachweis der Erzeugung von Superoxid-Anionen in Blutplättchen

Zusammenfassung

Die Bildung von Superoxid-Anionen ist essentiell für die Stimulation von Blutplättchen und, wenn sie dysreguliert ist, entscheidend für thrombotische Erkrankungen. In diesem Artikel stellen wir drei Protokolle für den selektiven Nachweis von Superoxid-Anionen und die Untersuchung der redoxabhängigen Thrombozytenregulation vor.

Zusammenfassung

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind hochgradig instabile sauerstoffhaltige Moleküle. Ihre chemische Instabilität macht sie extrem reaktiv und verleiht ihnen die Fähigkeit, mit wichtigen biologischen Molekülen wie Proteinen, Nukleinsäuren und Lipiden zu reagieren. Superoxid-Anionen sind wichtige ROS, die durch die Reduktion der molekularen Sauerstoffreduktion (d. h. die Aufnahme eines Elektrons) erzeugt werden. Obwohl sie ursprünglich ausschließlich mit dem Altern, degenerativen und pathogenen Prozessen in Verbindung gebracht wurden, ist ihre Beteiligung an wichtigen physiologischen Reaktionen in jüngster Zeit offensichtlich geworden. Im Gefäßsystem wurde gezeigt, dass Superoxid-Anionen die Differenzierung und Funktion von glatten Gefäßmuskelzellen, die Proliferation und Migration von vaskulären Endothelzellen bei der Angiogenese, die Immunantwort und die Aktivierung von Blutplättchen bei der Blutstillung modulieren. Die Rolle von Superoxid-Anionen ist besonders wichtig bei der Fehlregulation von Blutplättchen und den kardiovaskulären Komplikationen, die mit einer Vielzahl von Erkrankungen verbunden sind, darunter Krebs, Infektionen, Entzündungen, Diabetes und Fettleibigkeit. Daher ist es in der kardiovaskulären Forschung äußerst relevant geworden, die Bildung von Superoxid-Anionen durch menschliche Blutplättchen effektiv zu messen, die redoxabhängigen Mechanismen zu verstehen, die das Gleichgewicht zwischen Blutstillung und Thrombose regulieren, und schließlich neue pharmakologische Werkzeuge zur Modulation von Thrombozytenreaktionen zu identifizieren, die zu Thrombosen und kardiovaskulären Komplikationen führen. In dieser Studie werden drei experimentelle Protokolle vorgestellt, die erfolgreich für den Nachweis von Superoxid-Anionen in Blutplättchen und die Untersuchung der redoxabhängigen Mechanismen zur Regulierung von Hämostase und Thrombose eingesetzt wurden: 1) Dihydroethidium (DHE)-basierter Superoxid-Anionen-Nachweis durch Durchflusszytometrie; 2) Visualisierung und Analyse von Superoxid-Anionen auf DHE-Basis durch Einzelthrombozyten-Bildgebung; und 3) Spin-Probe-basierte Quantifizierung des Superoxid-Anionenausstoßes in Thrombozyten durch Elektronen-Paramagnetische Resonanz (EPR).

Einleitung

Das Superoxid-Anion (O₂^•-) ist die funktionell relevanteste ROS, die in den Blutplättchen¹ erzeugt wird. O₂^•- ist das Produkt der Reduktion von molekularem Sauerstoff und die Vorstufe vieler verschiedener ROS ². Die Dismutation von O₂^•- führt zur Bildung von Wasserstoffperoxid (H₂O₂) durch spontane Reaktionen in wässriger Lösung oder durch Reaktionen, die durch Superoxiddismutasen (SODs³) katalysiert werden. Obwohl verschiedene enzymatische Quellen vorgeschlagen wurden (z. B. X....

Protokoll

Die Entnahme von peripherem Blut von einwilligenden Freiwilligen wird von der lokalen Ethikkommission und der National Health Service Health Research Authority genehmigt (REC-Referenz: 21/SC/0215; IRAS-ID: 283854).

1. Methode 1: Superoxid-Anionen-Nachweis mittels DHE mittels Durchflusszytometrie

1. Erwärmen Sie die Natriumcitratlösung (4 % w/v) (37 °C) und verwenden Sie sie als Antikoagulans, indem Sie sie zum Zeitpunkt der Venenpunktion im Verhältnis 1:7 (0,5 % w/v endgültig) direkt ins Blut geben.
2. Entnahme von peripherem menschlichem Blut von gesunden Probanden durch Vene....

Diskussion

In diesem Manuskript stellen wir drei verschiedene Techniken vor, die das Potenzial haben, die Fähigkeit zur Untersuchung der redoxabhängigen Regulation der Thrombozytenfunktion durch den selektiven Nachweis von O₂^•- zu verbessern. Die ersten beiden Methoden sind eine Verbesserung gegenüber bestehenden Techniken, da eine Redoxsonde verwendet wird (DHE anstelle der häufigeren, aber weniger zuverlässigen DCFDA). Diese Techniken sind daher leicht zug?.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-02.1-50mg	Reagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria III	BD Biosciences	NA	Flow cytometer
Bovine Serum Albumin	Merck/Sigma	A7030	For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-E.11-BES	EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)	Merck/Sigma	C4963	Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4	Labmedics/Chronolog	NA	Aggregometer
CM radical	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-20.1-100mg	Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-09.1-100mg	Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-10.1-1g	Reagent for EPR
Dihydroethidium	Thermo Fisher Scientifics	D11347	Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxide	Merck/Sigma	34869	For stock solution preparation
EPR sealing wax plates	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-A.3-VPM	Consumable for EPR
EPR-grade water	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-07.7.1-0.5L	Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasma	Merck/Sigma	F4883	For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 Antibody	BioLegend	303704	Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes	Labmedics/Chronolog	P/N 312	Consumable for incubation in aggregometer
Horm Collagen	Labmedics/Chronolog	P/N 385	For platelet stimulation
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	NA	ImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
Indomethacin	Merck/Sigma	I7378	For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µl	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-G.6.1-50µL	Consumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochloride	Merck/Sigma	P2658	For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)	Merck/Sigma	P5515	For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)	Merck/Sigma	S5770	For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)	Labmedics/Chronolog	P/N 313	Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)	Merck/Sigma	S9549	Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasma	Merck/Sigma	T6884	For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870	Enzo Life Science	BML-EI395	NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscope	Zeiss	NA	Confocal microscope