检测血小板中超氧阴离子生成的替代方法

摘要

超氧阴离子的产生对于刺激血小板至关重要，如果失调，则对血栓性疾病至关重要。在这里，我们提出了三种用于选择性检测超氧阴离子和研究氧化还原依赖性血小板调节的方案。

摘要

活性氧 （ROS） 是高度不稳定的含氧分子。它们的化学不稳定性使它们具有极强的反应性，并使其能够与重要的生物分子（如蛋白质、核酸和脂质）反应。超氧阴离子是通过分子氧还原（即获得一个电子）还原产生的重要 ROS。尽管它们最初仅涉及衰老、退化和致病过程，但它们参与重要的生理反应最近变得很明显。在血管系统中，超氧阴离子已被证明可调节血管平滑肌细胞的分化和功能、血管生成中血管内皮细胞的增殖和迁移、免疫反应以及止血中血小板的激活。超氧阴离子的作用在血小板失调和与多种疾病相关的心血管并发症中尤为重要，包括癌症、感染、炎症、糖尿病和肥胖。因此，能够有效测量人血小板产生超氧阴离子，了解调节止血和血栓形成之间平衡的氧化还原依赖性机制，并最终确定调节血小板反应的新型药理学工具，从而在心血管研究中变得极其重要血栓形成和心血管并发症。本研究提出了三种成功采用的实验方案，用于检测血小板中超氧阴离子以及研究调节止血和血栓形成的氧化还原依赖性机制：1） 通过流式细胞术进行基于二氢乙锭 （DHE） 的超氧阴离子检测;2） 基于 DHE 的超氧阴离子可视化和单血小板成像分析;3） 通过电子顺磁共振 （EPR） 对血小板中超氧阴离子输出进行基于自旋探针的定量。

引言

超氧阴离子 （O₂^•-） 是血小板中产生的功能最相关的 ROS¹。O₂^•- 是分子氧还原的产物，是许多不同 ROS ² 的前体。O₂^•- 的歧化导致通过水溶液中的自发反应或超氧化物歧化酶 （SOD） 催化的反应产生过氧化氢 （H₂O₂）。尽管已经提出了不同的酶来源（例如，黄嘌呤氧化酶⁴、脂氧合酶⁵、环氧合酶^{6 和一}氧化氮合酶⁷），但线粒体呼吸 ^8,9 和烟酰胺腺嘌二核苷酸磷酸氧化酶 （NOX）¹⁰ 是真核细胞中超氧阴离子的最主要来源。血小板似乎也是如此，其中线粒体呼吸的电子泄漏^11,12 和 NOX 的酶活性....

研究方案

从同意的志愿者那里采集外周血已获得当地伦理委员会和国家卫生服务卫生研究局的批准（REC 参考：21/SC/0215;IRAS ID：283854）。

1. 方法 1：通过流式细胞术使用 DHE 检测超氧阴离子

1. 预热 （37 °C） 柠檬酸钠溶液 （4% w/v），并在静脉穿刺时以 1：7（最终 0.5% w/v）的比例将其直接添加到血液中，将其用作抗凝剂。
2. 通过肘正中静脉静脉穿刺从健康志愿者中抽取外周人血。
3. 通过初始离心步骤以 200 x g 的速度 20 分钟从全血中获得富血小板血浆 （PRP）。
4. 用可逆血小板抑制剂吲哚美辛 （10 μM） 和 PGE1 （40 ng/mL） 以 500 x g 离心 PRP 10 分钟。
5. 将所得血小板沉淀重悬于改良的 Tyrode 缓冲液（145 mM NaCl、2.9 mM KCl、10 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸 （HEPES）、1 mM MgCl 2 、5 mM 葡萄糖，pH 7.3） （37 °C） 中，密度为 2 x 10⁸ 个血小板/mL。
6. 分离后，血小板在 37 °C 下静置 30 分钟。
7. 在二甲基亚砜 （DMSO....

讨论

在这份手稿中，我们提出了三种不同的技术，这些技术有可能通过选择性检测 O₂^•- 来提高研究血小板功能的氧化还原依赖性调节的能力。前两种方法是对现有技术的改进，因为使用了氧化还原探针（DHE 而不是更常见但不太可靠的 DCFDA）。因此，这些技术很容易获得，大多数实验室无需特殊设备或培训费用即可有效采用它们。第三种技术基于使用.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-02.1-50mg	Reagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria III	BD Biosciences	NA	Flow cytometer
Bovine Serum Albumin	Merck/Sigma	A7030	For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-E.11-BES	EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)	Merck/Sigma	C4963	Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4	Labmedics/Chronolog	NA	Aggregometer
CM radical	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-20.1-100mg	Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-09.1-100mg	Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-10.1-1g	Reagent for EPR
Dihydroethidium	Thermo Fisher Scientifics	D11347	Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxide	Merck/Sigma	34869	For stock solution preparation
EPR sealing wax plates	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-A.3-VPM	Consumable for EPR
EPR-grade water	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-07.7.1-0.5L	Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasma	Merck/Sigma	F4883	For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 Antibody	BioLegend	303704	Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes	Labmedics/Chronolog	P/N 312	Consumable for incubation in aggregometer
Horm Collagen	Labmedics/Chronolog	P/N 385	For platelet stimulation
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	NA	ImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
Indomethacin	Merck/Sigma	I7378	For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µl	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-G.6.1-50µL	Consumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochloride	Merck/Sigma	P2658	For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)	Merck/Sigma	P5515	For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)	Merck/Sigma	S5770	For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)	Labmedics/Chronolog	P/N 313	Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)	Merck/Sigma	S9549	Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasma	Merck/Sigma	T6884	For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870	Enzo Life Science	BML-EI395	NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscope	Zeiss	NA	Confocal microscope