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摘要

超氧阴离子的产生对于刺激血小板至关重要，如果失调，则对血栓性疾病至关重要。在这里，我们提出了三种用于选择性检测超氧阴离子和研究氧化还原依赖性血小板调节的方案。

摘要

活性氧 （ROS） 是高度不稳定的含氧分子。它们的化学不稳定性使它们具有极强的反应性，并使其能够与重要的生物分子（如蛋白质、核酸和脂质）反应。超氧阴离子是通过分子氧还原（即获得一个电子）还原产生的重要 ROS。尽管它们最初仅涉及衰老、退化和致病过程，但它们参与重要的生理反应最近变得很明显。在血管系统中，超氧阴离子已被证明可调节血管平滑肌细胞的分化和功能、血管生成中血管内皮细胞的增殖和迁移、免疫反应以及止血中血小板的激活。超氧阴离子的作用在血小板失调和与多种疾病相关的心血管并发症中尤为重要，包括癌症、感染、炎症、糖尿病和肥胖。因此，能够有效测量人血小板产生超氧阴离子，了解调节止血和血栓形成之间平衡的氧化还原依赖性机制，并最终确定调节血小板反应的新型药理学工具，从而在心血管研究中变得极其重要血栓形成和心血管并发症。本研究提出了三种成功采用的实验方案，用于检测血小板中超氧阴离子以及研究调节止血和血栓形成的氧化还原依赖性机制：1） 通过流式细胞术进行基于二氢乙锭 （DHE） 的超氧阴离子检测;2） 基于 DHE 的超氧阴离子可视化和单血小板成像分析;3） 通过电子顺磁共振 （EPR） 对血小板中超氧阴离子输出进行基于自旋探针的定量。

引言

超氧阴离子 （O2•-） 是血小板中产生的功能最相关的 ROS1。O2•- 是分子氧还原的产物，是许多不同 ROS 2 的前体。O2•- 的歧化导致通过水溶液中的自发反应或超氧化物歧化酶 （SOD） 催化的反应产生过氧化氢 （H2O2）。尽管已经提出了不同的酶来源（例如，黄嘌呤氧化酶4、脂氧合酶5、环氧合酶6 和一氧化氮合酶7），但线粒体呼吸 8,9 和烟酰胺腺嘌二核苷酸磷酸氧化酶 （NOX）10 是真核细胞中超氧阴离子的最主要来源。血小板似乎也是如此，其中线粒体呼吸的电子泄漏11,12 和 NOX 的酶活性13,14 被描述为超氧阴离子输出的主要贡献者。

尽管有几项研究集中在 O2•- 对血小板的调节上，但关于负责的分子机制尚未达成共识。已针对不同的血小板受体提出通过直接氧化和二硫键形成来调节表面受体活性。有人提出 ROS 通过直接氧化半胱氨酸残基对整合素 αIIbβ3 进行正调节 15,16,17。同样，由于血小板对胶原蛋白的反应取决于二硫键依赖性二聚化和随之而来的糖蛋白 VI （GPVI） 二聚化18，因此有人提出了通过 ROS 依赖性氧化增强受体活性19，尽管尚未得到实验的充分证明。最后，ROS 诱导的糖蛋白 Ib 巯基 （GPIb） 氧化被证明在炎症期间促进血小板粘附和血小板-白细胞相互作用20。相反，作为巯基氧化和受体激活减少的可能结果，GPVI 和 GPIb 的胞外结构域的脱落会因还原条件而减少21。

还提出了独立于血小板表面受体直接氧化的作用模式。ROS，包括 O2•-，已被证明通过减弱含有 Src 同源区 2 的蛋白酪氨酸磷酸酶 2 （SHP-2） 的活性来正向调节胶原蛋白受体 GPVI，SHP-2 负向调节该受体的信号级联22。此外，O2•- 可以通过与一氧化氮 （NO） 快速反应生成 ONOO-（过氧亚硝酸盐），这通常通过 NO 敏感的鸟苷酸环化酶 （NO-GC） 和负血小板调节因子环状 GMP （cGMP） 的产生来抑制血小板23,24。由此产生的 NO 水平降低可导致血小板增强。或者，NOX2 产生 O2•- 被认为有助于脂质过氧化和异前列腺素形成，这对血小板活化和粘附至关重要25。最后，丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 细胞外信号调节激酶 5 （ERK5） 是一种蛋白激酶，被提议作为血小板中的氧化还原应激传感器26，被 O2•- 激活并在血小板中诱导促凝表型（通过基于流式细胞术的磷脂酰丝氨酸外化测量估计）27。

血小板中 O2•- 和其他 ROS 生成的失调与过度的止血反应有关，导致与动脉粥样硬化、糖尿病、高血压、肥胖和癌症相关的血栓性心血管并发症28,29。在这些病理环境中，血小板的 ROS 输出增加，这导致其粘附和聚集反应的增强。除了对血小板反应的影响外，血小板的自由基输出可能对其他血细胞和血管结构产生影响，这是心血管健康的一个知之甚少且研究不足的领域30。尽管我们对将氧化应激与血栓形成疾病联系起来的分子机制了解有限，但抗氧化剂在预防心血管疾病方面的临床相关性受到了相当大的关注。血浆抗氧化剂水平已被证明与患心血管疾病的风险呈负相关，膳食抗氧化剂已被证明可以预防冠状动脉疾病31,32。因此，使用膳食抗氧化剂已被倡导为预防心血管疾病的一种有前途的方法 33,34,35。在血小板中 ROS 生成的影响中，细胞凋亡的增加可产生重要的病理生理学影响36,37。总体而言，检测和量化血小板输出 O2•- 的可靠方案在心血管研究中越来越重要。

目前，可用于检测 ROS 的技术在特异性（即检测到的氧化剂分子的化学性质未知）和可靠性（即与生物分子和实验试剂的不必要相互作用导致有偏差的非生理结果）方面存在重要的局限性38,39。检测血小板中 ROS 的最常用方法是使用二氯二氢荧光素二乙酸酯 （DCFDA），其通过细胞内酯酶转化为二氯二氢荧光素 （DCFH），从而通过细胞氧化剂（包括羟基自由基和过氧化物酶-H 2O2 中间体）转化为高荧光二氯荧光素 （DCF）40,41.尽管它被广泛使用，但人们对这种方法测量细胞内 ROS38 的可靠性提出了严重质疑。事实上，DCFH 氧化成 DCF 可以由过渡金属离子（例如 Fe2+）或含血红素的酶（例如细胞色素）而不是 ROS42 诱导。此外，DCFDA 被细胞过氧化物酶转化为其半醌自由基形式 （DCF•-），进而通过与分子氧 （O2） 反应并释放 O2•- 而被氧化成 DCF，这导致氧化反应的人为放大 41,43,44.因此，通过 DCFDA 检测细胞内 ROS 有助于获得初步见解，但需要谨慎考虑和广泛的实验控制38,39。

本研究提出了检测和测量血小板功能关键调节因子 O2•-1 的三种替代技术。第一种技术是使用 DHE 和流式细胞术进行检测，与 DCFDA 相比，它具有可靠性和特异性的优势。这里提出的第二种技术也利用 DHE，但检测方法是活血小板荧光成像，它允许以快速动力学和单细胞分辨率研究血小板信号传导上 O2•- 的产生。最后，基于在 EPR 共振实验中使用羟胺自旋探针 1-羟基-3-甲氧基羰基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷 （CMH） 的方案提供了量化血小板产生 O2•- 的速率并在不同条件下进行比较的可能性。

研究方案

从同意的志愿者那里采集外周血已获得当地伦理委员会和国家卫生服务卫生研究局的批准（REC 参考：21/SC/0215;IRAS ID：283854）。

1. 方法 1：通过流式细胞术使用 DHE 检测超氧阴离子

  1. 预热 （37 °C） 柠檬酸钠溶液 （4% w/v），并在静脉穿刺时以 1：7（最终 0.5% w/v）的比例将其直接添加到血液中，将其用作抗凝剂。
  2. 通过肘正中静脉静脉穿刺从健康志愿者中抽取外周人血。
  3. 通过初始离心步骤以 200 x g 的速度 20 分钟从全血中获得富血小板血浆 （PRP）。
  4. 用可逆血小板抑制剂吲哚美辛 （10 μM） 和 PGE1 （40 ng/mL） 以 500 x g 离心 PRP 10 分钟。
  5. 将所得血小板沉淀重悬于改良的 Tyrode 缓冲液（145 mM NaCl、2.9 mM KCl、10 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸 （HEPES）、1 mM MgCl 2 、5 mM 葡萄糖，pH 7.3） （37 °C） 中，密度为 2 x 108 个血小板/mL。
  6. 分离后，血小板在 37 °C 下静置 30 分钟。
  7. 在二甲基亚砜 （DMSO） 中制备 5 mM 储备液的 DHA。
  8. 将 DHE 添加到终浓度为 5 μM 的血小板悬液中（将储备溶液稀释 1 至 1,000，终 DMSO 浓度为 0.1% v/v），并在 37 °C 下孵育 15 分钟。
  9. 用药物和/或 ROS 清除剂处理血小板 15 分钟，然后用所需的生理刺激和浓度（例如，0.1 单位/mL 凝血酶或 3 μg/mL 胶原蛋白）刺激。
  10. 刺激后，在冰冷的改性 HEPES 缓冲液中稀释血小板悬液 1 至 10。
  11. 对于流式细胞术，将侧向散射 （SSC） 和前向散射 （FSC） 增益分别设置为 40 mV 和 220 mV，并使用对数刻度散点图来可视化悬浮液中的颗粒群（ 图 1A 中的示例）。
  12. （可选）使用抗 CD41 抗体对一份血小板悬液进行免疫染色，以鉴定与血小板相对应的事件群体（图 1B 中的示例）。
  13. 使用 405 nm 激发（紫色激光）和 580 nm 波长发射通过流式细胞术分析样品，选择性检测超氧阴离子特异性产物 2-羟基乙锭 （2OH-Et + ）（图 2）。
    注意：不建议用多聚甲醛固定和长期储存样品。

2. 方法 2：使用 DHE 通过单血小板荧光成像检测超氧阴离子

  1. 在实验当天，用来自马肌腱的 0.1 mg/mL 原纤维胶原 I（Horm 胶原蛋白）、0.2 mg/mL 纤维蛋白原或 1 mg/mL 聚-L-赖氨酸 （PLL） 在改良的 Tyrode 缓冲液中涂布 8 孔μ玻片，在 37 °C 下涂布 2 小时。
  2. 用改良的 Tyrode 缓冲液洗涤两次（每次 10 分钟）。
  3. 通过在改良的 Tyrode 缓冲液加 5 mg/mL 牛血清白蛋白 （BSA） 中孵育至少 30 分钟（或直到实验）来淬灭非特异性粘附。
  4. 预热 （37 °C） 柠檬酸钠溶液 （4% w/v），并在静脉穿刺时以 1：7（最终 0.5% w/v）的比例将其直接添加到血液中，将其用作抗凝剂。
  5. 通过肘正中静脉静脉穿刺从健康志愿者中抽取外周人血。
  6. 通过初始离心步骤以 200 x g 的速度 20 分钟从全血中获得富血小板血浆 （PRP）。
  7. 用可逆血小板抑制剂吲哚美辛 （10 μM） 和 PGE1 （40 ng/mL） 以 500 x g 离心 PRP 10 分钟。
  8. 将所得血小板沉淀重悬于改良的 Tyrode 缓冲液（145 mM NaCl、2.9 mM KCl、10 mM HEPES、1 mM MgCl 2 、5 mM 葡萄糖，pH 7.3）（37 °C）中，密度为 4 x 107 个血小板/mL。
  9. 分离后，血小板在 37 °C 下静置 30 分钟。
  10. 在二甲基亚砜 （DMSO） 中制备 10 mM 储备液的 DHA。
  11. 向血小板悬液中加入终浓度为 10 μM 的 DHE（将储备溶液稀释 1 至 1,000，终 DMSO 浓度为 0.1% v/v）并孵育 1 分钟 （37 °C）。
  12. 与 DHE 孵育 1 分钟后，从所选孔中取出封闭溶液，将 μ 载玻片放在显微镜载物台上准备成像，然后轻轻分配血小板。
  13. 通过倒置共聚焦成像监测 DHE 转化为 2OH-Et + 10 分钟 （405/580 nm ex/em），使用 40 倍油浸镜头每 10 秒收集一次图像。
  14. （可选）对于涂有 PLL 的孔，通过在血小板分配和荧光图像收集后 10 分钟添加激动剂再添加激动剂 10 分钟，监测响应可溶性激动剂（例如，0.1 单位/mL 凝血酶或 3 μg/mL 胶原蛋白）的超氧阴离子产生，如步骤 2.13 中所述。
  15. （可选）如果需要，在时间过程中轻轻分配到孔的一侧，添加超氧阴离子清除剂或选择性抑制剂（例如，NOX 抑制剂），并按照 2.13 中的描述收集荧光图像 10 分钟。
  16. 通过选择包含代表性单血小板的 感兴趣区域 （ROI） 并使用成像套件 ImageJ 1.53t 的 测量 工具分析不同帧中的荧光强度来量化单细胞荧光分析。

3. 方法 3：使用电子顺磁共振 （EPR） 检测血小板中的超氧阴离子

  1. 预热 （37 °C） 柠檬酸钠溶液 （4% w/v），并在静脉穿刺时以 1：7（最终 0.5% w/v）的比例将其直接添加到血液中，将其用作抗凝剂。
  2. 通过肘正中静脉静脉穿刺从健康志愿者中抽取外周人血。
  3. 通过初始离心步骤以 200 x g 的速度 20 分钟从全血中获得富血小板血浆 （PRP）。
  4. 用可逆血小板抑制剂吲哚美辛 （10 μM） 和 PGE1 （40 ng/mL） 以 500 x g 离心 PRP 10 分钟。
  5. 将所得血小板沉淀重悬于改良的 Tyrode 缓冲液（145 mM NaCl、2.9 mM KCl、10 mM HEPES、1 mM MgCl2、5 mM 葡萄糖，pH 7.3）（37 °C）中，密度为 2 x 108 个血小板/mL。
  6. 分离后，血小板在 37 °C 下静置 30 分钟。
  7. 向血小板悬液中加入 5 μM 二乙基二硫代氨基甲酸酯 （DETC） 和 25 μM 去铁胺。
  8. 在不孵育的情况下，加入 200 μM 1-羟基-3-甲氧基羰基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷 （CMH）。
  9. 将样品加载到聚集比色皿（包括 Teflon 涂层的搅拌磁铁）内的聚集仪上。
  10. 1 分钟后，添加所需浓度的刺激物（例如，1 单位/mL 凝血酶或 3 μg/mL 胶原蛋白）。孵育 10 分钟。
  11. （可选）通过在所需时间进行步骤 3.12，在不同时间点获得超氧阴离子生成。
  12. 将血小板悬液从聚集比色皿转移到微量离心管中，并以 6,000 x g 的速度快速旋转 10 秒。
  13. 在毛细管微量移液器中加载 50 μL 上清液，并用 EPR 密封蜡密封。
  14. 将样品转移到 EPR 扫描仪。
  15. 将 EPR 扫描仪设置如下：中心场 3,492.5 G，场扫描 60 G，调制幅度 2 G，扫描时间 10 s，扫描次数 10，微波频率 9.39 GHz，微波功率 20 mW，转换时间 327.68 ms，时间常数 5242.88 ms。
  16. 将 CMH 氧化为 CM● 估计为使用上述参数记录的 EPR 峰的曲线下面积 （AUC）。
  17. 构建校准曲线，在 y 轴上绘制如步骤 3.16 中所述测量的 EPR 强度，在 x 轴上绘制市售 CM● 的浓度（例如，0、0.3、1、3、10 和 30 μM）。
  18. 根据样品中的 CM● 浓度，使用“代表性结果”部分中描述的公式获得样品中血小板产生的超氧阴离子的量。

结果

对于 DHE 荧光的流式细胞术检测，我们显示了静息血小板（图 3A）或用 0.1 单位/mL 凝血酶刺激血小板（图 3B）的代表性结果。O2•- 输出量化为血小板平均荧光强度 （MFI），如用 0.1 单位/mL 凝血酶（图 3C）或 3 μg/mL 胶原蛋白相关肽 （CRP） 刺激所示（图 3D）?...

讨论

在这份手稿中，我们提出了三种不同的技术，这些技术有可能通过选择性检测 O2•- 来提高研究血小板功能的氧化还原依赖性调节的能力。前两种方法是对现有技术的改进，因为使用了氧化还原探针（DHE 而不是更常见但不太可靠的 DCFDA）。因此，这些技术很容易获得，大多数实验室无需特殊设备或培训费用即可有效采用它们。第三种技术基于使用...

披露声明

作者没有什么可披露的。

致谢

这项工作由英国心脏基金会 （PG/15/40/31522）、英国阿尔茨海默病研究中心 （ARUK-PG2017A-3） 和欧洲研究委员会 （#10102507） 资助 G. Pula 资助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NAFlow cytometer
Bovine Serum AlbuminMerck/SigmaA7030For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH NOX-E.11-BES EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM radicalNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC) Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Reagent for EPR
DihydroethidiumThermo Fisher ScientificsD11347Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxideMerck/Sigma34869For stock solution preparation 
EPR sealing wax platesNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMConsumable for EPR
EPR-grade waterNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasmaMerck/SigmaF4883For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 AntibodyBioLegend303704Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes Labmedics/ChronologP/N 312Consumable for incubation in aggregometer
Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385For platelet stimulation
ImageJ National Institutes of Health (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndomethacinMerck/SigmaI7378For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µlNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µLConsumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochlorideMerck/SigmaP2658For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)Merck/SigmaS5770For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)Labmedics/ChronologP/N 313Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasmaMerck/SigmaT6884For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscopeZeissNAConfocal microscope

参考文献

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