تثبيت قطع عظم الفخذ مع تثبيت الصفائح في Ambystoma mexicanum

Summary

يتم تقديم بروتوكول لجراحة قطع عظم الفخذ مع استخدام تثبيت اللوحة الداخلية في قنافذ البحر الناضجة. يمكن استخدام الإجراء لإجراء دراسات مقارنة حول تجديد الأطراف والتئام الكسور في البرمائيات المائية.

Abstract

قنفذ البحر (Ambystoma mexicanum) هو كائن نموذجي واعد للطب التجديدي بسبب قدرته الرائعة على تجديد الأعضاء المفقودة أو التالفة ، بما في ذلك الأطراف والدماغ والقلب والذيل وغيرها. تسلط الدراسات التي أجريت على قنفذ البحر الضوء على المسارات الخلوية والجزيئية التي تحكم تنشيط السلف واستعادة الأنسجة بعد الإصابة. يمكن تطبيق هذه المعرفة لتسهيل التئام الإصابات غير الكفؤة للتجديد ، مثل عدم اتحاد العظام. في البروتوكول الحالي ، يتم وصف تثبيت عظم الفخذ باستخدام نظام تثبيت لوحة داخلي. تم تكييف الإجراء للاستخدام في المائية (axolotl ، Ambystoma mexicanum). تم استخدام قنافذ البحر ≥ 20 سم من الخطم إلى الذيل مع عظم الفخذ المتحجر بالكامل بحجم الماوس ، وتم إيلاء اهتمام خاص لوضع اللوحة وتثبيتها ، وكذلك لرعاية ما بعد الجراحة. تسمح هذه التقنية الجراحية بتثبيت العظام بشكل موحد ومستقر ويمكن أن تكون مفيدة للمقارنة المباشرة مع تجديد أطراف axolotl والدراسات المماثلة لشفاء العظام عبر البرمائيات والثدييات.

Introduction

يعد قنفذ البحر (Ambystoma mexicanum) نموذجا مهما لتجديد الأعضاء ، بما في ذلك الذيل والحبل الشوكي والدماغ والقلب والخياشيم والأطراف^{1،2،3،4،5}. كشفت الدراسات التفصيلية لتجديد أطراف قنفذ البحر عن آليات عدم تمايز الخلايا وتشكيل تجمع الخلايا الجذعية ، blastema، في موقع البتر. نظرا لقدرة الخلايا الأرومية على إعادة بناء جميع أجزاء الأطراف المفقودة ، بما في ذلك الهيكل العظمي^{المنقوش 6,7} ، يبدو أن قنفذ البحر كائن نموذجي جذاب لدراسات شفاء العظام. في الآونة الأخيرة ، ركزت العديد من الدراسات بشكل أكبر على بيولوجيا العظام في axolotls ، واصفة مورفولوجيا الهيكل العظمي ، والتكوين الخلوي ، وديناميكيات التعظم.

وجد في الثدييات أن عملية التئام العظام في العظام الطويلة تحدث عن طريق التعظم داخل الغضروف وتتكون من عدة مراحل: ورم دموي ، وأنسجة حبيبية ، وتشكيل الكالس الناعم ، وتعظم الكالس إلى الكالس الصلب والعظام المنسوجة ، وإعادة تشكيل العظام⁸. أظهرت دراسة حديثة أنه يمكن ملاحظة مراحل مماثلة في شفاء عظم إبسولوتل⁹.

حتى الآن ، تمت دراسة كسور axolotl في نظام غير مستقر ، حيث يتم قطع العظام ببساطة بمقص استئصال القزحية. تم إنشاء الكسور الكبيرة في zeugopod ، حيث يتم إجراء قطع العظم على إحدى العظام ، في حين أن الآخر بمثابة دعم^10,11. في المقابل ، تتم دراسة الكسور بشكل روتيني في الثدييات ، بما في ذلك الجرذان والفئران ، باستخدام أنظمة تثبيت موثوقة ، مثل دبوس داخل النخاع وألواح محاذاة العظام ، للتحكم في حجم الكسر وضمان محاذاة العظام.

وبالتالي ، تهدف الطريقة إلى ضمان تثبيت مستقر وموحد لعظم الفخذ قبل قطع العظم. من أجل جعل دراسات axolotl أكثر قابلية للمقارنة مع الثدييات ، بما في ذلك الفئران والبشر ، تم النظر في تثبيت دبوس داخل النخاع¹² ، ومثبت الصفيحة الخارجية^{13،14 ،} وتثبيت لوحة محاذاة العظام الداخلية^15،16،17. وقد تبين أن هذا الأخير يضمن التثبيت المناسب للعظام ويسمح بإنشاء فجوة بحجم معين باستخدام قطع أو قطعتين بمنشار Gigly بقطر معين. نظرا لأن قنافذ البحر تمثل اليرقات المائية ل Ambystoma mexicanum ، فقد يكون المثبت الخارجي قد تسبب في مضاعفات ما بعد الجراحة بسبب الجرح المفتوح والتلامس مع الماء. نظرا لأن قنافذ البحر لا تطور مراكز تعظم ثانوية حتى وقت متأخر جدا من تطورها (20 عاما¹⁸) ، وبالتالي قد لا يتم منع الظفر القياسي داخل النخاع المستخدم في الفئران من ثقب المشاش ، فقد تم اتخاذ قرار بتطبيق طريقة تثبيت الصفائح الداخلية على قنافذ البحر الكبيرة. في قنافذ البحر الكبيرة ، يشبه حجم عظم الفخذ ودرجة التعظم حجم الفأر البالغ ، مما يسمح بقطع العظم في منتصف الحجاب مع تثبيت صفيحة التيتانيوم¹.

يحدد حجم فجوة الكسر إلى حد كبير ديناميكيات الشفاء والنتيجة. على سبيل المثال ، في الفأر ، تلتئم الكسور المستقرة 0.25 مم في الغالب من خلال التعظم داخل الغشاء بسبب صغر حجمها واستقرارها الصلب. يشفى كسر 0.7 مم عن طريق التعظم داخل الغضروف ، مع تشكيل الكالس الغضروفي حول الكسر ؛ العيوب الكبيرة ، مثل العيوب الحرجة 3.5 مم لا تلتئم تماما ، وبالتالي يتم استخدامها لنمذجة كسر العظام غير الاتحاد¹⁶. في هذه الدراسة ، تم إنشاء بروتوكول تثبيت الصفيحة لعظم الفخذ قبل قطع العظم باستخدام مثال فجوة كسر 0.7 مم مع الهدف النهائي المتمثل في مقارنة شفاء عظم إبسولوتل بشفاء الفأر⁹.

بعد قطع العظم ، خضعت الكسور لعملية التعظم داخل الغضروف ، وإن كانت أبطأ من الفئران ، ربما بسبب نمط الحياة المائية ل axolotls ومعدلات انقسام الخلايا الأبطأ. في الطريقة المعروضة هنا ، يتم عرض قطع العظم بفجوة 0.7 مم مع تثبيت لوحة صلبة ؛ ومع ذلك ، من المحتمل أن تكون أحجام الفجوات الأخرى والمثبتات شبه المرنة ، وكذلك الألواح من مواد مختلفة ممكنة. بشكل عام ، يمكن استخدام الطريقة المعروضة هنا لتثبيت العظام القياسي وستكون مفيدة للدراسات التي تقارن تجديد أطراف قنفذ البحر بشفاء العظام أو دراسة التئام العظام في قنافذ البحر في ظل ظروف مختلفة لضمان تثبيت الكسر الموحد.

Protocol

تم تنفيذ الإجراء التالي بموافقة قاضي فيينا (GZ: MA 58-65248-2021-26). 5-8 سنوات ، ≥ 20 سم من طرف الخطم إلى الذيل (الخطم إلى طرف الذيل) تم استخدام قنافذ البحر الطويلة (Ambystoma mexicanum) لجراحة الكسور وبتر الأطراف. تم استخدام كل من الذكور والإناث في العمليات الجراحية. تم تربية Axolotls في معهد أبحاث مرفق علم الأمراض الجزيئي. تمت إدارة الألم وخطر العدوى باستخدام المسكنات والمضادات الحيوية المناسبة لضمان نتيجة ناجحة. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة في جدول المواد.

1. إعداد

1. استحم في محلول بنزوكائين 0.03٪ لمدة 15-20 دقيقة حتى يتم الوصول إلى التخدير الكامل ولا توجد حركة انعكاسية عند ملامسة الأطراف للملاقط.
2. ضع مع الجانب البطني لأسفل على مناشف ورقية مبللة مبللة بمحلول البنزوكائين بنسبة 0.03٪ وقم بتغطيته بمناشف ورقية مبللة بالبنزوكائين. جلد المائية ، مثل قنافذ البحر ، حساس للجفاف ، وبالتالي ، من الضروري تغطية سطح الجسم لمنع الجفاف وضمان التنفس الجلدي (الجلد).
3. قم بتمديد الطرف الخلفي ليتم تشغيله باستخدام ملقط حلقي. لا تستخدم كواشف التطهير ، مثل الإيثانول ، لأن جلد قنفذ البحر حساس للمواد الكيميائية ويسهل تهيجه. بدلا من ذلك ، استخدم 0.7x PBS (A-PBS) مع 50 وحدة / مل من البنسلين و 20 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين لتنظيف الطرف وبعد ذلك لري العظام عند النشر.
   ملاحظة: العدوى بشكل عام ليست مصدر قلق للعمليات الجراحية التي يتم إجراؤها على قنافذ البحر. ومع ذلك ، نظرا للطبيعة المائية لهذه والخيوط الموضوعة على سطح الجلد ، نوصي باستخدام المضادات الحيوية لمنع أي تلوث في موقع الجراحة.

2. الجراحة

ملاحظة: تعقيم جميع الأدوات الجراحية. طرق التعقيم الشائعة مثل التعقيم الحراري والتعقيم والغسيل بنسبة 70٪ من الإيثانول ، تليها إزالة شاملة لبقايا الكحول ، مناسبة لهذا الغرض. إذا كنت تعمل على متعددة ، فقم بتعقيم الأدوات بينهما باستخدام معقم حبة ساخنة أو 70٪ إيثانول.

1. قم بعمل شق طولي جانبي (1.5-2 سم) بمشرط فوق عظم الفخذ يمتد على الفخذ بالكامل في الطرف الخلفي العلوي. من أجل القيام بذلك ، جس العظم قبل قطع الجلد.
2. قم بإزاحة العضلات والأعصاب بعناية من موقع الجراحة دون قطع. استخدم ملقط منحني للقيام بذلك بكفاءة.
3. ضع ملقط منحني برفق تحت عظم الفخذ لفضحه للجراحة.
4. ضع لوحة تثبيت صلبة مقاس 7.75 مم ذات 4 ثقوب جنبا إلى جنب مع عظم الفخذ ، وتجنب لمس المفاصل ، وقم بتثبيتها في وضع محاذاة بالملقط.
5. استخدم أربعة مسامير من التيتانيوم مقاس 2 مم لربط العظم باللوحة.
   ملاحظة: تتميز البراغي المستخدمة في هذا البروتوكول بتصميم معقد وتتكون من 4 أجزاء: الجزء الرئيسي (سيتم تثبيته في العظم) ، ورأس المسمار (يسمح بإزالة البراغي واللوحة باستخدام مفتاح الربط المربع) ، والرقبة الأضيق (تستخدم كنقطة كسر بمجرد شد المسمار في العظم) ومقبض لولبي (يستخدم للربط بمفك البراغي وجهاز توجيه المنشار).
6. ترتيب مرفق المسمار مهم. ابدأ بالبراغي الداخلية أولا ، ثم المسمارين الخارجيين لضمان محاذاة اللوحة مع محور العظام. استخدم مثقابا يدويا لإنشاء الثقب الأول في العظم لسهولة إدخال المسمار ، متبوعا بوضع المسمار 1. حفر في منتصف محيط العظام لتجنب أرق العظام على جانب واحد ، مما قد يؤدي إلى كسر العظام التلقائي. استخدم الري مع 0.7x PBS + 1٪ قلم / بكتيريا أثناء الحفر. لا تقطع مقبض المسمار (المسمار)^{الأول (اختياري}: 1 ^و 2).
7. ضع جهاز توجيه المنشار على المسمار (المسمار)^{الأول (اختياري} : 1^و 2^الثاني ) وقم بمحاذاته مع العظم والصفيحة.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم توفير لوحة ومسامير وجهاز توجيه منشار ومنشار من قبل نفس الشركة المصنعة وتحسينها لتناسب بعضها البعض. يمكن أن يأتي جهاز توجيه المنشار بأحجام مختلفة ليكون متوافقا مع الألواح وأحجام المنشار المختلفة.
8. استخدم جهاز توجيه المنشار لحفر وإدخال بقية البراغي. تأكد من محاذاة اللوحة مع العظم. قطع مقابض البراغي.
9. ضع قطعة من الفيلم البلاستيكي (6-7 مم × 4-5 سم) ، معقمة بالمسح بنسبة 70٪ من الإيثانول ثم تعقيمها أو تعقيمها بالحرارة (140 درجة مئوية لمدة 4 ساعات) ، تحت عظم الفخذ لمنع تلف الأنسجة الرخوة أثناء عملية قطع العظم.
   ملاحظة: لهذا الغرض ، يمكن استخدام قطعة من الفيلم البلاستيكي ، وقطع كيس للتعقيم الحراري.
10. ضع منشار سلك Gigly بين العظام وفيلم الحماية.
11. قطع العظام باستخدام منشار سلك Gigly مقاس 0.66 مم ، مما أدى إلى قطع واحد 0.7 مم في عظم الفخذ. استخدم الري المستمر مع 0.7x PBS + 1٪ قلم / بكتيريا أثناء النشر لتقليل تلف الأنسجة والاحتكاك.
12. قم بإزالة المنشار ودليل المنشار واستخدم مفك البراغي لكسر المقابض اللولبية من البراغي.
13. قم بإزالة طبقة الحماية ، وقم بري موقع الجراحة باستخدام 0.7x PBS + 1٪ قلم / بكتيريا العقدية.
14. قم بتغطية الجزء العلوي من اللوحة والبراغي بشمع نحل العظام المعقم لحماية الجلد والعضلات من تهيج حواف البراغي.
15. ضع العضلات والجلد فوق شمع نحل العظام.
16. أغلق موقع الشق بخيط صناعي 7.0 (بولي بروبيلين / بولي إيثيلين) باستخدام غرز بسيطة متقطعة. يستخدم الخيط الصناعي لتقليل التلوث بالبكتيريا والفطريات المنقولة بالماء.

3. إدارة ما بعد الجراحة

1. لإيقاظ ، ضعه في خزان به ماء بركة اصطناعي عذب ، مكمل ب 50 وحدة / مل من البنسلين ، و 20 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، وبوتورفانول (0.5 مجم / لتر ماء).
2. مراقبة لبدء تحريك الخياشيم ، واتخاذ الخطوات ، والسباحة - عادة في غضون 1 ساعة بعد الجراحة.
3. احتفظ بالحيوان لمدة 3 أيام في ماء البركة الاصطناعي مع 50 وحدة / مل من البنسلين و 20 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين قبل إعادته إلى الخزان القابض. لضمان التسكين، يضاف بوتورفانول (0.5 ملغ/لتر ماء).
4. تأكد من بقاء الغرز في مكانها وحدوث التئام الجروح بشكل صحيح.

النتائج

تستغرق العملية الجراحية الموصوفة هنا (الشكل 1) ما بين 20 دقيقة و 30 دقيقة وتتطلب جراحا ومساعدا. اختياريا ، استخدم مجهر تشريح مجهر أو نظام عدسة مكبرة.

الشكل 1...

Discussion

تسمح الطريقة الموصوفة حاليا لتثبيت صفيحة عظم الفخذ وقطع العظم بتطبيقه في المائية ، مثل Ambystoma mexicanum (axolotl). تم استخدام هذه الطريقة الجراحية مؤخرا لمقارنة التئام الكسور وتجديد الأطراف في قنافذ البحر بشفاء الكسور في الفئران⁹. كما هو الحال في الفئران ، يمكن ت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.66 mm Gigly wire saw	RISystem	RIS.590.120
7.0 Optilene suture	Braun	C3090538
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	dilute to 0.03%  prior to using
Butorphanol (Butomidor 10 mg/mL)	Richter Pharma AG	-	dilute to 0.5 mg/L  prior to using
Drill bit 0.30 mm	RISystem	RIS.590.200
Dumont #5 Forceps - Standard/Inox	Fine Science Tools	11251-20
Hand drill	RISystem	RIS.390.130	better to have at least 3 pieces
Micro CT data analyzer	Bruker, Billerica, MA, USA	SkyScan NRecon software
Micro CT specimen scanner	Bruker, Billerica, MA, USA	SkyScan 1172
Moria MC31b Iris forceps - smooth, curved, 10 cm	Fine Science Tools	11373-12FST	2 pieces
MouseFix Drill-&Saw guide 1.75 mm, rigid	RISystem	RIS.301.102
MouseFix plate 4 hole, rigid	RISystem	RIS.401.110
MouseFix screw, L =2.00 mm	RISystem	RIS.401.100	need 4 per bone
Narrow Pattern Forceps	VWR	FSCI11002-12
penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
Ring forceps	Fine Science Tools	11103-09
scalpel #15	B Braun, Thermo Fischer Scientific	5518032
Square box wrench 0.50 mm	RISystem	RIS.590.111
Sterile bone wax, 2.5 g	Ethicon, Johnson & Johnson	W810
Student Fine Scissors - Straight/11.5cm	Fine Science Tools	91460-11