在墨西哥 Ambystoma 中使用钢板固定稳定股骨截骨术

摘要

提出了一种在成熟蝾螈中使用内板固定的股骨截骨手术方案。该程序可用于对水生两栖动物的肢体再生和骨折愈合进行比较研究。

摘要

蝾螈 （Ambystoma mexicanum） 是一种很有前途的再生医学模式生物，因为它具有再生丢失或受损器官（包括四肢、大脑、心脏、尾巴等）的非凡能力。对蝾螈的研究揭示了支配损伤后祖细胞活化和组织恢复的细胞和分子途径。这些知识可用于促进再生功能不全的损伤的愈合，例如骨不连。在当前的方案中，描述了使用内板固定系统的股骨截骨稳定。该程序适用于水生动物 （axolotl， Ambystoma mexicanum）。使用 ≥20 cm 吻尖到尾尖的蝾螈，股骨完全骨化，小鼠大小相当，特别注意板的定位和固定，以及术后护理。这种手术技术允许标准化和稳定的骨固定，可用于与蝾螈肢体再生的直接比较以及两栖动物和哺乳动物骨愈合的类似研究。

引言

蝾螈 （Ambystoma mexicanum） 是器官再生的重要模型，包括尾巴、脊髓、大脑、心脏、鳃和四肢 1,2,3,4,5。蝾螈肢体再生的详细研究揭示了细胞去分化的机制和在截肢部位形成干细胞库 blastema。由于 blastema 细胞能够重建所有缺失的肢体部分，包括有图案的骨骼 ^6,7，^蝾螈似乎是骨愈合研究的有吸引力的模式生物。最近，几项研究更多地关注蝾螈的骨骼生物学，描述了骨骼形态、细胞组成和骨化动力学。

在哺乳动物中发现，长骨的骨愈合过程 是通过 软骨内骨化发生的，包括几个阶段：血肿、肉芽组织和软愈伤组织形成，愈伤组织骨化成硬愈伤组织和编织骨，以及骨重塑⁸。最近的一项研究表明，在蝾螈骨愈合中可以观察到类似的阶段⁹。

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研究方案

以下程序经维也纳地方法官 （GZ： MA 58-65248-2021-26） 批准执行。5-8 岁，≥ 20 cm 的吻尖到尾尖 （鼻子到尾尖） 长螈 （Ambystoma mexicanum） 用于骨折手术和截肢。男性和女性均用于手术。蝾螈是在分子病理学研究所的设施中培育的。使用适当的镇痛药和抗生素控制疼痛和感染风险，以确保成功的结果。用于研究的试剂和设备列在 材料表中。

1. 动物准备

1. 将动物浸泡在 0.03% 苯佐卡因溶液中约 15-20 分钟，直到达到完全镇静，并且用镊子接触肢体时没有反射性运动。
2. 将动物腹侧朝下放在浸泡在 0.03% 苯佐卡因溶液中的湿纸巾上，并用浸泡过苯佐卡因的纸巾盖住。水生动物（如蝾螈）的皮肤对干燥很敏感，因此必须覆盖体表以防止脱水并确保皮肤（皮肤）呼吸。
3. 使用环形镊子伸展要操作的后肢。不要使用消毒试剂，如乙醇，因为蝾螈皮肤对化学物质敏感，容易刺激。相反，使用 0.7x PBS （A-PBS） 与 50 U/mL 青霉素和 20 μg/mL 链霉素清洁肢体，然后在锯切时进行骨冲洗。
   注意：对于对蝾螈进行的手术，感染通常不是问题。然而，由于这些动物的水生性质和皮肤表面的缝合线，我们建议使用抗生素以防止手术部位受到任何污染。
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讨论

目前描述的股骨板固定和截骨方法允许其应用于水生动物，例如 墨西哥 Ambystoma mexicanum （axolotl）。这种手术方法最近被用于比较蝾螈的骨折愈合和肢体再生与小鼠的骨折愈合⁹。与小鼠一样，可以使用自断螺钉将 4 孔固定板连接到骨骼上，并且可以使用 Gigly 锯来制造均匀大小为¹⁵ 的骨折。钢板固定有助于保持间隙尺寸并确保骨?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.66 mm Gigly wire saw	RISystem	RIS.590.120
7.0 Optilene suture	Braun	C3090538
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	dilute to 0.03%  prior to using
Butorphanol (Butomidor 10 mg/mL)	Richter Pharma AG	-	dilute to 0.5 mg/L  prior to using
Drill bit 0.30 mm	RISystem	RIS.590.200
Dumont #5 Forceps - Standard/Inox	Fine Science Tools	11251-20
Hand drill	RISystem	RIS.390.130	better to have at least 3 pieces
Micro CT data analyzer	Bruker, Billerica, MA, USA	SkyScan NRecon software
Micro CT specimen scanner	Bruker, Billerica, MA, USA	SkyScan 1172
Moria MC31b Iris forceps - smooth, curved, 10 cm	Fine Science Tools	11373-12FST	2 pieces
MouseFix Drill-&Saw guide 1.75 mm, rigid	RISystem	RIS.301.102
MouseFix plate 4 hole, rigid	RISystem	RIS.401.110
MouseFix screw, L =2.00 mm	RISystem	RIS.401.100	need 4 per bone
Narrow Pattern Forceps	VWR	FSCI11002-12
penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
Ring forceps	Fine Science Tools	11103-09
scalpel #15	B Braun, Thermo Fischer Scientific	5518032
Square box wrench 0.50 mm	RISystem	RIS.590.111
Sterile bone wax, 2.5 g	Ethicon, Johnson & Johnson	W810
Student Fine Scissors - Straight/11.5cm	Fine Science Tools	91460-11