Стабилизация остеотомии бедренной кости с фиксацией пластины при Ambystoma mexicanum

Резюме

Представлен протокол операции остеотомии бедренной кости с применением фиксации внутренней пластины у зрелых аксолотлей. Процедура может быть использована для проведения сравнительных исследований по регенерации конечностей и заживлению переломов у водных амфибий.

Аннотация

Аксолотль (Ambystoma mexicanum) является перспективным модельным организмом для регенеративной медицины благодаря своей замечательной способности регенерировать утраченные или поврежденные органы, включая конечности, мозг, сердце, хвост и другие. Исследования аксолотлей проливают свет на клеточные и молекулярные пути, управляющие активацией предшественников и восстановлением тканей после травмы. Эти знания могут быть применены для облегчения заживления травм, неспособных к регенерации, таких как несращение костей. В действующем протоколе описана стабилизация остеотомии бедренной кости с помощью системы фиксации внутренней пластины. Процедура была адаптирована для использования у водных животных (аксолотль, Ambystoma mexicanum). Использовались аксолотли длиной ≥20 см от рыла до кончика хвоста с полностью окостеневшими, сопоставимыми по размеру бедренными костями, при этом особое внимание уделялось позиционированию и фиксации пластин, а также послеоперационному уходу. Этот хирургический метод позволяет обеспечить стандартизированную и стабилизированную фиксацию кости и может быть полезен для прямого сравнения с регенерацией конечностей аксолотля и аналогичными исследованиями заживления костей у амфибий и млекопитающих.

Введение

Аксолотль (Ambystoma mexicanum) является важной моделью для регенерации органов, включая хвост, спинной мозг, головной мозг, сердце, жабры и конечности 1,2,3,4,5. Детальные исследования регенерации конечностей аксолотля выявили механизмы дедифференцировки клеток и формирования пула стволовых клеток – бластемы – в месте ампутации. Благодаря способности клеток бластамы реконструировать все отсутствующие части конечностей, включая узорчатый скелет ^6,7, аксолотль представляется привлекательным модельным организмом для исследований заживления костей. В последнее время несколько исследований были сосредоточены на биологии костей у аксолотлей, описывая морфологию скелета, клеточный состав и динамику окостенения.

У млекопитающих установлено, что процесс заживления костей в длинных костях происходит путем эндохондрального окостенения и состоит из нескольких стадий: гематома, грануляционная ткань и образование мягкой каллуса, окостенение мозоли в твердую мозоль и тканую кость, а также^{ремоделирование} кости8. Недавнее исследование показало, что подобные стадии могут наблюдаться при заживлении костей аксолотлей⁹.

До сих пор переломы аксолотлей изучались в нестабилизированной системе, при которой кость просто разрезается ножницами для иридэктомии. Большие переломы образовались в зеугоподе, где остеотомия выполняется на одной из костей, в то время как другая служит опорой^10,11. В отличие от этого, переломы обычно изучаются у млекопитающих, включая крыс и мышей, с использованием надежных систем фиксации, таких как интрамедуллярный штифт и пластины для выравнивания костей, для контроля размера перелома и обеспечения выравнивания костей.

Таким образом, метод направлен на обеспечение стабилизированной и равномерной фиксации бедренной кости аксолотля до остеотомии. Для того, чтобы сделать исследования аксолотлей более сопоставимыми с исследованиями млекопитающих, включая мышей и человека, рассматривали интрамедуллярный штифт¹², фиксатор внешней пластины^{13,14 и внутреннюю} костную выравнивающую пластину 15,16,17. Было показано, что последний обеспечивает правильную фиксацию кости и позволяет создать зазор определенного размера с помощью одного или двух разрезов пилой Gigly определенного диаметра. Поскольку аксолотли представляют собой водные личинки Ambystoma mexicanum, внешний фиксатор мог вызвать послеоперационные осложнения из-за открытой раны и контакта с водой. Поскольку у аксолотлей не развиваются вторичные центры окостенения даже на очень поздних стадиях их развития (20 лет и¹⁸), и, таким образом, стандартный интрамедуллярный гвоздь, используемый у мышей, не может предотвратить прокол эпифизов, было принято решение применить метод фиксации внутренней пластиной к большим аксолотлям. У крупных аксолотлей размер бедренной кости и степень окостенения напоминают таковые у взрослой мыши, что позволяет проводить среднедиафизарную остеотомию с фиксацией титановой пластиной¹.

Размер разрыва во многом определяет динамику заживления и результат. Например, у мышей стабилизированные переломы размером 0,25 мм заживают в основном за счет внутримембранозного окостенения из-за их малых размеров и жесткой стабилизации; перелом 0,7 мм заживает путем эндохондрального окостенения, с образованием хрящевой мозоли вокруг перелома; Большие дефекты, такие как дефекты критического размера 3,5 мм, не заживают полностью и поэтому используются для моделирования несращения перелома кости¹⁶. В этом исследовании был разработан протокол фиксации пластины бедренной кости аксолотля до остеотомии на примере разрыва 0,7 мм с конечной целью сравнения заживления кости аксолотля с заживлением кости у^мыши9.

После остеотомии переломы подверглись процессу эндохондрального окостенения, хотя и медленнее, чем у мышей, возможно, из-за водного образа жизни аксолотлей и более медленной скорости деления клеток. В представленном здесь методе показана остеотомия с зазором 0,7 мм с жесткой фиксацией пластины; Однако потенциально возможны другие размеры зазоров и полугибкие фиксаторы, а также пластины из разных материалов. В целом, представленный здесь метод может быть использован для стандартизированной фиксации кости и будет полезен для исследований, сравнивающих регенерацию конечностей аксолотлей с заживлением кости или изучения заживления костей у аксолотлей в различных условиях для обеспечения стандартизированной фиксации переломов.

протокол

Следующая процедура была выполнена с одобрения магистрата Вены (GZ: MA 58-65248-2021-26). В возрасте 5-8 лет, ≥ кончиком рыла до хвоста длиной 20 см (морда до кончика хвоста) длинные аксолотли (Ambystoma mexicanum) использовались для хирургии переломов и ампутаций. Для проведения операций использовались как мужчины, так и женщины. Аксолотли были выведены в учреждении НИИ молекулярной патологии. Боль и риск инфекций контролировались с помощью надлежащих анальгетиков и антибиотиков, чтобы обеспечить успешный исход. Реагенты и оборудование, использованные для исследования, перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка животных

1. Купать животное в 0,03% растворе бензокаина в течение примерно 15-20 мин до тех пор, пока не будет достигнута полная седация и не будет рефлекторного движения при касании конечностей пинцетом.
2. Поместите животное брюшной стороной вниз на влажные бумажные полотенца, смоченные в 0,03% растворе бензокаина, и накройте его бумажными полотенцами, пропитанными бензокаином. Кожа водных животных, таких как аксолотли, чувствительна к высыханию, поэтому важно покрывать поверхность тела, чтобы предотвратить обезвоживание и обеспечить кожное (кожное) дыхание.
3. Вытяните заднюю конечность для операции с помощью кольцевых щипцов. Не применяйте дезинфицирующие реагенты, такие как этанол, так как кожа аксолотля чувствительна к химическим веществам и легко раздражается. Вместо этого используйте 0,7x PBS (A-PBS) с 50 Ед/мл пенициллина и 20 мкг/мл стрептомицина для очистки конечности, а затем для орошения костей после пиления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инфекция, как правило, не является проблемой для операций, проводимых на аксолотлях. Тем не менее, из-за водного характера этих животных и наложения швов на поверхность кожи, мы рекомендуем использовать антибиотики для предотвращения любого загрязнения места операции.

2. Хирургия

ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте все хирургические инструменты. Для этой цели подходят распространенные методы стерилизации, такие как термическая стерилизация, автоклавирование и промывка в 70% этаноле с последующим тщательным удалением остатков алкоголя. Если вы работаете с несколькими животными, стерилизуйте инструменты между ними, используя стерилизатор с горячими шариками или 70% этанол.

1. Сделайте боковой продольный разрез (1,5-2 см) скальпелем над бедренной костью, охватывающий все бедро в верхней задней конечности. Для того чтобы сделать это, пальпируйте кость перед разрезанием кожи.
2. Аккуратно сместите мышцы и нервы с места операции, не разрезая. Используйте изогнутые щипцы, чтобы сделать это эффективно.
3. Аккуратно подложите изогнутые щипцы под бедренную кость, чтобы обнажить ее для операции.
4. Поместите жесткую фиксирующую пластину с 4 отверстиями диаметром 7,75 мм вместе с диафизом бедренной кости, избегая прикосновения к суставам, и закрепите ее в выровненном положении щипцами.
5. Используйте четыре титановых винта диаметром 2 мм, чтобы прикрепить кость к пластине.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Винты, используемые в этом протоколе, имеют сложную конструкцию и состоят из 4 частей: основная часть (будет ввинчена в кость), головка винта (позволяет удалить винты и пластину с помощью квадратного ключевого ключа), более узкая шейка (используется в качестве точки перелома после того, как винт затянут в кости) и винтовая ручка (используется для крепления к отвертке и направляющему устройству пилы).
6. Важен порядок крепления винтов. Начните сначала с внутренних винтов, а затем с двух внешних винтов, чтобы убедиться, что пластина совмещена с осью кости. Используйте ручное сверло, чтобы создать первое отверстие в кости для легкого введения винта, за которым следует установка^1-го винта. Сверлите в середине окружности кости, чтобы избежать более тонкой кости с одной стороны, что может привести к спонтанному перелому кости. Используйте орошение 0,7x PBS + 1% Pen/Strep во время бурения. Не ломайте ручку^1-го (по желанию:^1-го и^2-го) винта.
7. Наденьте направляющее устройство пилы на^1-й (опционально:^1-й и^2-й ) винт (винты) и совместите его с костью и пластиной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе пластина, винты, устройство для направления пилы и пила поставляются одним и тем же производителем и оптимизированы для подгонки друг к другу. Направляющее устройство пилы может быть разных размеров, чтобы быть совместимым с пластинами и размерами пилы.
8. С помощью направляющего устройства пилы просверлите и вставьте остальные винты. Обеспечьте выравнивание пластины с косточкой. Обломайте ручки саморезов.
9. Поместите под бедренную кость кусок полиэтиленовой пленки (6-7 мм на 4-5 см), стерилизованный путем протирания 70% этанолом, а затем автоклавный или термически стерилизованный (140 °C в течение 4 часов), чтобы предотвратить повреждение мягких тканей в процессе остеотомии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой цели можно использовать кусок полиэтиленовой пленки, отрезанный от пакета для термической стерилизации.
10. Поместите проволочную пилу Gigly между костью и защитной пленкой.
11. Разрежьте кость с помощью канатной пилы Gigly 0,66 мм, создав один разрез 0,7 мм в бедренной кости. Используйте постоянное орошение 0,7x PBS + 1% Pen/Strepping во время пиления, чтобы свести к минимуму повреждение тканей и трение.
12. Снимите пилу и направляющую пилы и с помощью отвертки отломите рукоятки винтов от винтов.
13. Снимите защитную пленку и орошите место операции 0,7x PBS + 1% Pen/Strep.
14. Покройте верхнюю часть пластины и шурупов стерильным костным пчелиным воском, чтобы защитить кожу и мышцы от раздражения краями винтов.
15. Поместите мышцы и кожу поверх костного пчелиного воска.
16. Закройте место разреза синтетическим (полипропиленовым/полиэтиленовым) швом 7.0 с помощью простых прерывистых швов. Синтетический шов используется для минимизации загрязнения бактериями и грибками, переносимыми водой.

3. Послеоперационное ведение

1. Чтобы разбудить животное, поместите его в резервуар с пресной искусственной прудовой водой, дополненной 50 ЕД/мл пенициллина, 20 мкг/мл стрептомицина и анальгетика Буторфанола (0,5 мг/л воды).
2. Наблюдайте, как животное начинает двигать жабрами, делать шаги и плавать - обычно в течение 1 часа после операции.
3. Держите животное в течение 3 дней в искусственной воде пруда с 50 ЕД/мл пенициллина и 20 мкг/мл стрептомицина, прежде чем вернуть его в резервуар для содержания. Чтобы обеспечить обезболивание, добавьте Буторфанол (0,5 мг/л воды).
4. Следите за тем, чтобы швы оставались на месте и происходило правильное заживление ран.

Результаты

Описанная здесь хирургическая процедура (Рисунок 1) длится от 20 до 30 минут и требует участия хирурга и ассистента. По желанию можно использовать бинокулярный диссекционный микроскоп или систему лупы.

Обсуждение

Описанный в настоящее время метод фиксации бедренной пластины и остеотомии позволяет применять его у водных животных, таких как Ambystoma mexicanum (аксолотль). Этот хирургический метод недавно был использован для сравнения заживления переломов и регенерации конечносте...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.66 mm Gigly wire saw	RISystem	RIS.590.120
7.0 Optilene suture	Braun	C3090538
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	dilute to 0.03%  prior to using
Butorphanol (Butomidor 10 mg/mL)	Richter Pharma AG	-	dilute to 0.5 mg/L  prior to using
Drill bit 0.30 mm	RISystem	RIS.590.200
Dumont #5 Forceps - Standard/Inox	Fine Science Tools	11251-20
Hand drill	RISystem	RIS.390.130	better to have at least 3 pieces
Micro CT data analyzer	Bruker, Billerica, MA, USA	SkyScan NRecon software
Micro CT specimen scanner	Bruker, Billerica, MA, USA	SkyScan 1172
Moria MC31b Iris forceps - smooth, curved, 10 cm	Fine Science Tools	11373-12FST	2 pieces
MouseFix Drill-&Saw guide 1.75 mm, rigid	RISystem	RIS.301.102
MouseFix plate 4 hole, rigid	RISystem	RIS.401.110
MouseFix screw, L =2.00 mm	RISystem	RIS.401.100	need 4 per bone
Narrow Pattern Forceps	VWR	FSCI11002-12
penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
Ring forceps	Fine Science Tools	11103-09
scalpel #15	B Braun, Thermo Fischer Scientific	5518032
Square box wrench 0.50 mm	RISystem	RIS.590.111
Sterile bone wax, 2.5 g	Ethicon, Johnson & Johnson	W810
Student Fine Scissors - Straight/11.5cm	Fine Science Tools	91460-11