قياس كثافة الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية في الفئران عبر الفصيصات

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا بسيطا واقتصاديا لإجراء تقدير غير متحيز لكثافة الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية لأنسجة رئة الفئران الكاملة باستخدام تلطيخ واحد من Isolectin B₄.

Abstract

يرتبط التناوب غير الطبيعي لتكوين الأوعية الدموية الرئوية بالخلل الوظيفي في الأوعية الدموية الدقيقة في الرئة ويرتبط ارتباطا وثيقا بسلامة جدار الأوعية الدموية وتنظيم تدفق الدم وتبادل الغازات. في نماذج الفئران ، تظهر فصوص الرئة اختلافات كبيرة في الحجم والشكل والموقع والأوعية الدموية ، ومع ذلك تفتقر الأساليب الحالية إلى مراعاة هذه الاختلافات عند تحديد كثافة الأوعية الدموية الدقيقة. يعيق هذا القيد الدراسة الشاملة للخلل الوظيفي في الأوعية الدموية الدقيقة في الرئة وإعادة التشكيل المحتملة لدوران الأوعية الدموية الدقيقة عبر الفصيصات المختلفة. يعالج بروتوكولنا هذه الفجوة من خلال استخدام طريقتين للتقسيم لتحديد تغيرات كثافة الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية ، والاستفادة من حجم وشكل وتوزيع فروع مجرى الهواء عبر فصوص مميزة في الفئران. ثم نستخدم تلطيخ Isolectin B₄ (IB₄) لتسمية الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الرئة على شرائح مختلفة ، متبوعا بتحليل كثافة الأوعية الدموية الدقيقة غير المتحيز باستخدام البرنامج المتاح مجانا ImageJ. تسلط النتائج المقدمة هنا الضوء على درجات متفاوتة من تغيرات كثافة الأوعية الدموية الدقيقة عبر فصيصات الرئة مع الشيخوخة ، ومقارنة الفئران الصغيرة والكبيرة يقدم هذا البروتوكول نهجا مباشرا وفعالا من حيث التكلفة للقياس الكمي غير المتحيز لكثافة الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية ، مما يسهل البحث في كل من الجوانب الفسيولوجية والمرضية للأوعية الدموية الدقيقة للرئة.

Introduction

الخلايا البطانية (ECs) هي نوع خاص من الخلايا الموجودة على البطانة الداخلية للأوعية الدموية ، وتغطي الشجرة الشريانية والوريدية بأكملها وتلعب دورا مهما في الحفاظ على استقرار الأوعية الدموية والأعضاء¹. الرئتان هي أعضاء عالية الأوعية الدموية وتلعب أدوارا فسيولوجية ومرضية أساسية في الرئتين ، مثل تكوين جدار الأوعية الدموية ، وتنظيم تدفق الدم ، وتسهيل تبادل الغازات ، وتعديل الاستجابات الالتهابية ، والتحكم في نشاط الصفائح الدموية ، وإفراز المواد التنظيمية المشاركة في نمو الأوعية الدموية ، وإصلاح والحفاظ على توازن التخثر.

الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة للرئة (L....

Protocol

تم إجراء جميع التجارب وفقا للإرشادات الأخلاقية للجنة أبحاث بجامعة سيتشوان (رقم K2023023).

1. تحضير أقسام البارافين لفصوص الرئة في الفئران

1. الحصول على أنسجة الرئة من الفأر.
   1. اختر ذكور C57Bl / 6 الفئران في 6 أسابيع و 16 شهرا لتقييم كثافة الأوعية الدموية الدقيقة في رئتي الفئران عبر مختلف الفئات العمرية.
   2. يجب تطبيق 100 ملغ/كغ من البنتوباربيتال الصوديوم عن طريق الحقن داخل الصفاق في الفئران. القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم بعد التخدير. افتح تجويف الصدر واحصل على أنسجة الرئة.
2. تحضير أقسام البارافين.
   1. قم بإصلاح الأنسجة عن طريق وضعها في ....

النتائج

للتمييز بين الآفات في القصبات الهوائية الرئيسية وفروع مجرى الهواء الصغيرة ، من الضروري التأكد من ملاحظة البنية المستمرة للآفات في هذين النوعين من الشعب الهوائية. يمكن تحقيق ذلك باتباع إجراءات القطع والتضمين الموضحة في الشكل 1. بالنظر إلى العديد من فصوص ?.......

Discussion

تحمل دراسة كثافة الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية آثارا مهمة على فهم العمليات الفسيولوجية الرئوية وأيضا لتحديد المؤشرات الحيوية لأمراض الجهاز التنفسي. تتميز الدورة الدموية الرئوية بمساحة سطح شعرية واسعة تحيط بها طبقة رفيعة من الخلايا البطانية. يؤدي التجاور المتناغم ل?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole	MCE	HY-D0814	Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4	Thermo	I32450	Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer	Abcam	AB104135	Sample Fixation
Antigen Repair Fluid	Biosharp	BL151A	Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette	ActivFlo	39LC-500-1	Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064-50G	Sealing Solution
Cold Plate	Leica	HistoCore Arcadia H	Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven	Taisite	101-0AB	High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade	Leica	14035838383	Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds	Shitai	26155166627	Fixing Tissue Samples
Ethanol	Kelong	CAS 64-17-5	Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150	Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath	Leica	HI1220	Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens	Biosharp	BC004	Water-blocking Agent
Medical Forceps	Shanghai Medical Equipment	N/A	Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope	Nikon	Ts2	Imaging Device
Mounting Media	Jiangyuan	Tasteless	Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax	SCHLEDEN	80200-0014	Fixing Tissue Structure
PBS	Beyotime	C0221A	Wash Buffer
Pentobarbital Sodium	Beijing Chemical Reagent Company	Q/H82-F158-2002	Anesthetic
Rotary Microtome	Biobase	Bk-2258	Preparing Slices
Sterile Scissors	Shanghai Medical Equipment	N/A	segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel	Shanghai Medical Equipment	N/A	Cutting Tissue Samples
Triton	Solarbio	T8200	Permeabilization Solution
Wash-Free Slide	PLATINUM PRO	PRO-04	Fixing Samples for Staining
Xylene	SUM	XK13-011-00031	Tissue De-waxing Solution