قياس كثافة الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية في الفئران عبر الفصيصات

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا بسيطا واقتصاديا لإجراء تقدير غير متحيز لكثافة الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية لأنسجة رئة الفئران الكاملة باستخدام تلطيخ واحد من Isolectin B₄.

Abstract

يرتبط التناوب غير الطبيعي لتكوين الأوعية الدموية الرئوية بالخلل الوظيفي في الأوعية الدموية الدقيقة في الرئة ويرتبط ارتباطا وثيقا بسلامة جدار الأوعية الدموية وتنظيم تدفق الدم وتبادل الغازات. في نماذج الفئران ، تظهر فصوص الرئة اختلافات كبيرة في الحجم والشكل والموقع والأوعية الدموية ، ومع ذلك تفتقر الأساليب الحالية إلى مراعاة هذه الاختلافات عند تحديد كثافة الأوعية الدموية الدقيقة. يعيق هذا القيد الدراسة الشاملة للخلل الوظيفي في الأوعية الدموية الدقيقة في الرئة وإعادة التشكيل المحتملة لدوران الأوعية الدموية الدقيقة عبر الفصيصات المختلفة. يعالج بروتوكولنا هذه الفجوة من خلال استخدام طريقتين للتقسيم لتحديد تغيرات كثافة الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية ، والاستفادة من حجم وشكل وتوزيع فروع مجرى الهواء عبر فصوص مميزة في الفئران. ثم نستخدم تلطيخ Isolectin B₄ (IB₄) لتسمية الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الرئة على شرائح مختلفة ، متبوعا بتحليل كثافة الأوعية الدموية الدقيقة غير المتحيز باستخدام البرنامج المتاح مجانا ImageJ. تسلط النتائج المقدمة هنا الضوء على درجات متفاوتة من تغيرات كثافة الأوعية الدموية الدقيقة عبر فصيصات الرئة مع الشيخوخة ، ومقارنة الفئران الصغيرة والكبيرة يقدم هذا البروتوكول نهجا مباشرا وفعالا من حيث التكلفة للقياس الكمي غير المتحيز لكثافة الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية ، مما يسهل البحث في كل من الجوانب الفسيولوجية والمرضية للأوعية الدموية الدقيقة للرئة.

Introduction

الخلايا البطانية (ECs) هي نوع خاص من الخلايا الموجودة على البطانة الداخلية للأوعية الدموية ، وتغطي الشجرة الشريانية والوريدية بأكملها وتلعب دورا مهما في الحفاظ على استقرار الأوعية الدموية والأعضاء¹. الرئتان هي أعضاء عالية الأوعية الدموية وتلعب أدوارا فسيولوجية ومرضية أساسية في الرئتين ، مثل تكوين جدار الأوعية الدموية ، وتنظيم تدفق الدم ، وتسهيل تبادل الغازات ، وتعديل الاستجابات الالتهابية ، والتحكم في نشاط الصفائح الدموية ، وإفراز المواد التنظيمية المشاركة في نمو الأوعية الدموية ، وإصلاح والحفاظ على توازن التخثر.

الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة للرئة (LMECs) هي خلايا بطانية محددة للأنسجة الرئوية ، خاصة في الأوعية الدموية الدقيقة (الشعيرات الدموية) في الرئتين ، مما يميزها عن الخلايا البطانية الشريانية والوريدية الأكثر عمومية في الرئتين. هذه الخلايا لها وظائف مختلفة ، بما في ذلك تنظيم قوة الأوعية الدموية ، والتحكم في نفاذية الأوعية الدموية ، والمشاركة في تنظيم الاستجابات الالتهابية ، وتنظيم تكوين الجلطة. يلعبون دورا مهما في الدورة الدموية الرئوية ، وتنظيم تبادل الغازات ونقل العناصر الغذائية ، ويشاركون في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية المتعلقة بالرئتين ، ومن المحتمل أن تكون للشيخوخة². علاوة على ذلك ، يرتبط التناوب غير الطبيعي لتكوين الأوعية الدموية الرئوية بخلل الأوعية الدموية الدقيقة في الرئة³. باستخدام علامة الخلايا البطانية التقليدية CD31 والتوطين المكاني (على وجه التحديد ، المناطق الطرفية للرئتين) ، لاحظت Larissa L. et al. انخفاضا كبيرا في كثافة الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الفئران المسنة (18 شهرا) مقارنة بنظرائهم الأصغر سنا (4 أشهر) ⁴. في سياق علم الأمراض الرئوية المرتبط بالربو ، أظهر ماكوتو إتش وآخرون زيادة كبيرة في تحريض الأوعية الدموية في عينات خزعة الشعب الهوائية الملطخة بمضادات الكولاجين الوريدي من مرضى الربو مقارنة بالأشخاص الضابطين⁵. في الآونة الأخيرة ، من خلال إدخال تقنيات الإرسال والفحص المجهري الإلكتروني ، أبلغ Maximilian A. et al. عن زيادة ملحوظة في الكثافة العددية للسمات المتعلقة بتكوين الأوعية الدموية في المرضى الذين ماتوا بسبب Covid-19 أو الأنفلونزا A (H1N1) ⁶. من الواضح أن تكوين الأوعية الدموية الدقيقة غير الطبيعي مرتبط بالخلل الرئوي. ومع ذلك ، لا توجد حاليا طريقة بسيطة واقتصادية متاحة لقياس التغيرات في كثافة الأوعية الدموية الدقيقة.

في نماذج الفئران ، يتم تقسيم الرئتين تقليديا إلى خمسة فصوص متميزة: الجمجمة اليمنى ، والوسطى اليمنى ، والذيلية اليمنى ، والقحفية اليسرى ، والذيلية اليسرى. يظهر كل فص خصائص فريدة من حيث الحجم والشكل والموقع والأوعية الدموية المحتملة ، مما يساهم في التبادل الفعال للغازات والتنظيم التآزري المحتمل للدورة الرئوية. ومع ذلك ، على حد علمنا ، لا توجد منهجيات تفسر الاختلافات بين فصوص الرئة هذه عند التحقيق في تغيرات الأوعية الدموية الدقيقة في الرئة.

تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة لتقسيم الفصيصات في الفئران ، باستخدام IB₄ ، وهي علامة محددة جيدا للخلايا البطانية الدقيقة للرئة⁷ ، للتقييم الكمي غير المتحيز لكثافة الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية. يعالج هذا النهج المبتكر الحاجة إلى فهم أكثر شمولا لتغيرات الأوعية الدموية الدقيقة في رئتي الفئران من خلال النظر في الخصائص المميزة للفصوص الفردية للفئران. كدليل ، في الفئران المتقدمة في السن ، انخفاض كبير في الرئة
لوحظت كثافة الأوعية الدموية الدقيقة على وجه التحديد داخل كل من الفص الذيلي والفص الأيسر. يؤكد البروتوكول على أهمية دمج التحليلات الخاصة بالفص في تحقيقات التغيرات في مشهد الأوعية الدموية الدقيقة لرئتي الفئران. والجدير بالذكر أن هذه الطريقة توفر مراجع بحثية قيمة للباحثين الذين يسعون إلى فهم شامل لكل من التطور الفسيولوجي والمرضي لتطورات الرئة والآفات ، والتي تمتد إلى ما هو أبعد من تكوين الأوعية.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب وفقا للإرشادات الأخلاقية للجنة أبحاث بجامعة سيتشوان (رقم K2023023).

1. تحضير أقسام البارافين لفصوص الرئة في الفئران

1. الحصول على أنسجة الرئة من الفأر.
   1. اختر ذكور C57Bl / 6 الفئران في 6 أسابيع و 16 شهرا لتقييم كثافة الأوعية الدموية الدقيقة في رئتي الفئران عبر مختلف الفئات العمرية.
   2. يجب تطبيق 100 ملغ/كغ من البنتوباربيتال الصوديوم عن طريق الحقن داخل الصفاق في الفئران. القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم بعد التخدير. افتح تجويف الصدر واحصل على أنسجة الرئة.
2. تحضير أقسام البارافين.
   1. قم بإصلاح الأنسجة عن طريق وضعها في محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ أي 10 أضعاف حجم الأنسجة للحفاظ على مورفولوجيتها وهيكلها ومنع التدهور.
      ملاحظة: تم تطوير طريقة جديدة حديثة لتضخيم الهواء أثناء تثبيت نضح الأوعية الدموية في رئتي الفئران. تم الإبلاغ عن هذه الطريقة للحفاظ على مورفولوجيا وموقع أفضل لمجرى الهواء والخلايا السنخية والخلالي ، مما يجعلها أكثر ملاءمة للدراسات النسيجية للرئة. يوصى بهذه الطريقة للمختبرات ذات المعدات والمواد الاستهلاكية المقابلة ذات الأدوات المصنوعة^{منزليا 8}.
   2. قطع فص الرئة لتحديد اتجاه التضمين (الشكل 1).
      1. بعد 3 ساعات من التثبيت ، افصل الفصوص الرئوية الخمسة (تحت الملاحظة المباشرة للعينين) وقم بتضمين الفصوص القحفية والوسطى والملحقة للرئة اليمنى بشكل منفصل ، مع توجيه الأقسام في اتجاه اتصال الفص الرأسي إلى الشعب الهوائية.
      2. اقطع الفص الذيلية للرئة اليمنى إلى قطعتين بطول 4 مم من اليسار إلى اليمين في الاتجاه العمودي على اتصال فص الرئة والشعب الهوائية ، وقم بتضمين الشرائح في كتلة شمعية بحيث يكون السطح المقطوع متجها لأعلى.
      3. قم بعمل ثلاث جروح في فص الرئة الأيسر. قم بعمل القطع الأول بشكل عرضي فوق تقاطع الشعب الهوائية الرئيسي ، 2 مم أسفل الجزء العلوي. قم بعمل القطع الثاني بشكل عرضي فوق تقاطع الشعب الهوائية الرئيسي ، 5 مم أسفل الجزء العلوي. قم بعمل القطع الثالث في نهاية الفص ، 8 مم تحت الجزء العلوي. تخلص من القطعة العلوية من الأنسجة وقم بتغليف القطع الثلاث المتبقية في كتلة شمع بحيث يكون السطح المقطوع متجها لأعلى.
         ملاحظة: عند تضمين قطع رئة متعددة معا ، يمكن استخدام ورق مسح المجهر للف قبل وضعها في صندوق تضمين المناديل لمواصلة عملية الجفاف.
      4. أعد إصلاح الأنسجة في المثبت لمدة 24 ساعة.
   3. ضع كتلة المناديل في وعاء واشطفها تحت الماء المتدفق لمدة 15 دقيقة.
   4. ضع الأنسجة بالتتابع في المحاليل التالية: 65٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة ، 75٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة ، 85٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة ، 95٪ إيثانول I لمدة 60 دقيقة ، 95٪ إيثانول II لمدة 60 دقيقة ، الإيثانول المطلق I لمدة 60 دقيقة ، الإيثانول المطلق II لمدة 60 دقيقة ، 70٪ إيثانول لمدة 120 دقيقة ، 80٪ إيثانول لمدة 120 دقيقة ، 90٪ إيثانول لمدة 120 دقيقة ، 95٪ إيثانول لمدة 120 دقيقة ، الإيثانول المطلق الأول لمدة 120 دقيقة ، والإيثانول المطلق II لمدة 120 دقيقة.
   5. ضع الأنسجة في الزيلين الأول لمدة 30 دقيقة والزيلين الثاني لمدة 30 دقيقة.
   6. ضع المنديل في شمع ناعم أقل من 54 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، والشمع الصلب I عند 58 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، والشمع الصلب II عند 58 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   7. حدد حجم قالب مناسبا ، واملأه بكمية مناسبة من البارافين السائل ، واستخدم الملقط لوضع الأنسجة في إطار التضمين في وسط القالب في الاتجاه الصحيح. ضع العفن والأنسجة في منطقة التجميد في آلة التضمين واضغط برفق على الأنسجة باستخدام الملقط.
   8. عندما يبدأ البارافين في التبييض قليلا ، ضع إطار التضمين المكشوف بسرعة أعلى القالب وقم بإجراء حقن الشمع الثاني ، وإغلاق الثقوب الموجودة في الجزء السفلي من إطار التضمين. انقل القالب بالكامل إلى طاولة التجميد للتشكيل.
   9. بعد تثبيت كتلة الشمع على آلة التقطيع والكشف عن سطح القطع الأملس والمسطح من خلال التشذيب الخشن والناعم ، قم بتدوير كرنك عجلة الميكروتوم لقطع شرائح بسمك 4 ميكرومتر.
   10. ضع الأقسام التي تمت إزالتها بسلاسة على سطح الماء بترتيب تسلسلي. بمجرد تمديد الأقسام بالكامل ، افصل القطع المكسورة عند التقاطعات بين كل قسم.
   11. قم بإمالة شريحة زجاجية أسفل القسم ، وعند ملامسها ، ارفع الشريحة ببطء وبشكل متساو من سطح الماء بحركة رأسية. سوف تلتصق الأقسام بالشريحة الزجاجية.

2. تلطيخ التألق المناعي للكشف عن الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية

1. ضعي الشرائح المدمجة بالبارافين في فرن 65 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
2. ضع الشرائح على رف منزلق وقم بتنفيذ الخطوات التالية في برطمانات التلوين: اغمر الزيلين 1 ، والزيلين 2 ، والزيلين 3 لمدة 15 دقيقة لكل منهما ، متبوعا بالغمر في الزيلين / الإيثانول (1: 1) لمدة 5 دقائق ، 100٪ إيثانول # 1 ، 100٪ إيثانول # 2 ، 85٪ إيثانول ، 75٪ إيثانول ، وماء مقطر لمدة 5 دقائق لكل منهما.
3. قم بتخفيف محلول استرجاع مستضد سترات الصوديوم المعدل 50 ضعفا بالماء منزوع الأيونات. سخني الميكروويف على طاقة عالية حتى الغليان ، ثم ضعي الشريحة في مستخلص المستضد. اترك الشريحة تغلي في مستخلص المستضد لمدة 15 دقيقة ثم تبرد بشكل طبيعي إلى درجة حرارة الغرفة.
4. اغسل الشرائح مرتين باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما. تتخلل مع 0.25٪ تريتون مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما.
5. تطويق الأنسجة بقلم الكيمياء المناعية واحتضان ذلك مع 5٪ BSA في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة. اغسل الشرائح مرة واحدة باستخدام PBS لمدة 5 دقائق.
6. قم بإجراء تلطيخ Alexa-647 Fluor IB₄ و DAPI.
   1. احتفظ بالبكالوريا الدولية₄ على الجليد وقم بتخفيفه بنسبة 1:50 بنسبة 1٪ BSA. قم بإزالة الماء الزائد حول الدائرة ، وأضف 50-100 ميكرولتر من IB₄ المخفف إلى كل قسم من أقسام الأنسجة ، واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية (من هذه الخطوة فصاعدا ، قم بتنفيذ جميع الإجراءات في الظلام).
   2. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منها. تتخلل مع 0.25٪ تريتون لمدة 10 دقائق.
7. قم بتخفيف DAPI (10 ميكروغرام / مل) باستخدام PBS بنسبة 1:10 وأضف 50-100 ميكرولتر إلى كل قسم من أقسام الأنسجة في RT لمدة 5 دقائق.
8. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منها.
9. ضع قطرة من وسيط التثبيت المضاد للبهتان على الشرائح ، وتجنب التعرض للضوء. جفف الشريحة في الهواء ، ثم راقب وتلتقط صورا للنواة والإشارات المستهدفة تحت المجهر الفلوري.

3. القياس الكمي لكثافة الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية

1. الحصول على الصور.
   1. راقب إشارات كثافة الأوعية الدموية الدقيقة للرئة وإشارات DAPI تحت هدف 10x لكل فص رئة في كل من الفئات العمرية الشابة والكبار.
   2. توحيد شدة مصدر الضوء ووقت التعرض لكل قناة بناء على نتائج المراقبة. التقط الصور ثنائية القناة التي تغطي كامل مساحة كل فص رئة. احفظ الصورة بتنسيق ND2 بقناتين (الشكل 2).
2. حدد القياس الكمي باستخدام الصورة J (الشكل التكميلي 1).
   1. قم بتشغيل برنامج ImageJ.
   2. قم باستيراد الصور المشار إليها إلى ImageJ ، ثم تابع تحميلها وتحديدها. قسم القنوات وفقا لذلك. قم بتحميل ملف بتنسيق ND2 لكل من قنوات DAPI و IB₄ .
   3. انتقل إلى تحليل > تعيين المقياس > تكوين معلمات الصورة على أنها 0.48 ميكرومتر/بكسل (اعتمادا على معلمات التصوير الفوتوغرافي) > > العام موافق.
   4. اضبط نفس نطاق العرض لضبط تأثير عرض الصورة. حدد صورة> اضبط > ضبط السطوع/التباين >. تعيين نطاق العرض لكل من القناتين على حدة ، IB₄: 0-10000 ؛ دابي: 0-20000.
   5. للتخلص من تأثير إشارات الخلفية ، تابع الخطوات التالية: انقر فوق عملية > الرياضيات > الطرح. طرح إشارة الخلفية بناء على قيم الإشارة التي تم اكتشافها بواسطة أداة Magic Wand في الخلفية ، IB₄: 3000 ؛ دابي: 300.
   6. لتحديد قيمة الحد التي تتوافق بشكل أفضل مع الصورة الأصلية، انتقل إلى صورة > تكرار.
   7. حدد كلا من الصورة الأصلية والمكررة > اكتب > 8 بت.
   8. حدد قيمة عتبة مناسبة لتحديد الأوعية الدموية الدقيقة للرئة بدقة. انقر فوق صورة > ضبط > عتبة > Intermodes (اختر العتبة الأكثر واقعية مقابل الرسم التخطيطي الأصلي) ، وحدد > الخلفية الداكنة > تطبيق.
   9. التخلص من الإشارات الإيجابية IB₄ من الأوعية الدموية الكبيرة في رئة الفأر، بما في ذلك الشرايين والأوردة: استخدم أداة Magic Wand لتحديد الأوعية الدموية الأكبر مقارنة بالصورة المكررة، ثم انقر فوق حذف (كرر ذلك حتى تتم إزالة الإشارات الإيجابية IB₄ في الخلايا البطانية للأوعية الدموية الكبيرة).
      ملاحظة: يتم الكشف عن إشارات تلطيخ IB₄ في الخلايا البطانية للشرايين والأوردة في رئة الفأر. لتحقيق فحص محدد لحدوث الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية ، يوصى بإزالة بؤر الإشارة بشكل موحد في الخلايا البطانية للأوعية الدموية الكبيرة.
   10. احسب عدد الإشارات المستهدفة، وانقر على تحليل > تعيين القياسات، وحدد المنطقة والحد إلى الحد وعرض التسمية. ثم حدد تحليل الجسيمات وتعيين الحجم: 0-infinity ؛ الدائرية: 0.00-1.00 ؛ عرض: أقنعة مفرطة. حدد تلخيص وانقر فوق موافق.
   11. اختر تلخيص النتائج > ملف > حفظ باسم.
3. تحليل البيانات والإحصاءات
   1. قم بمطابقة وتنظيم عدد البؤر الموجبة_{ل IB 4} والبؤر الموجبة DAPI ، على التوالي ، في نفس الصورة في جدول موحد.
   2. لخص العدد الإجمالي للبؤر الإيجابية_{ل IB 4} وبؤر DAPI الإيجابية لكل فص في الفئات الشابة أو العمرية المشار إليها.
      1. احسب النسبة المئوية ل IB4 البؤر الموجبة (٪) بقسمة العدد الإجمالي للبؤر الموجبة_{IB 4} على العدد الإجمالي لبؤر تلطيخ DAPI في كل فص على مجموعات مختلفة. اعرض عدد البؤر الإيجابية_{ل IB 4} ، وعدد بؤر تلطيخ DAPI ، والنسبة المئوية ل IB₄ البؤر الإيجابية (٪) كما هو موضح في الشكل 3 أ.
   3. قم بتشغيل برنامج تحليل البيانات وإنشاء جدول أعمدة جديد.
      ملاحظة: تم استخدام GraphPad Prism 9 هنا للتحليل الإحصائي.
   4. قم بتسميتها بالتتابع من المجموعة أ إلى المجموعة J باسم "الفص الجمجفي الصغير" ، "الفص الجمجفي القديم" ، "الفص الأوسط الصغير" ، "الفص الأوسط القديم" ، "الفص الذيلي الصغير" ، "الفص الذيلي القديم" ، "الفص الملحق الصغير" ، "الفص الملحق القديم" ، "الفص الأيسر الصغير" ، "الفص الأيسر القديم". بعد ذلك ، أدخل البؤر الموجبة_{المقابلة ل IB 4} (٪) في الجدول (الجدول التكميلي 1).
   5. استخدم اختبارات t غير المزدوجة للمقارنة الزوجية لتقييم الفروق الدلالية في المناطق المقابلة بين الفئتين العمريتين. قم بإجراء ما مجموعه خمس مقارنات لخمسة فصوص.
   6. قم بإنشاء رسم بياني لتصور النتائج (الشكل 3 ب). اختر مخططا شريطيا وقم بتضمين التحليل الإحصائي في الشكل.

النتائج

للتمييز بين الآفات في القصبات الهوائية الرئيسية وفروع مجرى الهواء الصغيرة ، من الضروري التأكد من ملاحظة البنية المستمرة للآفات في هذين النوعين من الشعب الهوائية. يمكن تحقيق ذلك باتباع إجراءات القطع والتضمين الموضحة في الشكل 1. بالنظر إلى العديد من فصوص ?...

Discussion

تحمل دراسة كثافة الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية آثارا مهمة على فهم العمليات الفسيولوجية الرئوية وأيضا لتحديد المؤشرات الحيوية لأمراض الجهاز التنفسي. تتميز الدورة الدموية الرئوية بمساحة سطح شعرية واسعة تحيط بها طبقة رفيعة من الخلايا البطانية. يؤدي التجاور المتناغم ل?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole	MCE	HY-D0814	Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4	Thermo	I32450	Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer	Abcam	AB104135	Sample Fixation
Antigen Repair Fluid	Biosharp	BL151A	Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette	ActivFlo	39LC-500-1	Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064-50G	Sealing Solution
Cold Plate	Leica	HistoCore Arcadia H	Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven	Taisite	101-0AB	High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade	Leica	14035838383	Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds	Shitai	26155166627	Fixing Tissue Samples
Ethanol	Kelong	CAS 64-17-5	Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150	Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath	Leica	HI1220	Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens	Biosharp	BC004	Water-blocking Agent
Medical Forceps	Shanghai Medical Equipment	N/A	Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope	Nikon	Ts2	Imaging Device
Mounting Media	Jiangyuan	Tasteless	Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax	SCHLEDEN	80200-0014	Fixing Tissue Structure
PBS	Beyotime	C0221A	Wash Buffer
Pentobarbital Sodium	Beijing Chemical Reagent Company	Q/H82-F158-2002	Anesthetic
Rotary Microtome	Biobase	Bk-2258	Preparing Slices
Sterile Scissors	Shanghai Medical Equipment	N/A	segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel	Shanghai Medical Equipment	N/A	Cutting Tissue Samples
Triton	Solarbio	T8200	Permeabilization Solution
Wash-Free Slide	PLATINUM PRO	PRO-04	Fixing Samples for Staining
Xylene	SUM	XK13-011-00031	Tissue De-waxing Solution