Cuantificación de la densidad microvascular pulmonar en ratones a través de los lóbulos

Resumen

Aquí, describimos un protocolo simple y económico para realizar una cuantificación no sesgada de la densidad microvascular pulmonar para tejido pulmonar de ratones enteros utilizando la tinción única de Isolectin B₄.

Resumen

La alternancia anormal de la angiogénesis pulmonar está relacionada con la disfunción microvascular pulmonar y está profundamente relacionada con la integridad de la pared vascular, la regulación del flujo sanguíneo y el intercambio gaseoso. En los modelos murinos, los lóbulos pulmonares exhiben diferencias significativas en tamaño, forma, ubicación y vascularización, sin embargo, los métodos existentes no tienen en cuenta estas variaciones al cuantificar la densidad microvascular. Esta limitación dificulta el estudio exhaustivo de la disfunción microvascular pulmonar y la potencial remodelación de la circulación de la microvasculatura a través de los diferentes lóbulos. Nuestro protocolo aborda esta brecha mediante el empleo de dos métodos de sección para cuantificar los cambios en la densidad microvascular pulmonar, aprovechando el tamaño, la forma y la distribución de las ramas de las vías respiratorias en distintos lóbulos en ratones. A continuación, utilizamos la tinción con isolectina B₄ (IB₄) para etiquetar las células endoteliales microvasculares pulmonares en diferentes cortes, seguido de un análisis de densidad microvascular insesgado utilizando el software ImageJ, disponible gratuitamente. Los resultados presentados aquí destacan diversos grados de cambios en la densidad microvascular en los lóbulos pulmonares con el envejecimiento, comparando ratones jóvenes y viejos. Este protocolo ofrece un enfoque sencillo y rentable para la cuantificación imparcial de la densidad microvascular pulmonar, lo que facilita la investigación sobre los aspectos fisiológicos y patológicos de la microvasculatura pulmonar.

Introducción

Las células endoteliales (CE) son un tipo especial de célula ubicada en el revestimiento interno de los vasos sanguíneos, que cubre todo el árbol arterial y venoso y desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la^{estabilidad de los} vasos sanguíneos y los órganos. Los pulmones son órganos altamente vascularizados y desempeñan funciones fisiológicas y patológicas esenciales en los pulmones, como la formación de la pared vascular, la regulación del flujo sanguíneo, la facilitación del intercambio de gases, la modulación de las respuestas inflamatorias, el control de la actividad plaqueta....

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo siguiendo las directrices éticas del Comité de Investigación Animal de la Universidad de Sichuan (Nº K2023023).

1. Preparación de secciones de parafina para lóbulos pulmonares de ratón

1. Adquirir tejido pulmonar del ratón.
   1. Elija ratones machos C57Bl/6 a las 6 semanas y 16 meses para evaluar la densidad microvascular en los pulmones de ratones en diferentes grupos de edad.
   2. Administrar 100 mg/kg de pentobarbital sódico mediante inyección intraperitoneal en ratones. Eutanasia de los ratones por luxación cervical después de la ....

Discusión

El estudio de la densidad microvascular pulmonar tiene implicaciones significativas para la comprensión de los procesos fisiológicos pulmonares y también para la definición de biomarcadores para enfermedades respiratorias. La circulación pulmonar cuenta con una extensa superficie capilar envuelta por una delgada capa de células endoteliales. La yuxtaposición armoniosa de estas células y las células epiteliales alveolares da lugar a una frágil membrana alveolar-capilar diseñada.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole	MCE	HY-D0814	Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4	Thermo	I32450	Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer	Abcam	AB104135	Sample Fixation
Antigen Repair Fluid	Biosharp	BL151A	Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette	ActivFlo	39LC-500-1	Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064-50G	Sealing Solution
Cold Plate	Leica	HistoCore Arcadia H	Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven	Taisite	101-0AB	High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade	Leica	14035838383	Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds	Shitai	26155166627	Fixing Tissue Samples
Ethanol	Kelong	CAS 64-17-5	Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150	Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath	Leica	HI1220	Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens	Biosharp	BC004	Water-blocking Agent
Medical Forceps	Shanghai Medical Equipment	N/A	Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope	Nikon	Ts2	Imaging Device
Mounting Media	Jiangyuan	Tasteless	Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax	SCHLEDEN	80200-0014	Fixing Tissue Structure
PBS	Beyotime	C0221A	Wash Buffer
Pentobarbital Sodium	Beijing Chemical Reagent Company	Q/H82-F158-2002	Anesthetic
Rotary Microtome	Biobase	Bk-2258	Preparing Slices
Sterile Scissors	Shanghai Medical Equipment	N/A	segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel	Shanghai Medical Equipment	N/A	Cutting Tissue Samples
Triton	Solarbio	T8200	Permeabilization Solution
Wash-Free Slide	PLATINUM PRO	PRO-04	Fixing Samples for Staining
Xylene	SUM	XK13-011-00031	Tissue De-waxing Solution