Cuantificación de la densidad microvascular pulmonar en ratones a través de los lóbulos

Resumen

Aquí, describimos un protocolo simple y económico para realizar una cuantificación no sesgada de la densidad microvascular pulmonar para tejido pulmonar de ratones enteros utilizando la tinción única de Isolectin B₄.

Resumen

La alternancia anormal de la angiogénesis pulmonar está relacionada con la disfunción microvascular pulmonar y está profundamente relacionada con la integridad de la pared vascular, la regulación del flujo sanguíneo y el intercambio gaseoso. En los modelos murinos, los lóbulos pulmonares exhiben diferencias significativas en tamaño, forma, ubicación y vascularización, sin embargo, los métodos existentes no tienen en cuenta estas variaciones al cuantificar la densidad microvascular. Esta limitación dificulta el estudio exhaustivo de la disfunción microvascular pulmonar y la potencial remodelación de la circulación de la microvasculatura a través de los diferentes lóbulos. Nuestro protocolo aborda esta brecha mediante el empleo de dos métodos de sección para cuantificar los cambios en la densidad microvascular pulmonar, aprovechando el tamaño, la forma y la distribución de las ramas de las vías respiratorias en distintos lóbulos en ratones. A continuación, utilizamos la tinción con isolectina B₄ (IB₄) para etiquetar las células endoteliales microvasculares pulmonares en diferentes cortes, seguido de un análisis de densidad microvascular insesgado utilizando el software ImageJ, disponible gratuitamente. Los resultados presentados aquí destacan diversos grados de cambios en la densidad microvascular en los lóbulos pulmonares con el envejecimiento, comparando ratones jóvenes y viejos. Este protocolo ofrece un enfoque sencillo y rentable para la cuantificación imparcial de la densidad microvascular pulmonar, lo que facilita la investigación sobre los aspectos fisiológicos y patológicos de la microvasculatura pulmonar.

Introducción

Las células endoteliales (CE) son un tipo especial de célula ubicada en el revestimiento interno de los vasos sanguíneos, que cubre todo el árbol arterial y venoso y desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la^{estabilidad de los} vasos sanguíneos y los órganos. Los pulmones son órganos altamente vascularizados y desempeñan funciones fisiológicas y patológicas esenciales en los pulmones, como la formación de la pared vascular, la regulación del flujo sanguíneo, la facilitación del intercambio de gases, la modulación de las respuestas inflamatorias, el control de la actividad plaquetaria, la secreción de sustancias reguladoras involucradas en el crecimiento vascular, la reparación y el mantenimiento del equilibrio de la coagulación.

Las células endoteliales microvasculares pulmonares (LMEC) son células endoteliales específicas del tejido pulmonar, particularmente en la microvasculatura (capilares) de los pulmones, lo que las distingue de las células endoteliales arteriales y venosas más generalizadas de los pulmones. Estas células tienen varias funciones, entre ellas la regulación del tono vascular, el control de la permeabilidad vascular, la participación en la regulación de las respuestas inflamatorias y la regulación de la formación de trombos. Desempeñan un papel crucial en la circulación pulmonar, regulando el intercambio gaseoso y el transporte de nutrientes, y están implicados en diversos procesos fisiológicos y patológicos relacionados con los pulmones, probablemente relacionados con el envejecimiento². Además, la alternancia anormal de la angiogénesis pulmonar se relaciona con la disfunción microvascular pulmonar³. Empleando el marcador convencional de células endoteliales CD31 y la localización espacial (específicamente, las regiones periféricas de los pulmones), Larissa L. et al. observaron una disminución significativa en la densidad de células endoteliales microvasculares en ratones envejecidos (18 meses de edad) en comparación con sus contrapartes más jóvenes (4 meses de edad)⁴. En el contexto de la patología pulmonar asociada al asma, Makoto H. et al. demostraron un aumento sustancial de la inducción de vasos en muestras de biopsia bronquial teñidas con anticolágeno IV de pacientes asmáticos en comparación con los sujetos control⁵. Recientemente, al introducir las técnicas de microscopía electrónica de transmisión y barrido, Maximilian A. et al. reportaron un notable aumento en la densidad numérica de características relacionadas con la angiogénesis intususceptiva y germinal en pacientes fallecidos por Covid-19 o Influenza A (H1N1)⁶. Evidentemente, la génesis microvascular anormal está relacionada con la disfunción pulmonar. Sin embargo, en la actualidad no existe un método sencillo y económico para cuantificar los cambios en la densidad microvascular.

En los modelos murinos, los pulmones están segmentados convencionalmente en cinco lóbulos distintos: craneal derecho, medio derecho, caudal derecho, craneal izquierdo y caudal izquierdo. Cada lóbulo exhibe características únicas en términos de tamaño, forma, ubicación y probable vascularización, lo que contribuye a un intercambio gaseoso eficiente y a una regulación potencialmente sinérgica de la circulación pulmonar. Sin embargo, hasta donde sabemos, ninguna metodología explica las diferencias entre estos lóbulos pulmonares cuando se investigan los cambios microvasculares pulmonares.

Este estudio presenta un nuevo método para seccionar lóbulos en ratones, utilizando IB₄, un marcador bien definido de células microendoteliales pulmonares⁷, para una evaluación cuantitativa no sesgada de la densidad microvascular pulmonar. Este enfoque innovador aborda la necesidad de una comprensión más completa de las alteraciones microvasculares en los pulmones murinos al considerar las propiedades distintivas de los lóbulos individuales de los ratones. Como demostración, en ratones envejecidos, se observa una reducción significativa de la
La densidad microvascular se observa específicamente tanto en el lóbulo caudal como en el lóbulo izquierdo. El protocolo subraya la importancia de integrar los análisis específicos de los lóbulos en las investigaciones de los cambios en el paisaje microvascular de los pulmones murinos. En particular, este método proporciona valiosas referencias de investigación para los investigadores que buscan una comprensión integral de la progresión fisiológica y patológica de los desarrollos y lesiones pulmonares, que se extienden más allá de la angiogénesis.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo siguiendo las directrices éticas del Comité de Investigación Animal de la Universidad de Sichuan (Nº K2023023).

1. Preparación de secciones de parafina para lóbulos pulmonares de ratón

1. Adquirir tejido pulmonar del ratón.
   1. Elija ratones machos C57Bl/6 a las 6 semanas y 16 meses para evaluar la densidad microvascular en los pulmones de ratones en diferentes grupos de edad.
   2. Administrar 100 mg/kg de pentobarbital sódico mediante inyección intraperitoneal en ratones. Eutanasia de los ratones por luxación cervical después de la anestesia. Abrir la cavidad torácica y obtener tejido pulmonar.
2. Prepara las secciones de parafina.
   1. Fije el tejido colocándolo en una solución de paraformaldehído al 4% que sea 10 veces el volumen del tejido para preservar su morfología y estructura y evitar la degradación.
      NOTA: Recientemente se desarrolló un nuevo método para inflar el aire durante la fijación de la perfusión vascular en los pulmones murinos. Se ha informado que este método conserva una mejor morfología y ubicación de las vías respiratorias, las células alveolares y el intersticio, lo que los hace más adecuados para los estudios histológicos pulmonares. Este método se recomienda para laboratorios con los equipos correspondientes y consumibles con instrumentos de fabricación propia⁸.
   2. Corte el lóbulo pulmonar para determinar la dirección de inclusión (Figura 1).
      1. Después de 3 h de fijación, separe los cinco lóbulos pulmonares (bajo observación directa de los ojos) e inserte los lóbulos craneal, medio y accesorio del pulmón derecho por separado, con secciones orientadas en la dirección de la conexión vertical del lóbulo al bronquio.
      2. Corte el lóbulo caudal del pulmón derecho en 2 piezas a 4 mm de izquierda a derecha en la dirección perpendicular a la conexión entre el lóbulo pulmonar y el bronquio, e incruste las rodajas en un bloque de cera con la superficie de corte hacia arriba.
      3. Haz tres incisiones en el lóbulo pulmonar izquierdo. Realice el primer corte transversalmente por encima de la unión bronquial principal, 2 mm por debajo de la parte superior. Realice el segundo corte transversalmente por encima de la unión bronquial principal, 5 mm por debajo de la parte superior. Haz el tercer corte al final del lóbulo, 8 mm por debajo de la parte superior. Deseche la pieza superior de tejido y encierre las tres piezas restantes en un bloque de cera con la superficie cortada hacia arriba.
         NOTA: Al incrustar varias piezas de pulmón juntas, se puede usar un papel de limpieza de microscopio para envolverlas antes de colocarlas en una caja de inclusión de tejido para continuar con el proceso de deshidratación.
      4. Vuelva a fijar el tejido en el fijador durante 24 h.
   3. Coloque el bloque de papel en un recipiente y enjuáguelo con agua corriente durante 15 minutos.
   4. Coloque secuencialmente el tejido en las siguientes soluciones: etanol al 65% durante 30 min, etanol al 75% durante 30 min, etanol al 85% durante 30 min, etanol al 95% I durante 60 min, etanol al 95% II durante 60 min, etanol absoluto I durante 60 min, etanol absoluto II durante 60 min, etanol al 70% durante 120 min, etanol al 80% durante 120 min, Etanol al 90% durante 120 min, etanol al 95% durante 120 min, etanol absoluto I durante 120 min y etanol absoluto II durante 120 min.
   5. Coloque el pañuelo en xileno I durante 30 min y xileno II durante 30 min.
   6. Coloque el pañuelo en cera blanda a menos de 54 °C durante 1 h, cera dura I a 58 °C durante 1 h y cera dura II a 58 °C durante 30 min.
   7. Seleccione un tamaño de molde adecuado, llénelo con una cantidad adecuada de parafina líquida y use pinzas para colocar el tejido en el marco de inclusión en el centro del molde en la dirección correcta. Coloque el molde y el tejido en el área de congelación de la máquina de inclusión y presione suavemente el tejido con pinzas.
   8. Cuando la parafina comience a blanquearse ligeramente, coloque rápidamente el marco de inclusión descubierto en la parte superior del molde y realice la segunda inyección de cera, sellando los orificios en la parte inferior del marco de incrustación. Transfiera todo el molde a la mesa de congelación para moldear.
   9. Después de fijar el bloque de cera en la cortadora y revelar la superficie de corte lisa y plana mediante un recorte áspero y fino, gire la manivela de la rueda del micrótomo para cortar rodajas con un grosor de 4 μm.
   10. Coloque suavemente las secciones eliminadas en la superficie del agua en orden secuencial. Una vez que las secciones estén completamente extendidas, separe las piezas rotas en las uniones entre cada sección.
   11. Incline un portaobjetos de vidrio debajo de la sección y, al contacto, levante lenta y uniformemente el portaobjetos de la superficie del agua con un movimiento vertical. Las secciones se adherirán al portaobjetos de vidrio.

2. Tinción de inmunofluorescencia para la detección de microvasculatura pulmonar

1. Coloque las rodajas incrustadas en parafina en un horno a 65 °C durante 60 min.
2. Coloque las rodajas en una rejilla deslizante y realice los siguientes pasos en frascos de tinción: sumerja xileno 1, xileno 2 y xileno 3 durante 15 minutos cada uno, seguido de inmersión en xileno/etanol (1:1) durante 5 minutos, etanol 100% #1, etanol 100% #2, etanol 85%, etanol 75% y agua destilada durante 5 minutos cada uno.
3. Diluir la solución de recuperación de antígeno de citrato de sodio modificada 50 veces con agua desionizada. Precaliente el microondas a alta potencia hasta que hierva, luego coloque el portaobjetos en el extracto de antígenos. Deje que el portaobjetos hierva en el extracto de antígenos durante 15 minutos y luego enfríe naturalmente a temperatura ambiente.
4. Lave los portaobjetos dos veces con PBS durante 5 minutos cada uno. Permeabilizar con Triton al 0,25% dos veces durante 10 min cada una.
5. Rodee el tejido con una pluma de inmunohistoquímica e incube con BSA al 5% a temperatura ambiente (RT) durante 1 h. Lave los portaobjetos una vez con PBS durante 5 minutos.
6. Realice la tinción de Alexa-647 Fluor conjugado IB₄ y DAPI.
   1. Mantenga el IB₄ en hielo y dilúyalo 1:50 con 1% de BSA. Retire el exceso de agua alrededor del círculo, agregue 50-100 μL del IB₄ diluido a cada sección de tejido e incube durante la noche a 4 °C (a partir de este paso, realice todos los procedimientos en la oscuridad).
   2. Lave los portaobjetos tres veces con PBS durante 5 minutos cada uno. Permeabilizar con Triton al 0,25% durante 10 min.
7. Diluir DAPI (10 μg/mL) con PBS en una proporción de 1:10 y añadir 50-100 μL a cada sección de tejido en RT durante 5 min.
8. Lave los portaobjetos tres veces con PBS durante 5 minutos cada uno.
9. Aplique una gota de medio de montaje antidecoloración a las diapositivas, evitando la exposición a la luz. Seque el portaobjetos al aire, luego observe y capture imágenes del núcleo y las señales objetivo bajo un microscopio de fluorescencia.

3. Cuantificación de la densidad microvascular pulmonar

1. Adquirir imágenes.
   1. Observar las señales de densidad microvascular pulmonar y las señales DAPI bajo un objetivo de 10x para cada lóbulo pulmonar en los grupos de edad joven y anciana.
   2. Estandarice la intensidad de la fuente de luz y el tiempo de exposición para cada canal en función de los resultados de la observación. Capture las imágenes de doble canal que cubren toda el área de cada lóbulo pulmonar. Guarde la imagen en formato ND2 con dos canales (Figura 2).
2. Cuantificar usando la Imagen J (Figura Suplementaria 1).
   1. Inicie el software ImageJ.
   2. Importe las imágenes indicadas a ImageJ, luego proceda a cargarlas y seleccionarlas. Divida los canales en consecuencia. Cargue un archivo en formato ND2 para los canales DAPI e IB₄ .
   3. Vaya a Analizar > Establecer escala > Configurar los parámetros de imagen como 0,48 μm/píxel (en función de los parámetros de fotografía) > Global > OK.
   4. Establezca el mismo rango de visualización para ajustar el efecto de presentación de la imagen. Seleccione Imagen> ajuste > Brillo/Contraste > conjunto. Establezca el rango de visualización para cada uno de los dos canales por separado, IB₄: 0-10000; DAPI: 0-20000.
   5. Para eliminar la influencia de las señales de fondo, proceda con los siguientes pasos: Haga clic en Procesar > Matemáticas > Restar; Reste la señal de fondo en función de los valores de señal detectados por la herramienta Varita mágica en el fondo, IB₄: 3000; DAPI:300.
   6. Para seleccionar el valor de umbral que mejor se alinee con la imagen original, vaya a Imagen > duplicar.
   7. Seleccione la imagen original y duplicada > Tipo > 8 bits.
   8. Seleccione un valor umbral adecuado para identificar con precisión la microvasculatura pulmonar. Haga clic en Imagen > Ajustar > Umbral > Intermodos (elija el umbral más realista en comparación con el diagrama original), marque > Fondo oscuro > Aplicar.
   9. Elimine las señales positivas de IB₄ de los vasos sanguíneos grandes del pulmón del ratón, incluidas las arterias y las venas: Utilice la herramienta Varita mágica para seleccionar vasos sanguíneos más grandes en comparación con la imagen duplicada y, a continuación, haga clic en Eliminar (repita hasta que se eliminen las señales positivas de IB₄ en las células endoteliales de los vasos sanguíneos más grandes).
      NOTA: Las señales de tinción IB₄ se detectan en las células endoteliales de las arterias y venas del pulmón del ratón. Para lograr un examen específico de las ocurrencias de microvasculatura pulmonar, se recomienda eliminar uniformemente los focos de señal en las células endoteliales de los vasos sanguíneos más grandes.
   10. Cuente el número de señales de destino, haga clic en Analizar > Establecer mediciones y marque Área, Límite de umbral y Mostrar etiqueta. A continuación, seleccione Analizar partículas y establezca Tamaño: 0-infinito; Circularidad: 0,00-1,00; Espectáculo: Exceso de mascarillas; marque Resumir y haga clic en Aceptar.
   11. Elija Resumir resultados > archivo > Guardar como.
3. Análisis de datos y estadísticas
   1. Haga coincidir y organice el número de focos positivos IB₄ y focos positivos DAPI, respectivamente, en la misma imagen en una tabla unificada.
   2. Resumir el número total de focos positivos para IB₄ y focos positivos para DAPI para cada lóbulo en grupos jóvenes o de edad indicados.
      1. Calcule el porcentaje de focos positivos para IB4 (%) dividiendo el número total de focos positivos para_IB4 entre el número total de focos de tinción DAPI en cada lóbulo por diferentes grupos. Presente el número de focos positivos para IB₄ , el número de focos de tinción DAPI y el porcentaje de focos positivos para IB₄ (%) como se muestra en la Figura 3A.
   3. Inicie el software de análisis de datos y cree una nueva tabla de columnas.
      NOTA: Aquí se utilizó GraphPad Prism 9 para el análisis estadístico.
   4. Nómbralos secuencialmente del Grupo A al Grupo J como "Lóbulo craneal joven", "Lóbulo craneal viejo", "Lóbulo medio joven", "Lóbulo medio viejo", "Lóbulo caudal joven", "Lóbulo caudal viejo", "Lóbulo accesorio joven", "Lóbulo accesorio viejo", "Lóbulo izquierdo joven", "Lóbulo izquierdo viejo". A continuación, introduzca los focos positivos IB₄ correspondientes (%) en la tabla (Tabla complementaria 1).
   5. Utilice pruebas t no apareadas para la comparación por pares para evaluar diferencias significativas en las regiones correspondientes entre los dos grupos de edad. Realice un total de cinco comparaciones para cinco lóbulos.
   6. Cree un gráfico para la visualización de resultados (Figura 3B). Opte por un gráfico de barras e incluya el análisis estadístico en la figura.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Para distinguir entre las lesiones en los bronquios principales y las pequeñas ramas de la vía aérea, es crucial asegurarse de que se observa la estructura continua de las lesiones en estos dos tipos de vías respiratorias. Esto se puede lograr siguiendo los procedimientos de corte e inclusión descritos en la Figura 1. Dados los numerosos lóbulos pulmonares de los ratones, que están orientados en varias direcciones y poseen una estructura similar a una...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

El estudio de la densidad microvascular pulmonar tiene implicaciones significativas para la comprensión de los procesos fisiológicos pulmonares y también para la definición de biomarcadores para enfermedades respiratorias. La circulación pulmonar cuenta con una extensa superficie capilar envuelta por una delgada capa de células endoteliales. La yuxtaposición armoniosa de estas células y las células epiteliales alveolares da lugar a una frágil membrana alveolar-capilar diseñada...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole	MCE	HY-D0814	Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4	Thermo	I32450	Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer	Abcam	AB104135	Sample Fixation
Antigen Repair Fluid	Biosharp	BL151A	Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette	ActivFlo	39LC-500-1	Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064-50G	Sealing Solution
Cold Plate	Leica	HistoCore Arcadia H	Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven	Taisite	101-0AB	High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade	Leica	14035838383	Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds	Shitai	26155166627	Fixing Tissue Samples
Ethanol	Kelong	CAS 64-17-5	Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150	Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath	Leica	HI1220	Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens	Biosharp	BC004	Water-blocking Agent
Medical Forceps	Shanghai Medical Equipment	N/A	Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope	Nikon	Ts2	Imaging Device
Mounting Media	Jiangyuan	Tasteless	Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax	SCHLEDEN	80200-0014	Fixing Tissue Structure
PBS	Beyotime	C0221A	Wash Buffer
Pentobarbital Sodium	Beijing Chemical Reagent Company	Q/H82-F158-2002	Anesthetic
Rotary Microtome	Biobase	Bk-2258	Preparing Slices
Sterile Scissors	Shanghai Medical Equipment	N/A	segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel	Shanghai Medical Equipment	N/A	Cutting Tissue Samples
Triton	Solarbio	T8200	Permeabilization Solution
Wash-Free Slide	PLATINUM PRO	PRO-04	Fixing Samples for Staining
Xylene	SUM	XK13-011-00031	Tissue De-waxing Solution