小葉全体のマウスにおける肺微小血管密度の定量化

要約

ここでは、イソレクチンB₄の単一染色を使用して、マウス全体の肺組織の肺微小血管密度の偏りのない定量を行うためのシンプルで経済的なプロトコルについて説明します。

要約

肺血管新生の異常な交代は、肺の微小血管機能障害に関連しており、血管壁の完全性、血流調節、およびガス交換に深く関連しています。マウスモデルでは、肺葉のサイズ、形状、位置、血管新生に大きな違いが見られますが、既存の方法では微小血管密度を定量化する際のこれらの変動が考慮されていません。この制限は、肺の微小血管機能障害の包括的な研究と、さまざまな小葉にわたる微小血管系循環の潜在的なリモデリングを妨げます。私たちのプロトコルは、マウスの異なる葉にわたる気道枝のサイズ、形状、および分布を活用して、肺微小血管密度の変化を定量化するために 2 つの切片化方法を採用することにより、このギャップに対処します。次に、イソレクチンB₄ (IB₄)染色を利用して、さまざまなスライス上の肺微小血管内皮細胞を標識し、その後、無料で入手できるソフトウェアImageJを使用して偏りのない微小血管密度分析を行います。ここで紹介した結果は、若齢マウスと老齢マウスを比較して、老化に伴う肺小葉全体の微小血管密度の変化の程度が異なることを強調しています。このプロトコルは、肺微小血管密度の偏りのない定量化のための簡単で費用対効果の高いアプローチを提供し、肺微小血管系の生理学的側面と病理学的側面の両方に関する研究を促進します。

概要

内皮細胞(EC)は、血管の内層に位置する特殊なタイプの細胞で、動脈と静脈の樹全体を覆い、血管と臓器の安定性を維持する上で重要な役割を果たし^{ています1。}肺は高度に血管新生された器官であり、血管壁の形成、血流の調節、ガス交換の促進、炎症反応の調節、血小板活性の制御、血管の成長に関与する調節物質の分泌、修復、凝固バランスの維持など、肺で重要な生理学的および病理学的役割を果たします。

肺微小血管内皮細胞(LMEC)は、肺組織、特に肺の微小血管系(毛細血管)にある特定の内皮細胞であり、肺のより一般化された動脈および静脈内皮細胞と区別されます。これらの細胞は、血管緊張の調節、血管透過性の制御、炎症反応の調節への参加、血栓形成の調節など、さまざまな機能を持っています。それらは、肺循環、ガス交換、栄養素の輸送の調節に重要な役割を果たし、肺に関連するさまざまな生理学的および病理学的プロセスに関与しています^。また、肺血管新生の異常な交代は、肺の微小血管機能障害と関連しています³。Larissa L.らは、従来の内皮細胞マーカーCD31と空間的局在化(具体的には肺の末梢領域)を用いて、老齢マウス(18ヶ月齢)の微小血管内皮細胞密度が若齢マウス(4....

プロトコル

すべての実験は、四川大学動物研究委員会(No K2023023)の倫理ガイドラインに従って行われました。

1. マウス肺葉のパラフィン切片の作製

1. マウスから肺組織を採取します。
   1. 6週目と16か月後の雄のC57Bl/6マウスを選択して、さまざまな年齢層のマウス肺の微小血管密度を評価します。
   2. マウスの腹腔内注射により、100 mg / kgのペントバルビタールナトリウムを投与します。.麻酔後に子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。胸腔を開き、肺組織を採取します。
2. パラフィン切片を調製します。
   1. 組織の体積の10倍の4%パラホルムアルデヒド溶液に組織を固定することで、組織の形態と構造を維持し、劣化を防ぎます。
      注:マウスの肺の血管灌流固定中に空気を膨らませる最近の新しい方法が開発されました。この方法は、気道、肺胞細胞、および間質の形態と位置をより良く保存すると報告されており、肺の組織学的研究により適しています。この方法は、対応する機器と自社製の機器⁸を備えた消耗品を備えたラボに推奨されます。
   2. 肺葉を切開して、埋め込み方向を決定します(図1

ディスカッション

肺微小血管密度の研究は、肺の生理学的プロセスの理解や呼吸器疾患のバイオマーカーの定義に重要な意味を持っています。肺循環は、内皮細胞の細い層に包まれた広範な毛細血管表面積を誇っています。これらの細胞と肺胞上皮細胞の調和のとれた並置は、ガス交換の複雑なプロセスを容易にするために特別に設計された壊れやすい肺胞毛細血管膜を生じさせます.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole	MCE	HY-D0814	Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4	Thermo	I32450	Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer	Abcam	AB104135	Sample Fixation
Antigen Repair Fluid	Biosharp	BL151A	Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette	ActivFlo	39LC-500-1	Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064-50G	Sealing Solution
Cold Plate	Leica	HistoCore Arcadia H	Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven	Taisite	101-0AB	High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade	Leica	14035838383	Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds	Shitai	26155166627	Fixing Tissue Samples
Ethanol	Kelong	CAS 64-17-5	Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150	Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath	Leica	HI1220	Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens	Biosharp	BC004	Water-blocking Agent
Medical Forceps	Shanghai Medical Equipment	N/A	Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope	Nikon	Ts2	Imaging Device
Mounting Media	Jiangyuan	Tasteless	Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax	SCHLEDEN	80200-0014	Fixing Tissue Structure
PBS	Beyotime	C0221A	Wash Buffer
Pentobarbital Sodium	Beijing Chemical Reagent Company	Q/H82-F158-2002	Anesthetic
Rotary Microtome	Biobase	Bk-2258	Preparing Slices
Sterile Scissors	Shanghai Medical Equipment	N/A	segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel	Shanghai Medical Equipment	N/A	Cutting Tissue Samples
Triton	Solarbio	T8200	Permeabilization Solution
Wash-Free Slide	PLATINUM PRO	PRO-04	Fixing Samples for Staining
Xylene	SUM	XK13-011-00031	Tissue De-waxing Solution