Quantificazione della densità microvascolare polmonare nei topi attraverso i lobuli

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo semplice ed economico per eseguire una quantificazione imparziale della densità microvascolare polmonare per il tessuto polmonare di topi interi utilizzando una singola colorazione dell'isolectina B₄.

Abstract

L'alternanza anomala dell'angiogenesi polmonare è correlata alla disfunzione microvascolare polmonare ed è profondamente legata all'integrità della parete vascolare, alla regolazione del flusso sanguigno e allo scambio gassoso. Nei modelli murini, i lobi polmonari mostrano differenze significative in termini di dimensioni, forma, posizione e vascolarizzazione, ma i metodi esistenti non tengono conto di queste variazioni nella quantificazione della densità microvascolare. Questa limitazione ostacola lo studio completo della disfunzione microvascolare polmonare e il potenziale rimodellamento della circolazione microvascolare tra diversi lobuli. Il nostro protocollo affronta questa lacuna impiegando due metodi di sezionamento per quantificare le variazioni della densità microvascolare polmonare, sfruttando le dimensioni, la forma e la distribuzione dei rami delle vie aeree tra i lobi distinti nei topi. Utilizziamo quindi la colorazione con isolectina B₄ (IB₄) per marcare le cellule endoteliali microvascolari polmonari su diverse fette, seguita da un'analisi della densità microvascolare imparziale utilizzando il software ImageJ disponibile gratuitamente. I risultati qui presentati evidenziano vari gradi di cambiamenti di densità microvascolare nei lobuli polmonari con l'invecchiamento, confrontando topi giovani e anziani. Questo protocollo offre un approccio semplice ed economico per la quantificazione imparziale della densità microvascolare polmonare, facilitando la ricerca sugli aspetti fisiologici e patologici della microvascolarizzazione polmonare.

Introduzione

Le cellule endoteliali (EC) sono un tipo speciale di cellule situate sul rivestimento interno dei vasi sanguigni, che coprono l'intero albero arterioso e venoso e svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento della stabilità dei vasi sanguigni e degli organi¹. I polmoni sono organi altamente vascolarizzati e svolgono ruoli fisiologici e patologici essenziali nei polmoni, come la formazione della parete vascolare, la regolazione del flusso sanguigno, la facilitazione dello scambio gassoso, la modulazione delle risposte infiammatorie, il controllo dell'attività piastrinica, la secrezione di so....

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti seguendo le linee guida etiche del Comitato per la ricerca sugli animali dell'Università del Sichuan (n. K2023023).

1. Preparazione di sezioni di paraffina per lobi polmonari di topo

1. Acquisire tessuto polmonare dal topo.
   1. Scegli topi maschi C57Bl/6 a 6 settimane e 16 mesi per valutare la densità microvascolare nei polmoni di topo in diversi gruppi di età.
   2. Somministrare 100 mg/kg di pentobarbital sodico tramite iniezione intraperitoneale nei topi. Eutanasia dei topi mediante lussazione cervicale dopo l'anestesia. Aprire la ....

Discussione

Lo studio della densità microvascolare polmonare ha implicazioni significative per la comprensione dei processi fisiologici polmonari e anche per la definizione di biomarcatori per le malattie respiratorie. La circolazione polmonare vanta un'estesa superficie capillare avvolta da un sottile strato di cellule endoteliali. L'armoniosa giustapposizione di queste cellule e delle cellule epiteliali alveolari dà origine a una fragile membrana alveolo-capillare specificamente progettata per f.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole	MCE	HY-D0814	Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4	Thermo	I32450	Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer	Abcam	AB104135	Sample Fixation
Antigen Repair Fluid	Biosharp	BL151A	Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette	ActivFlo	39LC-500-1	Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064-50G	Sealing Solution
Cold Plate	Leica	HistoCore Arcadia H	Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven	Taisite	101-0AB	High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade	Leica	14035838383	Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds	Shitai	26155166627	Fixing Tissue Samples
Ethanol	Kelong	CAS 64-17-5	Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150	Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath	Leica	HI1220	Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens	Biosharp	BC004	Water-blocking Agent
Medical Forceps	Shanghai Medical Equipment	N/A	Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope	Nikon	Ts2	Imaging Device
Mounting Media	Jiangyuan	Tasteless	Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax	SCHLEDEN	80200-0014	Fixing Tissue Structure
PBS	Beyotime	C0221A	Wash Buffer
Pentobarbital Sodium	Beijing Chemical Reagent Company	Q/H82-F158-2002	Anesthetic
Rotary Microtome	Biobase	Bk-2258	Preparing Slices
Sterile Scissors	Shanghai Medical Equipment	N/A	segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel	Shanghai Medical Equipment	N/A	Cutting Tissue Samples
Triton	Solarbio	T8200	Permeabilization Solution
Wash-Free Slide	PLATINUM PRO	PRO-04	Fixing Samples for Staining
Xylene	SUM	XK13-011-00031	Tissue De-waxing Solution