Количественная оценка плотности легочных микрососудов у мышей по долькам

Резюме

В данной работе мы описываем простой и экономичный протокол для выполнения объективного количественного определения микрососудистой плотности легочной ткани целых мышей с использованием однократного окрашивания изолектина B₄.

Аннотация

Аномальное чередование ангиогенеза легких связано с микрососудистой дисфункцией легких и глубоко связано с целостностью сосудистой стенки, регуляцией кровотока и газообменом. В мышиных моделях доли легких демонстрируют значительные различия в размере, форме, расположении и васкуляризации, однако существующие методы не учитывают эти вариации при количественной оценке микрососудистой плотности. Это ограничение препятствует всестороннему изучению микрососудистой дисфункции легких и потенциальному ремоделированию циркуляции микроциркуляторного русла в различных дольках. Наш протокол устраняет этот пробел за счет использования двух методов секционирования для количественной оценки изменений плотности легочных микрососудов, используя размер, форму и распределение ветвей дыхательных путей по различным долям у мышей. Затем мы используем окрашивание изолектином B₄ (IB₄) для мечения микрососудистых эндотелиальных клеток легких на различных срезах с последующим несмещенным анализом микрососудистой плотности с использованием свободно доступного программного обеспечения ImageJ. Представленные здесь результаты подчеркивают различную степень изменения плотности микрососудов в дольках легких с возрастом, сравнивая молодых и старых мышей. Этот протокол предлагает простой и экономически эффективный подход к объективной количественной оценке микрососудистой плотности легких, облегчая исследования как физиологических, так и патологических аспектов микроциркуляторного русла легких.

Введение

Эндотелиальные клетки (ЭК) – это особый тип клеток, расположенных на внутренней оболочке кровеносных сосудов, охватывающих все артериальное и венозное дерево и играющих решающую роль в поддержании стабильности кровеносных сосудов и органов¹. Легкие являются сильно васкуляризированными органами и играют важную физиологическую и патологическую роль в легких, такие как формирование сосудистой стенки, регулирование кровотока, облегчение газообмена, модуляция воспалительных реакций, контроль активности тромбоцитов, секреция регуляторных веществ, участвующих в росте сосудов, восстановлении и поддержании баланса свертываемости.

Микрососудистые эндотелиальные клетки легких (LMEC) являются специфическими эндотелиальными клетками легочной ткани, в частности в микроциркуляторном русле (капиллярах) легких, что отличает их от более генерализованных артериальных и венозных эндотелиальных клеток в легких. Эти клетки выполняют различные функции, в том числе регулируют тонус сосудов, контролируют проницаемость сосудов, участвуют в регуляции воспалительных реакций и регулируют образование тромбов. Они играют решающую роль в легочном кровообращении, регулируя газообмен и транспорт питательных веществ, а также участвуют в различных физиологических и патологических процессах, связанных с легкими, что вероятно для старения². Более того, аномальное чередование ангиогенеза легких связано с микрососудистой дисфункцией легких³. Используя обычный маркер эндотелиальных клеток CD31 и пространственную локализацию (в частности, периферические области легких), Larissa L. et al. наблюдали значительное снижение плотности микрососудистых эндотелиальных клеток у пожилых мышей (18 месяцев) по сравнению с их более молодыми коллегами (4 месяца)⁴. В контексте легочной патологии, ассоциированной с астмой, Makoto H. et al. продемонстрировали значительное увеличение индукции сосудов в образцах бронхиальной биопсии, окрашенных антиколлагеновым IV, у пациентов с астмой по сравнению с контрольной группой⁵. Недавно, внедрив методы просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии, Максимилиан А. и др. сообщили о заметном увеличении численной плотности признаков, связанных с инвагинтивным и прорастающим ангиогенезом у пациентов, умерших от Covid-19 или гриппа A (H1N1)⁶. По-видимому, аномальный микрососудистый генез связан с легочной дисфункцией. Тем не менее, в настоящее время не существует простого и экономичного метода количественной оценки изменений микрососудистой плотности.

В мышиных моделях легкие обычно разделены на пять отдельных долей: правая черепная, правая средняя, правая каудальная, левая черепная и левая каудальная. Каждая доля обладает уникальными характеристиками с точки зрения размера, формы, расположения и вероятной васкуляризации, способствуя эффективному газообмену и потенциально синергетической регуляции легочного кровообращения. Однако, насколько нам известно, ни одна методология не учитывает различия между этими долями легких при исследовании микрососудистых изменений легких.

В этом исследовании представлен новый метод секционирования долек у мышей с использованием IB₄, четко определенного маркера микроэндотелиальных клеток легких⁷, для объективной количественной оценки плотности легочных микрососудов. Этот инновационный подход направлен на удовлетворение потребности в более глубоком понимании микрососудистых изменений в легких мышей путем рассмотрения различных свойств отдельных долей мышей. В качестве демонстрации, у стареющих мышей отмечено значительное уменьшение легочного
Микрососудистая плотность наблюдается специфически как в каудальной доле, так и в левой доле. В протоколе подчеркивается важность интеграции долевого специфического анализа в исследования изменений микрососудистого ландшафта легких мышей. Примечательно, что этот метод предоставляет ценные исследовательские ссылки для исследователей, стремящихся к всестороннему пониманию как физиологического, так и патологического прогрессирования развития и поражения легких, выходящего за рамки ангиогенеза.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с этическими принципами Комитета по исследованиям животных Сычуаньского университета (No K2023023).

1. Подготовка парафиновых срезов для долей легких мышей

1. Приобретите легочную ткань у мыши.
   1. Выберите самцов мышей C57Bl/6 в возрасте 6 недель и 16 месяцев, чтобы оценить плотность микрососудов в легких мышей в разных возрастных группах.
   2. Вводите 100 мг/кг пентобарбитала натрия через внутрибрюшинную инъекцию мышам. Усыпляют мышей при вывихе шейки матки после наркоза. Вскрыть грудную полость и получить легочную ткань.
2. Подготовьте парафиновые срезы.
   1. Зафиксируйте ткань, поместив ее в 4% раствор параформальдегида, который в 10 раз больше объема ткани, чтобы сохранить ее морфологию и структуру и предотвратить деградацию.
      Примечание: Недавно был разработан новый метод надувания воздуха во время перфузионно-фиксации сосудов в легких мышей. Сообщается, что этот метод сохраняет лучшую морфологию и расположение дыхательных путей, альвеолярных клеток и интерстиция, что делает их более подходящими для гистологических исследований легких. Данный метод рекомендуется для лабораторий с соответствующим оборудованием и расходными материалами с приборами собственного производства⁸.
   2. Разрежьте долю легкого, чтобы определить направление залегания (рисунок 1).
      1. Через 3 ч фиксации отделить пять легочных долей (под непосредственным наблюдением глаз) и встроить черепную, среднюю и дочернюю доли правого легкого отдельно, с участками, ориентированными в направлении соединения вертикальной доли с бронхом.
      2. Разрежьте каудальную долю правого легкого на 2 части по 4 мм слева направо в направлении, перпендикулярном соединению доли легкого с бронхом, и заделайте срезы в восковой брусок поверхностью среза вверх.
      3. Сделайте три надреза в левой доле легкого. Первый срез сделайте поперечно над главным бронхиальным соединением, на 2 мм ниже верха. Второй надрез сделайте поперечно над главным бронхиальным соединением, на 5 мм ниже верха. Третий надрез сделайте на конце мочки, на 8 мм ниже верха. Выбросьте самый верхний кусок ткани и заключите оставшиеся три части в восковой блок поверхностью разреза вверх.
         ПРИМЕЧАНИЕ: При сборке нескольких частей легких вместе, можно использовать бумагу для протирки микроскопа, чтобы обернуть их, прежде чем поместить в коробку для встраивания тканей для продолжения процесса обезвоживания.
      4. Повторно зафиксировать ткань в фиксаторе на 24 часа.
   3. Поместите тканевый блок в емкость и промойте его под проточной водой в течение 15 минут.
   4. Последовательно поместить ткань в следующие растворы: 65% этанол на 30 мин, 75% этанол на 30 мин, 85% этанол на 30 мин, 95% этанол I на 60 мин, 95% этанол II на 60 мин, абсолютный этанол I на 60 мин, абсолютный этанол II на 60 мин, 70% этанол на 120 мин, 80% этанол на 120 мин, 90% этанол в течение 120 мин, 95% этанол в течение 120 мин, абсолютный этанол I в течение 120 мин и абсолютный этанол II в течение 120 мин.
   5. Поместите салфетку в ксилол I на 30 мин и ксилол II на 30 мин.
   6. Поместите салфетку в мягкий воск при температуре ниже 54 °C на 1 час, твердый воск I при температуре 58 °C на 1 час и твердый воск II при температуре 58 °C на 30 минут.
   7. Выберите подходящий размер формы, заполните ее соответствующим количеством жидкого парафина и с помощью щипцов расположите ткань в раме для встраивания в центр формы в правильном направлении. Поместите форму и ткань в морозильную зону закладочной машины и аккуратно прижмите ткань щипцами.
   8. Когда парафин начнет немного белеть, быстро поместите открытую закладную рамку поверх формы и выполните второй впрыск воска, запечатав отверстия в нижней части закладной рамы. Перенесите всю форму на стол для заморозки для формовки.
   9. Закрепив восковой блок на слайсере и обнажив гладкую и плоскую поверхность среза с помощью грубой и тонкой обрезки, поверните кривошип колеса микротома, чтобы нарезать ломтики толщиной 4 мкм.
   10. Плавно расположите снятые секции на поверхности воды в последовательном порядке. Как только секции будут полностью расширены, отделите сломанные части в местах соединения между каждой секцией.
   11. Наклоните стеклянную горку под секцией и при контакте медленно и равномерно поднимите горку от поверхности воды вертикальным движением. Секции будут прилипать к предметному стеклу.

2. Иммунофлюоресцентное окрашивание для выявления микроциркуляторного русла легких

1. Поместите залитые парафином ломтики в духовку при температуре 65 °C на 60 минут.
2. Поместите ломтики на решетку для слайдов и выполните следующие действия в банках для окрашивания: погрузите ксилол 1, ксилол 2 и ксилол 3 на 15 минут каждая, а затем погрузите в ксилол/этанол (1:1) на 5 минут, 100% этанол #1, 100% этанол #2, 85% этанол, 75% этанол и дистиллированную воду на 5 минут каждая.
3. Раствор для восстановления модифицированного цитрата натрия в 50 раз разбавить деионизированной водой. Разогрейте микроволновую печь на высокой мощности до закипания, затем поместите предметное стекло в экстракт антигена. Дайте предметному стеклу покипеть в экстракте антигена в течение 15 минут, а затем естественным образом охладите до комнатной температуры.
4. Дважды промойте слайды PBS по 5 минут каждая. Пропитайте 0,25% Тритоном дважды по 10 минут каждый.
5. Обведите ткань иммуногистохимическим шприцом и инкубируйте ее с 5% BSA при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч. Промойте предметные стекла один раз PBS в течение 5 минут.
6. Выполните окрашивание Alexa-647 Fluor конъюгированным IB₄ и DAPI.
   1. Держите IB₄ на льду и разбавьте его в соотношении 1:50 с 1% BSA. Удалите лишнюю воду по кругу, добавьте 50-100 мкл разведенного IB₄ на каждый участок ткани и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 °C (начиная с этого шага, выполняйте все процедуры в темноте).
   2. Вымойте слайды три раза PBS по 5 минут каждый. Пермеабилизируйте 0,25% Тритоном в течение 10 минут.
7. Разбавьте DAPI (10 мкг/мл) с PBS в соотношении 1:10 и добавьте по 50-100 мкл в каждый срез ткани в режиме RT в течение 5 мин.
8. Вымойте слайды три раза PBS по 5 минут каждый.
9. Нанесите каплю средства для крепления, препятствующего выцветанию, на слайды, избегая воздействия света. Высушите предметное стекло на воздухе, затем наблюдайте и захватывайте изображения ядра и целевых сигналов под флуоресцентным микроскопом.

3. Количественная оценка микрососудистой плотности легких

1. Получение изображений.
   1. Наблюдайте за сигналами микрососудистой плотности легких и сигналами DAPI с 10-кратным объективом для каждой доли легкого как в молодой, так и в пожилой возрастной группе.
   2. Стандартизируйте интенсивность источника света и время экспозиции для каждого канала на основе результатов наблюдения. Сделайте двухканальные изображения, охватывающие всю площадь каждой доли легкого. Сохраните изображение в формате ND2 с двумя каналами (рисунок 2).
2. Количественное определение с помощью изображения J (дополнительный рисунок 1).
   1. Запустите программу ImageJ.
   2. Импортируйте указанные изображения в ImageJ, затем перейдите к загрузке и выберите их. Разделите каналы соответствующим образом. Загрузите файл в формате ND2 для каналов DAPI и IB₄ .
   3. Перейдите к разделу «Анализ» > установите масштаб > настройте параметры изображения как 0,48 мкм/пиксель (в зависимости от параметров фотографии) > Global > OK.
   4. Установите тот же диапазон отображения, чтобы настроить эффект представления изображения. Выберите Изображение> Настроить > Яркость/Контрастность > Установите. Установите диапазон отображения для каждого из двух каналов отдельно, IB₄: 0-10000; DAPI: 0-20000.
   5. Чтобы устранить влияние фоновых сигналов, выполните следующие действия: нажмите «Обработать» > «Математика» > «Вычесть»; Вычитаем фоновый сигнал на основе значений сигнала, обнаруженных инструментом Magic Wand на фоне, IB₄:3000; ДАПИ:300.
   6. Чтобы выбрать пороговое значение, которое лучше всего соответствует исходному изображению, перейдите в раздел «Изображение > дублирование».
   7. Выберите как исходное, так и дубликат изображения > Тип > 8 бит.
   8. Выберите подходящее пороговое значение для точной идентификации микроциркуляторного русла легких. Нажмите на Изображение > Настроить > Порог > Межмодовые режимы (выберите наиболее реалистичный порог относительно исходной диаграммы), отметьте галочкой > Темный фон > Применить.
   9. Исключите положительные сигналы IB₄ из крупных кровеносных сосудов в легких мыши, включая артерии и вены: используйте инструмент «Волшебная палочка » для выбора более крупных кровеносных сосудов по сравнению с дублированным изображением, затем нажмите «Удалить» (повторяйте это до тех пор, пока положительные сигналы IB₄ в эндотелиальных клетках более крупных кровеносных сосудов не будут удалены).
      Сигналы окрашивания IB₄ обнаруживаются в эндотелиальных клетках артерий и вен легкого мыши. Для достижения специфического исследования явлений микроциркуляторного русла легких рекомендуется равномерно удалять сигнальные очаги в эндотелиальных клетках более крупных кровеносных сосудов.
   10. Подсчитайте количество целевых сигналов, нажмите «Анализ» > «Установить измерения» и отметьте «Область», «Предел порога» и «Отобразить метку». Затем выберите Analyze Particles и установите Размер: 0-infinity; Круговость: 0,00-1,00; Шоу: Чрезмерно Маски; Отметьте галочкой Подвести итоги и нажмите OK.
   11. Выберите «Суммировать результаты» > «Файл» > «Сохранить как».
3. Анализ данных и статистика
   1. Сопоставьте и организуйте количество положительных фокусов IB₄ и положительных фокусов DAPI соответственно на одном изображении в единую таблицу.
   2. Суммируйте общее количество положительных очагов IB₄ и положительных фокусов DAPI для каждой доли в указанных молодых или возрастных группах.
      1. Рассчитайте процент положительных фокусов IB4 (%), разделив общее количество положительных фокусов_IB4 на общее количество очагов окрашивания DAPI в каждой доле по разным группам. Представьте количество положительных очагов IB₄ , количество очагов окрашивания DAPI и процент положительных очагов IB₄ (%), как показано на рисунке 3A.
   3. Запустите программу для анализа данных и создайте новую таблицу столбцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для статистического анализа здесь использовался GraphPad Prism 9.
   4. Последовательно назовите их из группы А в группу J как «Молодая черепная доля», «Старая черепная доля», «Молодая средняя доля», «Старая средняя доля», «Молодая каудальная доля», «Старая каудальная доля», «Молодая добавочная доля», «Старая добавочная доля», «Молодая левая доля», «Старая левая доля». Затем введите соответствующие положительные фокусы IB₄ (%) в таблицу (Дополнительная таблица 1).
   5. Используйте непарные t-критерии для попарного сравнения, чтобы оценить значимые различия в соответствующих регионах между двумя возрастными группами. Проведите в общей сложности пять сравнений для пяти лепестков.
   6. Создание графика для визуализации результатов (рисунок 3B). Выберите столбчатую диаграмму и включите статистический анализ на рисунок.

Результаты

Чтобы различать поражения в основных бронхах и малых ветвях дыхательных путей, крайне важно убедиться в том, что наблюдается непрерывная структура поражений в этих двух типах дыхательных путей. Этого можно достичь, следуя процедурам резки и встраивания, описанным на ...

Обсуждение

Изучение плотности легочных микрососудов имеет важное значение для понимания легочных физиологических процессов, а также для определения биомаркера (маркеров) респираторных заболеваний. Легочное кровообращение имеет обширную площадь капиллярной поверхности, покр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole	MCE	HY-D0814	Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4	Thermo	I32450	Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer	Abcam	AB104135	Sample Fixation
Antigen Repair Fluid	Biosharp	BL151A	Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette	ActivFlo	39LC-500-1	Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064-50G	Sealing Solution
Cold Plate	Leica	HistoCore Arcadia H	Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven	Taisite	101-0AB	High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade	Leica	14035838383	Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds	Shitai	26155166627	Fixing Tissue Samples
Ethanol	Kelong	CAS 64-17-5	Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150	Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath	Leica	HI1220	Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens	Biosharp	BC004	Water-blocking Agent
Medical Forceps	Shanghai Medical Equipment	N/A	Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope	Nikon	Ts2	Imaging Device
Mounting Media	Jiangyuan	Tasteless	Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax	SCHLEDEN	80200-0014	Fixing Tissue Structure
PBS	Beyotime	C0221A	Wash Buffer
Pentobarbital Sodium	Beijing Chemical Reagent Company	Q/H82-F158-2002	Anesthetic
Rotary Microtome	Biobase	Bk-2258	Preparing Slices
Sterile Scissors	Shanghai Medical Equipment	N/A	segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel	Shanghai Medical Equipment	N/A	Cutting Tissue Samples
Triton	Solarbio	T8200	Permeabilization Solution
Wash-Free Slide	PLATINUM PRO	PRO-04	Fixing Samples for Staining
Xylene	SUM	XK13-011-00031	Tissue De-waxing Solution