Quantifizierung der pulmonalen mikrovaskulären Dichte bei Mäusen über Läppchen hinweg

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein einfaches und wirtschaftliches Protokoll zur unvoreingenommenen Quantifizierung der pulmonalen mikrovaskulären Dichte für das Lungengewebe ganzer Mäuse unter Verwendung einer Einzelfärbung von Isolectin B₄.

Zusammenfassung

Die abnormale Abwechslung der pulmonalen Angiogenese hängt mit der mikrovaskulären Dysfunktion der Lunge zusammen und ist eng mit der Integrität der Gefäßwand, der Regulierung des Blutflusses und dem Gasaustausch verbunden. In Mausmodellen weisen Lungenlappen signifikante Unterschiede in Größe, Form, Lage und Vaskularisation auf, doch bestehende Methoden berücksichtigen diese Unterschiede bei der Quantifizierung der mikrovaskulären Dichte nicht. Diese Einschränkung behindert die umfassende Untersuchung der mikrovaskulären Dysfunktion der Lunge und den möglichen Umbau der Mikrovaskulaturzirkulation über verschiedene Läppchen hinweg. Unser Protokoll schließt diese Lücke, indem es zwei Schnittmethoden anwendet, um Veränderungen der pulmonalen mikrovaskulären Dichte zu quantifizieren, wobei die Größe, Form und Verteilung der Atemwegsäste über verschiedene Lappen bei Mäusen genutzt werden. Anschließend verwenden wir die Isolectin B₄ (IB₄)-Färbung, um mikrovaskuläre Endothelzellen der Lunge auf verschiedenen Schichten zu markieren, gefolgt von einer unverzerrten mikrovaskulären Dichteanalyse mit der frei verfügbaren Software ImageJ. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen unterschiedliche Grade von mikrovaskulären Dichteänderungen in den Lungenläppchen mit zunehmendem Alter, wobei junge und alte Mäuse verglichen werden. Dieses Protokoll bietet einen unkomplizierten und kostengünstigen Ansatz für die unvoreingenommene Quantifizierung der mikrovaskulären Dichte der Lunge und erleichtert die Erforschung sowohl physiologischer als auch pathologischer Aspekte der Mikrovaskulatur der Lunge.

Einleitung

Endothelzellen (ECs) sind eine spezielle Art von Zellen, die sich auf der inneren Auskleidung von Blutgefäßen befinden, den gesamten Arterien- und Venenbaum bedecken und eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Stabilität von Blutgefäßen und Organen spielen¹. Die Lunge ist ein stark vaskularisiertes Organ und spielt wesentliche physiologische und pathologische Rollen in der Lunge, wie z. B. die Bildung der Gefäßwand, die Regulierung des Blutflusses, die Erleichterung des Gasaustauschs, die Modulation von Entzündungsreaktionen, die Kontrolle der Blutplättchenaktivität, die Sek....

Protokoll

Alle Versuche wurden nach den ethischen Richtlinien des Tierforschungsausschusses der Universität Sichuan (Nr. K2023023) durchgeführt.

1. Präparation von Paraffinschnitten für Lungenlappen der Maus

1. Entnehmen Sie Lungengewebe von der Maus.
   1. Wählen Sie männliche C57Bl/6-Mäuse im Alter von 6 Wochen und 16 Monaten, um die mikrovaskuläre Dichte in der Lunge von Mäusen in verschiedenen Altersgruppen zu bestimmen.
   2. Verabreichen Sie Mäusen 100 mg/kg Pentobarbital-Natrium durch intraperitoneale Injektion. Euthanasieren Sie die Mäuse durch Zervixluxation nach der Anästhesie.....

Diskussion

Die Untersuchung der pulmonalen mikrovaskulären Dichte hat erhebliche Auswirkungen auf das Verständnis pulmonalphysiologischer Prozesse und auch auf die Definition von Biomarkern für Atemwegserkrankungen. Der Lungenkreislauf zeichnet sich durch eine ausgedehnte Kapillaroberfläche aus, die von einer schlanken Schicht aus Endothelzellen umgeben ist. Das harmonische Nebeneinander dieser Zellen und Alveolarepithelzellen führt zu einer fragilen Alveolen-Kapillarmembran, die speziell entw.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole	MCE	HY-D0814	Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4	Thermo	I32450	Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer	Abcam	AB104135	Sample Fixation
Antigen Repair Fluid	Biosharp	BL151A	Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette	ActivFlo	39LC-500-1	Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064-50G	Sealing Solution
Cold Plate	Leica	HistoCore Arcadia H	Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven	Taisite	101-0AB	High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade	Leica	14035838383	Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds	Shitai	26155166627	Fixing Tissue Samples
Ethanol	Kelong	CAS 64-17-5	Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150	Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath	Leica	HI1220	Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens	Biosharp	BC004	Water-blocking Agent
Medical Forceps	Shanghai Medical Equipment	N/A	Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope	Nikon	Ts2	Imaging Device
Mounting Media	Jiangyuan	Tasteless	Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax	SCHLEDEN	80200-0014	Fixing Tissue Structure
PBS	Beyotime	C0221A	Wash Buffer
Pentobarbital Sodium	Beijing Chemical Reagent Company	Q/H82-F158-2002	Anesthetic
Rotary Microtome	Biobase	Bk-2258	Preparing Slices
Sterile Scissors	Shanghai Medical Equipment	N/A	segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel	Shanghai Medical Equipment	N/A	Cutting Tissue Samples
Triton	Solarbio	T8200	Permeabilization Solution
Wash-Free Slide	PLATINUM PRO	PRO-04	Fixing Samples for Staining
Xylene	SUM	XK13-011-00031	Tissue De-waxing Solution