Lobüller Boyunca Farelerde Pulmoner Mikrovasküler Yoğunluğun Ölçülmesi

Özet

Burada, İzolektin B_4'ün tek boyamasını kullanarak tüm farelerin akciğer dokusu için pulmoner mikrovasküler yoğunluğun tarafsız bir şekilde ölçülmesini sağlamak için basit ve ekonomik bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Pulmoner anjiyogenezin anormal değişimi, akciğer mikrovasküler disfonksiyonu ile ilişkilidir ve vasküler duvar bütünlüğü, kan akışının düzenlenmesi ve gaz değişimi ile derinden bağlantılıdır. Fare modellerinde, akciğer lobları boyut, şekil, konum ve vaskülarizasyon açısından önemli farklılıklar gösterir, ancak mevcut yöntemler mikrovasküler yoğunluğu ölçerken bu varyasyonları dikkate almaz. Bu sınırlama, akciğer mikrovasküler disfonksiyonunun kapsamlı bir şekilde çalışılmasını ve farklı lobüller arasında mikrovasküler dolaşımın potansiyel olarak yeniden şekillenmesini engellemektedir. Protokolümüz, pulmoner mikrovasküler yoğunluk değişikliklerini ölçmek için iki kesitleme yöntemi kullanarak, farelerde hava yolu dallarının farklı loblar boyunca boyutunu, şeklini ve dağılımını kullanarak bu boşluğu ele almaktadır. Daha sonra, akciğer mikrovasküler endotel hücrelerini farklı dilimler üzerinde etiketlemek için İzolektin B₄ (IB₄) boyamayı kullanıyoruz, ardından ücretsiz olarak kullanılabilen ImageJ yazılımını kullanarak tarafsız mikrovasküler yoğunluk analizi yapıyoruz. Burada sunulan sonuçlar, genç ve yaşlı fareleri karşılaştırarak, yaşlanma ile birlikte akciğer lobülleri boyunca değişen derecelerde mikrovasküler yoğunluk değişikliklerini vurgulamaktadır. Bu protokol, pulmoner mikrovasküler yoğunluğun tarafsız bir şekilde ölçülmesi için basit ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunarak, akciğer mikrovasküler sisteminin hem fizyolojik hem de patolojik yönleri üzerine araştırmaları kolaylaştırır.

Giriş

Endotel hücreleri (EC'ler), kan damarlarının iç astarında yer alan, tüm arteriyel ve venöz ağacı kaplayan ve kan damarlarının ve organların stabilitesinin korunmasında çok önemli bir rol oynayan özel bir hücre türüdür¹. Akciğerler yüksek derecede vaskülarize organlardır ve akciğerlerde damar duvarını oluşturmak, kan akışını düzenlemek, gaz değişimini kolaylaştırmak, inflamatuar yanıtları modüle etmek, trombosit aktivitesini kontrol etmek, vasküler büyümede rol oynayan düzenleyici maddeleri salgılamak, onarım ve pıhtılaşma dengesini korumak gibi temel fizyolojik ve patolojik roller oynarlar.

Akciğer mikrovasküler endotel hücreleri (LMEC'ler), özellikle akciğerlerin mikrovasküler sisteminde (kılcal damarlar) bulunan ve onları akciğerlerdeki daha genelleştirilmiş arteriyel ve venöz endotel hücrelerinden ayıran pulmoner dokunun spesifik endotel hücreleridir. Bu hücrelerin vasküler tonusu düzenlemek, vasküler geçirgenliği kontrol etmek, inflamatuar yanıtların düzenlenmesine katılmak ve trombüs oluşumunu düzenlemek gibi çeşitli işlevleri vardır. Pulmoner dolaşımda, gaz değişimini ve besinlerin taşınmasını düzenlemede çok önemli bir rol oynarlar ve muhtemelen yaşlanma için akciğerlerle ilgili çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde rol oynarlar². Ayrıca, pulmoner anjiyogenezin anormal değişimi, akciğer mikrovasküler disfonksiyonu ile ilişkilidir³. Konvansiyonel endotel hücre belirteci CD31 ve uzamsal lokalizasyonu (özellikle akciğerlerin periferik bölgeleri) kullanan Larissa L. ve ark. yaşlı farelerde (18 aylık) genç muadillerine (4 aylık^{) kıyasla} mikrovasküler endotel hücre yoğunluğunda önemli bir azalma gözlemledi4. Astımla ilişkili pulmoner patoloji bağlamında, Makoto H. ve ark. astımlı hastalardan alınan anti-kollajen IV ile boyanmış bronşiyal biyopsi örneklerinde kontrol deneklerine kıyasla damar indüksiyonunda önemli bir artış göstermiştir⁵. Son zamanlarda, Maximilian A. ve ark. Covid-19 veya İnfluenza A'dan (H1N1) ölen hastalarda invajinasyon ve filizlenme anjiyogenezi ile ilgili özelliklerin sayısal yoğunluğunda kayda değer bir artış olduğunu ^bildirdi6. Açıkçası, anormal mikrovasküler oluşum pulmoner disfonksiyon ile bağlantılıdır. Bununla birlikte, şu anda mikrovasküler yoğunluktaki değişiklikleri ölçmek için basit, ekonomik bir yöntem mevcut değildir.

Fare modellerinde, akciğerler geleneksel olarak beş farklı loba ayrılır: sağ kraniyal, sağ orta, sağ kaudal, sol kraniyal ve sol kaudal. Her lob, boyut, şekil, konum ve olası vaskülarizasyon açısından benzersiz özellikler sergileyerek verimli gaz değişimine ve pulmoner dolaşımın potansiyel olarak sinerjik düzenlenmesine katkıda bulunur. Bununla birlikte, bildiğimiz kadarıyla, Akciğer mikrovasküler değişikliklerini araştırırken bu akciğer lobları arasındaki farkları hiçbir metodoloji açıklamaz.

Bu çalışma, pulmoner mikrovasküler yoğunluğun tarafsız kantitatif değerlendirmesi için akciğer mikro-endotel hücrelerinin⁷ iyi tanımlanmış bir belirteci olan IB_4'ü kullanarak, farelerde lobülleri kesitlendirmek için yeni bir yöntem sunmaktadır. Bu yenilikçi yaklaşım, farelerin tek tek loblarının farklı özelliklerini göz önünde bulundurarak murin akciğerlerindeki mikrovasküler değişikliklerin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılması ihtiyacını ele almaktadır. Bir gösteri olarak, yaşlanan farelerde, pulmonerde önemli bir azalma
Mikrovasküler yoğunluk özellikle hem kaudal lobda hem de sol lobda gözlenir. Protokol, lob spesifik analizlerin murin akciğerlerinin mikrovasküler manzarasındaki değişikliklerin araştırılmasına entegre edilmesinin önemini vurgulamaktadır. Özellikle, bu yöntem, anjiyogenezin ötesine geçen, akciğer gelişimlerinin ve lezyonlarının hem fizyolojik hem de patolojik ilerlemesi hakkında kapsamlı bir anlayış arayan araştırmacılar için değerli araştırma referansları sağlar.

Protokol

Tüm deneyler, Sichuan Üniversitesi Hayvan Araştırma Komitesi'nin (No K2023023) etik yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Fare akciğer lobları için parafin kesitlerinin hazırlanması

1. Fareden akciğer dokusu alın.
   1. Farklı yaş gruplarında fare akciğerlerindeki mikrovasküler yoğunluğu değerlendirmek için 6 hafta ve 16 ayda erkek C57Bl / 6 fareleri seçin.
   2. Farelerde intraperitoneal enjeksiyon yoluyla 100 mg / kg pentobarbital sodyum uygulayın. Anesteziden sonra servikal çıkık ile farelere ötenazi yapın. Göğüs boşluğunu açın ve akciğer dokusu elde edin.
2. Parafin bölümleri hazırlayın.
   1. Dokuyu, morfolojisini ve yapısını korumak ve bozulmayı önlemek için doku hacminin 10 katı olan %4'lük bir paraformaldehit solüsyonuna yerleştirerek sabitleyin.
      NOT: Murin akciğerlerinde vasküler perfüzyon fiksasyonu sırasında havayı şişirmek için yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntemin hava yolunun, alveolar hücrelerin ve interstisyumun daha iyi morfolojisini ve konumunu koruduğu ve bu da onları akciğer histolojik çalışmaları için daha uygun hale getirdiği bildirilmektedir. Bu yöntem, ilgili ekipman ve sarf malzemelerine sahip laboratuvarlar için kurum içi aletlerle⁸ önerilir.
   2. Gömme yönünü belirlemek için akciğer lobunu kesin (Şekil 1).
      1. 3 saatlik fiksasyondan sonra, beş pulmoner lobu ayırın (gözlerin doğrudan gözlemi altında) ve sağ akciğerin kraniyal, orta ve aksesuar loblarını, dikey lob-bronş bağlantısı yönünde yönlendirilmiş bölümler olacak şekilde ayrı ayrı gömün.
      2. Sağ akciğerin kaudal lobunu, akciğer lobu-bronş bağlantısına dik yönde soldan sağa 4 mm hızla 2 parçaya kesin ve dilimleri, kesilen yüzey yukarı bakacak şekilde bir balmumu bloğuna gömün.
      3. Sol akciğer lobunda üç kesi yapın. İlk kesimi ana bronş bileşkesinin enine üzerinde, üst kısmın 2 mm altında yapın. İkinci kesimi ana bronş bileşkesinin enine üstünde, üst kısmın 5 mm altında yapın. Üçüncü kesimi lobun sonunda, üst kısmın 8 mm altında yapın. En üstteki doku parçasını atın ve kalan üç parçayı, kesilen yüzey yukarı bakacak şekilde bir balmumu bloğu ile kaplayın.
         NOT: Birden fazla akciğer parçasını bir araya getirirken, dehidrasyon işlemine devam etmek için bir doku gömme kutusuna yerleştirmeden önce bunları sarmak için bir mikroskop silme kağıdı kullanılabilir.
      4. Dokuyu 24 saat boyunca fiksatifte tekrar sabitleyin.
   3. Doku bloğunu bir kaba koyun ve akan su altında 15 dakika durulayın.
   4. Dokuyu sırayla aşağıdaki solüsyonlara yerleştirin: 30 dakika boyunca% 65 etanol, 30 dakika boyunca% 75 etanol, 30 dakika boyunca% 85 etanol, 60 dakika boyunca% 95 etanol I, 60 dakika boyunca% 95 etanol II, 60 dakika boyunca% etanol I, 60 dakika boyunca mutlak etanol II, 120 dakika boyunca% 70 etanol, 120 dakika boyunca% 80 etanol, 120 dakika boyunca% 90 etanol, 120 dakika boyunca% 95 etanol, 120 dakika boyunca mutlak etanol I ve 120 dakika boyunca mutlak etanol II.
   5. Dokuyu 30 dakika boyunca ksilen I'e ve 30 dakika boyunca ksilen II'ye yerleştirin.
   6. Dokuyu 1 saat boyunca 54 ° C'nin altındaki yumuşak muma, 1 saat boyunca 58 ° C'de sert mum I'e ve 30 dakika boyunca 58 ° C'de sert mum II'ye yerleştirin.
   7. Uygun bir kalıp boyutu seçin, uygun miktarda sıvı parafin ile doldurun ve dokuyu kalıbın ortasındaki gömme çerçevesine doğru yönde yerleştirmek için forseps kullanın. Kalıbı ve dokuyu gömme makinesinin donma alanına yerleştirin ve dokuya forseps ile hafifçe bastırın.
   8. Parafin hafifçe beyazlaşmaya başladığında, açıkta kalan gömme çerçevesini hızlı bir şekilde kalıbın üzerine yerleştirin ve gömme çerçevesinin altındaki delikleri kapatarak ikinci balmumu enjeksiyonunu gerçekleştirin. Kalıplama için tüm kalıbı dondurma masasına aktarın.
   9. Mum bloğunu dilimleyiciye sabitledikten ve kaba ve ince düzeltme yoluyla pürüzsüz ve düz kesim yüzeyini ortaya çıkardıktan sonra, 4 μm kalınlığındaki dilimleri kesmek için mikrotomun tekerlek krankını döndürün.
   10. Çıkarılan bölümleri sırayla su yüzeyine düzgün bir şekilde yerleştirin. Bölümler tamamen uzadıktan sonra, her bölüm arasındaki bağlantı noktalarında kırık parçaları ayırın.
   11. Bölümün altına bir cam sürgü eğin ve temas halinde sürgünü dikey hareketlerle su yüzeyinden yavaşça ve eşit bir şekilde kaldırın. Bölümler cam slayta yapışacaktır.

2. Pulmoner mikrovaskülatür tespiti için immünofloresan boyama

1. Parafine gömülü dilimleri 65 °C'lik fırında 60 dakika pişirin.
2. Dilimleri bir sürgülü rafa yerleştirin ve boyama kavanozlarına aşağıdaki adımları uygulayın: ksilen 1, ksilen 2 ve ksilen 3'ü her biri 15 dakika daldırın, ardından ksilen / etanole daldırın (1: 1) 5 dakika, %100 etanol #1, %100 etanol #2, %85 etanol, %75 etanol ve her biri 5 dakika damıtılmış su.
3. Modifiye edilmiş sodyum sitrat antijen alma solüsyonunu deiyonize su ile 50 kat seyreltin. Mikrodalgayı kaynayana kadar yüksek güçte önceden ısıtın, ardından slaytı antijen özütünün içine yerleştirin. Slaytın antijen ekstraktında 15 dakika kaynamasına izin verin ve ardından doğal olarak oda sıcaklığına soğutun.
4. Slaytları PBS ile her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayın. Her biri 10 dakika boyunca iki kez% 0.25 Triton ile geçirgenleştirin.
5. Dokuyu bir immünohistokimya kalemi ile çevreleyin ve bunu oda sıcaklığında (RT) %5 BSA ile 1 saat inkübe edin. Slaytları PBS ile bir kez 5 dakika yıkayın.
6. Alexa-647 Fluor konjuge IB₄ ve DAPI boyama gerçekleştirin.
   1. IB_4'ü buz üzerinde tutun ve %1 BSA ile 1:50 oranında seyreltin. Dairenin etrafındaki fazla suyu alın, her doku bölümüne 50-100 μL seyreltilmiş IB₄ ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin (bu adımdan itibaren tüm prosedürleri karanlıkta gerçekleştirin).
   2. Slaytları PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. 10 dakika boyunca% 0.25 Triton ile geçirgenleştirin.
7. DAPI'yi (10 μg/mL) PBS ile 1:10 oranında seyreltin ve RT'de her doku bölümüne 5 dakika boyunca 50-100 μL ekleyin.
8. Slaytları PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
9. Işığa maruz kalmaktan kaçınarak slaytlara bir damla solmaya karşı dayanıklı montaj ortamı uygulayın. Slaytı havayla kurutun, ardından bir floresan mikroskobu altında çekirdeğin ve hedef sinyallerin görüntülerini gözlemleyin ve yakalayın.

3. Pulmoner mikrovasküler yoğunluğun ölçülmesi

1. Görüntüleri elde edin.
   1. Hem genç hem de yaşlı yaş gruplarında her akciğer lobu için 10x objektif altında akciğer mikrovasküler yoğunluk sinyallerini ve DAPI sinyallerini gözlemleyin.
   2. Gözlem sonuçlarına göre her kanal için ışık kaynağı yoğunluğunu ve maruz kalma süresini standartlaştırın. Her bir akciğer lobunun tüm alanını kaplayan çift kanallı görüntüleri yakalayın. Görüntüyü iki kanallı ND2 formatında kaydedin (Şekil 2).
2. Resim J'yi kullanarak nicelik belirleyin (Ek Şekil 1).
   1. ImageJ yazılımını başlatın.
   2. Belirtilen görüntüleri ImageJ'e aktarın, ardından yüklemeye devam edin ve seçin. Kanalları buna göre bölün. Hem DAPI hem de IB₄ kanalları için ND2 formatında bir dosya yükleyin.
   3. Analiz Et > Ölçeği Ayarla > Görüntü Parametrelerini 0,48 μm/piksel (fotoğraf parametrelerine bağlı olarak) olarak Yapılandır > Global > OK'a gidin.
   4. Görüntü sunum efektini ayarlamak için aynı ekran aralığını ayarlayın. Görüntü Seç> Ayarla > Parlaklığı/Kontrastı > Ayarla'yı seçin. İki kanalın her biri için görüntüleme aralığını ayrı ayrı ayarlayın, IB₄: 0-10000; DAPI: 0-20000.
   5. Arka plan sinyallerinin etkisini ortadan kaldırmak için aşağıdaki adımları izleyin: İşlem'i tıklayın > Matematik > Çıkar; Arka plan sinyalini, arka plandaki Sihirli Değnek aracı tarafından algılanan sinyal değerlerine göre çıkarın, IB₄: 3000; DAPI:300.
   6. Orijinal görüntüyle en iyi hizalanan eşik değerini seçmek için Görüntü > Çoğalt'a gidin.
   7. Hem orijinal hem de yinelenen Görüntü > seçin > 8 bit yazın.
   8. Akciğer mikrovasküler sistemini tam olarak tanımlamak için uygun bir eşik değeri seçin. Tıkla Görüntü > Ayarla > Eşiği > Modları Arası (orijinal diyagrama göre en gerçekçi eşiği seçin), Koyu Arka Plan> işaretleyin > Uygula.
   9. Atardamarlar ve toplardamarlar da dahil olmak üzere fare akciğerindeki büyük kan damarlarından IB₄ pozitif sinyallerini ortadan kaldırın: Yinelenen görüntüye kıyasla daha büyük kan damarlarını seçmek için Sihirli Değnek aracını kullanın, ardından Sil'e tıklayın (daha büyük kan damarlarının endotel hücrelerindeki IB₄ pozitif sinyalleri çıkarılana kadar bunu tekrarlayın).
      NOT: Fare akciğerindeki arter ve venlerin endotel hücrelerinde IB₄ boyama sinyalleri tespit edilir. Pulmoner mikrovasküler sistem oluşumlarının spesifik bir incelemesini elde etmek için, daha büyük kan damarlarının endotel hücrelerindeki sinyal odaklarının düzgün bir şekilde çıkarılması önerilir.
   10. Hedef sinyallerin sayısını sayın, Analiz Et'i tıklayın > Ölçümleri Ayarlayın ve Alan, Eşikle Sınırla ve Etiketi Görüntüle'yi işaretleyin. Ardından Parçacıkları Analiz Et'i seçin ve Boyut: 0-sonsuz'u ayarlayın; Dairesellik: 0.00-1.00; Göster: Aşırı maskeler; Özetle'yi işaretleyin ve Tamam'a tıklayın.
   11. Sonuçları Özetle > Dosya'yı seçin > Farklı kaydet'i seçin.
3. Veri analizi ve istatistik
   1. Aynı görüntüde sırasıyla IB₄ pozitif odakların ve DAPI pozitif odakların sayısını birleşik bir tabloda eşleştirin ve düzenleyin.
   2. Belirtilen genç veya yaş gruplarındaki her lob için toplam IB₄ pozitif odak ve DAPI pozitif odak sayısını özetleyin.
      1. IB4 pozitif odakların toplam sayısını farklı gruplara göre her lobdaki toplam DAPI boyama odağı sayısına bölerek_IB4 pozitif odakların yüzdesini (%) hesaplayın. Şekil 3A'da gösterildiği gibi IB₄ pozitif odaklarının sayısını, DAPI boyama odaklarının sayısını ve IB₄ pozitif odakların yüzdesini (%) sunun.
   3. Veri analizi yazılımını başlatın ve yeni bir sütun tablosu oluşturun.
      NOT: Burada istatistiksel analiz için GraphPad Prism 9 kullanılmıştır.
   4. Grup A'dan Grup J'ye doğru sırasıyla "Genç kraniyal lob", "Eski kraniyal lob", "Genç orta lob", "Eski orta lob", "Genç kaudal lob", "Eski kaudal lob", "Genç aksesuar lob", "Eski aksesuar lob", "Genç sol lob", "Eski sol lob" şeklinde isimlendirin. Ardından, karşılık gelen IB₄ pozitif odaklarını (%) tabloya girin (Ek Tablo 1).
   5. İki yaş grubu arasındaki karşılık gelen bölgelerdeki önemli farklılıkları değerlendirmek için ikili karşılaştırma için eşleştirilmemiş t-testlerini kullanın. Beş lob için toplam beş karşılaştırma yapın.
   6. Sonuç görselleştirme için bir grafik oluşturun (Şekil 3B). Bir çubuk grafik seçin ve şekle istatistiksel analiz ekleyin.

Sonuçlar

Ana bronşlardaki lezyonları ve küçük hava yolu dallarını ayırt etmek için, bu iki tip hava yolundaki lezyonların sürekli yapısının gözlendiğinden emin olmak çok önemlidir. Bu, Şekil 1'de özetlenen kesme ve gömme prosedürlerini izleyerek elde edilebilir. Farelerde çeşitli yönlere yönlendirilmiş ve ağ benzeri bir yapıya sahip çok sayıda akciğer lobu göz önüne alındığında, diğer katı dokulara kıyasla çökmeye daha yatk...

Tartışmalar

Pulmoner mikrovasküler yoğunluğun incelenmesi, pulmoner fizyolojik süreçlerin anlaşılması ve ayrıca solunum yolu hastalıkları için biyobelirteç(ler)in tanımlanması için önemli etkilere sahiptir. Pulmoner dolaşım, ince bir endotel hücre tabakası ile çevrili geniş bir kılcal yüzey alanına sahiptir. Bu hücrelerin ve alveolar epitel hücrelerinin uyumlu bir şekilde yan yana gelmesi, karmaşık gaz değişimi sürecini kolaylaştırmak için özel olarak tasarlanm?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole	MCE	HY-D0814	Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4	Thermo	I32450	Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer	Abcam	AB104135	Sample Fixation
Antigen Repair Fluid	Biosharp	BL151A	Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette	ActivFlo	39LC-500-1	Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064-50G	Sealing Solution
Cold Plate	Leica	HistoCore Arcadia H	Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven	Taisite	101-0AB	High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade	Leica	14035838383	Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds	Shitai	26155166627	Fixing Tissue Samples
Ethanol	Kelong	CAS 64-17-5	Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150	Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath	Leica	HI1220	Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens	Biosharp	BC004	Water-blocking Agent
Medical Forceps	Shanghai Medical Equipment	N/A	Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope	Nikon	Ts2	Imaging Device
Mounting Media	Jiangyuan	Tasteless	Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax	SCHLEDEN	80200-0014	Fixing Tissue Structure
PBS	Beyotime	C0221A	Wash Buffer
Pentobarbital Sodium	Beijing Chemical Reagent Company	Q/H82-F158-2002	Anesthetic
Rotary Microtome	Biobase	Bk-2258	Preparing Slices
Sterile Scissors	Shanghai Medical Equipment	N/A	segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel	Shanghai Medical Equipment	N/A	Cutting Tissue Samples
Triton	Solarbio	T8200	Permeabilization Solution
Wash-Free Slide	PLATINUM PRO	PRO-04	Fixing Samples for Staining
Xylene	SUM	XK13-011-00031	Tissue De-waxing Solution