소엽에 걸친 생쥐의 폐 미세혈관 밀도 정량화

요약

여기에서는 Isolectin B₄의 단일 염색을 사용하여 전체 마우스 폐 조직에 대한 폐 미세혈관 밀도의 편향되지 않은 정량화를 수행하는 간단하고 경제적인 프로토콜을 설명합니다.

초록

폐 혈관 신생의 비정상적인 교대는 폐 미세혈관 기능 장애와 관련이 있으며 혈관 벽 무결성, 혈류 조절 및 가스 교환과 깊은 관련이 있습니다. 쥐 모델에서 폐엽은 크기, 모양, 위치 및 혈관화에서 상당한 차이를 보이지만 기존 방법은 미세혈관 밀도를 정량화할 때 이러한 변화를 고려하지 않았습니다. 이러한 한계는 폐 미세혈관 기능 장애에 대한 포괄적인 연구와 다양한 소엽에 걸친 미세혈관 순환의 잠재적 리모델링을 방해합니다. 당사의 프로토콜은 폐 미세혈관 밀도 변화를 정량화하기 위해 두 가지 절편 방법을 사용하여 마우스의 뚜렷한 엽에 걸쳐 기도 가지의 크기, 모양 및 분포를 활용하여 이러한 격차를 해결합니다. 그런 다음 이솔렉틴 B₄ (IB₄) 염색을 사용하여 여러 절편의 폐 미세혈관 내피 세포를 라벨링한 다음 무료로 제공되는 소프트웨어 ImageJ를 사용하여 편향되지 않은 미세혈관 밀도 분석을 수행합니다. 여기에 제시된 결과는 노화에 따른 폐 소엽 전체의 미세혈관 밀도 변화의 다양한 정도를 강조하여 젊은 마우스와 늙은 마우스를 비교합니다. 이 프로토콜은 폐 미세혈관 밀도의 편향되지 않은 정량화를 위한 간단하고 비용 효율적인 접근 방식을 제공하여 폐 미세혈관의 생리학적 및 병리학적 측면에 대한 연구를 촉진합니다.

서문

내피세포(endothelial cell, ECs)는 혈관의 내벽에 위치한 특별한 유형의 세포로, 동맥 및 정맥 나무 전체를 덮고 혈관과 장기의 안정성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다¹. 폐는 혈관이 고도로 발달된 기관으로 혈관 벽을 형성하고, 혈류를 조절하고, 가스 교환을 촉진하고, 염증 반응을 조절하고, 혈소판 활동을 조절하고, 혈관 성장에 관여하는 조절 물질을 분비하고, 복구하고, 응고 균형을 유지하는 등 폐에서 필수적인 생리학적 및 병리학적 역할을 합니다.

폐 미세혈관 내피 세포(LMECs)는 폐 조직, 특히 폐의 미세혈관(모세혈관)에 있는 특정 내피 세포로, 폐의 보다 일반화된 동맥 및 정맥 내피 세포와 구별됩니다. 이 세포는 혈관 긴장도 조절, 혈관 투과성 조절, 염증 반응 조절 참여, 혈전 형성 조절 등 다양한 기능을 합니다. 폐는 폐 순환, 가스 교환 및 영양소 운반을 조절하는 데 중요한 역할을 하며, 폐와 관련된 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에 관여하며, 노화의 원인이 될 수 있다². 또한, 폐혈관신생의 비정상적인 교대는 폐 미세혈관 기능....

프로토콜

모든 실험은 쓰촨 대학 동물 연구위원회 (No K2023023)의 윤리 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 쥐의 폐엽을 위한 파라핀 절편의 준비

1. 쥐에서 폐 조직을 얻습니다.
   1. 6주 및 16개월에 수컷 C57Bl/6 마우스를 선택하여 다양한 연령 그룹에 걸쳐 마우스 폐의 미세혈관 밀도를 평가합니다.
   2. 마우스에서 복강 내 주사를 통해 100mg/kg의 펜토바르비탈 나트륨을 투여합니다. 마취 후 자궁 경부 탈구로 생쥐를 안락사시킵니다. 흉강을 열고 폐 조직을 얻습니다.
2. 파라핀 절편을 준비합니다.
   1. 조직 부피의 10배인 4% 파라포름알데히드 용액에 조직을 넣어 조직을 고정하면 조직의 형태와 구조를 보존하고 분해를 방지할 수 있습니다.
      참고: 쥐 폐의 혈관 관류 고정 중에 공기를 팽창시키는 최근의 새로운 방법이 개발되었습니다. 이 방법은 기도, 폐포 세포 및 간질의 형태와 위치를 더 잘 보존하여 폐 조직학 연구에 더 적합하게 만드는 것으로 보고되었습니다. 이 방법은 자체 제작 기기가 있는 해당 장비 및 소모품이 있는 실험실에 권장됩니다

토론

폐 미세혈관 밀도에 대한 연구는 폐 생리학적 과정을 이해하고 호흡기 질환에 대한 바이오마커를 정의하는 데 중요한 의미를 갖습니다. 폐 순환은 내피 세포의 가느다란 층으로 둘러싸인 광범위한 모세관 표면적을 자랑합니다. 이들 세포와 폐포 상피 세포의 조화로운 병치는 복잡한 가스 교환 과정을 용이하게 하기 위해 특별히 설계된 깨지기 쉬운 폐포-모세혈관 막을 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole	MCE	HY-D0814	Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4	Thermo	I32450	Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer	Abcam	AB104135	Sample Fixation
Antigen Repair Fluid	Biosharp	BL151A	Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette	ActivFlo	39LC-500-1	Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064-50G	Sealing Solution
Cold Plate	Leica	HistoCore Arcadia H	Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven	Taisite	101-0AB	High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade	Leica	14035838383	Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds	Shitai	26155166627	Fixing Tissue Samples
Ethanol	Kelong	CAS 64-17-5	Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150	Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath	Leica	HI1220	Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens	Biosharp	BC004	Water-blocking Agent
Medical Forceps	Shanghai Medical Equipment	N/A	Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope	Nikon	Ts2	Imaging Device
Mounting Media	Jiangyuan	Tasteless	Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax	SCHLEDEN	80200-0014	Fixing Tissue Structure
PBS	Beyotime	C0221A	Wash Buffer
Pentobarbital Sodium	Beijing Chemical Reagent Company	Q/H82-F158-2002	Anesthetic
Rotary Microtome	Biobase	Bk-2258	Preparing Slices
Sterile Scissors	Shanghai Medical Equipment	N/A	segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel	Shanghai Medical Equipment	N/A	Cutting Tissue Samples
Triton	Solarbio	T8200	Permeabilization Solution
Wash-Free Slide	PLATINUM PRO	PRO-04	Fixing Samples for Staining
Xylene	SUM	XK13-011-00031	Tissue De-waxing Solution