소엽에 걸친 생쥐의 폐 미세혈관 밀도 정량화

요약

여기에서는 Isolectin B₄의 단일 염색을 사용하여 전체 마우스 폐 조직에 대한 폐 미세혈관 밀도의 편향되지 않은 정량화를 수행하는 간단하고 경제적인 프로토콜을 설명합니다.

초록

폐 혈관 신생의 비정상적인 교대는 폐 미세혈관 기능 장애와 관련이 있으며 혈관 벽 무결성, 혈류 조절 및 가스 교환과 깊은 관련이 있습니다. 쥐 모델에서 폐엽은 크기, 모양, 위치 및 혈관화에서 상당한 차이를 보이지만 기존 방법은 미세혈관 밀도를 정량화할 때 이러한 변화를 고려하지 않았습니다. 이러한 한계는 폐 미세혈관 기능 장애에 대한 포괄적인 연구와 다양한 소엽에 걸친 미세혈관 순환의 잠재적 리모델링을 방해합니다. 당사의 프로토콜은 폐 미세혈관 밀도 변화를 정량화하기 위해 두 가지 절편 방법을 사용하여 마우스의 뚜렷한 엽에 걸쳐 기도 가지의 크기, 모양 및 분포를 활용하여 이러한 격차를 해결합니다. 그런 다음 이솔렉틴 B₄ (IB₄) 염색을 사용하여 여러 절편의 폐 미세혈관 내피 세포를 라벨링한 다음 무료로 제공되는 소프트웨어 ImageJ를 사용하여 편향되지 않은 미세혈관 밀도 분석을 수행합니다. 여기에 제시된 결과는 노화에 따른 폐 소엽 전체의 미세혈관 밀도 변화의 다양한 정도를 강조하여 젊은 마우스와 늙은 마우스를 비교합니다. 이 프로토콜은 폐 미세혈관 밀도의 편향되지 않은 정량화를 위한 간단하고 비용 효율적인 접근 방식을 제공하여 폐 미세혈관의 생리학적 및 병리학적 측면에 대한 연구를 촉진합니다.

서문

내피세포(endothelial cell, ECs)는 혈관의 내벽에 위치한 특별한 유형의 세포로, 동맥 및 정맥 나무 전체를 덮고 혈관과 장기의 안정성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다¹. 폐는 혈관이 고도로 발달된 기관으로 혈관 벽을 형성하고, 혈류를 조절하고, 가스 교환을 촉진하고, 염증 반응을 조절하고, 혈소판 활동을 조절하고, 혈관 성장에 관여하는 조절 물질을 분비하고, 복구하고, 응고 균형을 유지하는 등 폐에서 필수적인 생리학적 및 병리학적 역할을 합니다.

폐 미세혈관 내피 세포(LMECs)는 폐 조직, 특히 폐의 미세혈관(모세혈관)에 있는 특정 내피 세포로, 폐의 보다 일반화된 동맥 및 정맥 내피 세포와 구별됩니다. 이 세포는 혈관 긴장도 조절, 혈관 투과성 조절, 염증 반응 조절 참여, 혈전 형성 조절 등 다양한 기능을 합니다. 폐는 폐 순환, 가스 교환 및 영양소 운반을 조절하는 데 중요한 역할을 하며, 폐와 관련된 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에 관여하며, 노화의 원인이 될 수 있다². 또한, 폐혈관신생의 비정상적인 교대는 폐 미세혈관 기능 장애와 관련이 있다³. Larissa L. 등은 기존의 내피 세포 마커 CD31 및 공간 국소화(특히 폐의 주변 영역)를 사용하여 젊은 마우스(4개월령)에 비해 고령 마우스(18개월)에서 미세혈관 내피 세포 밀도가 크게 감소하는 것을 관찰^{했습니다4.} 천식과 관련된 폐 병리학의 맥락에서, Makoto H. et al.은 천식 환자로부터 항-콜라겐 IV로 염색된 기관지 생검 표본에서 대조군에 비해 혈관 유도가 크게 증가했음을 보여주었다⁵. 최근 Maximilian A. et al.은 투과 및 주사 전자 현미경 기술을 도입하여 Covid-19 또는 인플루엔자 A(H1N1^)로 사망한 환자에서 장중첩 및 발아 혈관 신생과 관련된 특징의 수 밀도가 눈에 띄게 증가했다고 보고했습니다6. 분명히, 비정상적인 미세혈관 발생은 폐 기능 장애와 관련이 있습니다. 그러나 현재 미세혈관 밀도의 변화를 정량화하는 데 사용할 수 있는 간단하고 경제적인 방법은 없습니다.

쥐 모델에서 폐는 일반적으로 오른쪽 두개골, 오른쪽 중간, 오른쪽 꼬리, 왼쪽 두개골 및 왼쪽 꼬리의 5 개의 뚜렷한 엽으로 나뉩니다. 각 엽은 크기, 모양, 위치 및 혈관화 가능성 측면에서 고유한 특성을 나타내어 효율적인 가스 교환과 폐 순환의 시너지 조절에 기여할 수 있습니다. 그러나 우리가 아는 한, 폐 미세혈관 변화를 조사할 때 이러한 폐엽 간의 차이를 설명하는 방법론은 없습니다.

이 연구는 폐 미세혈관 밀도의 편향되지 않은 정량적 평가를 위해 폐 미세 내피 세포⁷의 잘 정의된 마커인 IB₄를 활용하여 마우스의 소엽을 절단하는 새로운 방법을 제시합니다. 이 혁신적인 접근법은 쥐의 개별 엽의 뚜렷한 특성을 고려하여 쥐 폐의 미세혈관 변화에 대한 보다 포괄적인 이해의 필요성을 해결합니다. 입증으로, 노화 마우스에서 폐의 현저한 감소
미세혈관 밀도는 꼬리엽과 좌엽 모두에서 특이적으로 관찰됩니다. 이 프로토콜은 쥐 폐의 미세혈관 지형 변화에 대한 조사에 엽 특이적 분석을 통합하는 것의 중요성을 강조합니다. 특히, 이 방법은 혈관 신생을 넘어 폐 발달 및 병변의 생리학적 및 병리학적 진행에 대한 포괄적인 이해를 원하는 연구자에게 귀중한 연구 참고 자료를 제공합니다.

프로토콜

모든 실험은 쓰촨 대학 동물 연구위원회 (No K2023023)의 윤리 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 쥐의 폐엽을 위한 파라핀 절편의 준비

1. 쥐에서 폐 조직을 얻습니다.
   1. 6주 및 16개월에 수컷 C57Bl/6 마우스를 선택하여 다양한 연령 그룹에 걸쳐 마우스 폐의 미세혈관 밀도를 평가합니다.
   2. 마우스에서 복강 내 주사를 통해 100mg/kg의 펜토바르비탈 나트륨을 투여합니다. 마취 후 자궁 경부 탈구로 생쥐를 안락사시킵니다. 흉강을 열고 폐 조직을 얻습니다.
2. 파라핀 절편을 준비합니다.
   1. 조직 부피의 10배인 4% 파라포름알데히드 용액에 조직을 넣어 조직을 고정하면 조직의 형태와 구조를 보존하고 분해를 방지할 수 있습니다.
      참고: 쥐 폐의 혈관 관류 고정 중에 공기를 팽창시키는 최근의 새로운 방법이 개발되었습니다. 이 방법은 기도, 폐포 세포 및 간질의 형태와 위치를 더 잘 보존하여 폐 조직학 연구에 더 적합하게 만드는 것으로 보고되었습니다. 이 방법은 자체 제작 기기가 있는 해당 장비 및 소모품이 있는 실험실에 권장됩니다⁸.
   2. 매립 방향을 결정하기 위해 폐엽을 절단합니다(그림 1).
      1. 3시간 고정 후 5개의 폐엽(눈의 직접 관찰 하에)을 분리하고 오른쪽 폐의 두개골, 중간 및 부속엽을 별도로 삽입하고 단면은 수직 엽-기관지 연결 방향을 향하게 합니다.
      2. 오른쪽 폐의 꼬리엽을 폐엽-기관지 연결부에 수직인 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 4mm씩 2조각으로 자르고 절단면이 위를 향하도록 왁스 블록에 조각을 삽입합니다.
      3. 왼쪽 폐엽을 세 번 자릅니다. 첫 번째 절단은 주 기관지 접합부 위쪽, 상단에서 2mm 아래로 가로로 절단합니다. 두 번째 절단은 주 기관지 접합부 위쪽, 상단에서 5mm 아래로 가로로 절단합니다. 로브 끝에서 상단 8mm 아래 세 번째 절단을 만듭니다. 조직의 가장 위쪽 조각을 버리고 나머지 세 조각을 절단면이 위를 향하도록 왁스 블록에 넣습니다.
         알림: 여러 개의 폐 조각을 함께 삽입할 때 조직 삽입 상자에 넣기 전에 현미경 닦는 종이를 사용하여 감싸서 탈수 과정을 계속할 수 있습니다.
      4. 24시간 동안 정착액에 조직을 다시 고정합니다.
   3. 티슈 블록을 용기에 넣고 흐르는 물에 15분 동안 헹굽니다.
   4. 조직을 다음 용액에 순차적으로 넣으십시오 : 65 % 에탄올 30 분, 75 % 에탄올 30 분, 85 % 에탄올 30 분, 95 % 에탄올 I 60 분, 95 % 에탄올 II 60 분, 절대 에탄올 I 60 분, 절대 에탄올 II 60 분, 70 % 에탄올 120 분, 80 % 에탄올 120 분, 90% 에탄올은 120분, 95% 에탄올은 120분, 앱솔루트 에탄올 I은 120분, 앱솔루트 에탄올 II는 120분입니다.
   5. 조직을 크실렌 I에 30분 동안 넣고 크실렌 II에 30분 동안 넣습니다.
   6. 조직을 54°C 이하의 부드러운 왁스에 1시간 동안, 58°C의 하드 왁스 I을 1시간 동안, 하드 왁스 II를 58°C에서 30분 동안 넣습니다.
   7. 적절한 금형 크기를 선택하고 적당량의 액체 파라핀을 채우고 겸자를 사용하여 금형 중앙의 임베딩 프레임에 조직을 올바른 방향으로 배치합니다. 매립기의 냉동 영역에 금형과 티슈를 놓고 집게로 티슈를 부드럽게 누릅니다.
   8. 파라핀이 약간 하얗게 변하기 시작하면 덮개가 없는 임베딩 프레임을 금형 위에 빠르게 놓고 두 번째 왁스 주입을 수행하여 임베딩 프레임 하단의 구멍을 밀봉합니다. 성형을 위해 전체 금형을 냉동 테이블로 옮깁니다.
   9. 왁스 블록을 슬라이서에 고정하고 거칠고 미세한 트리밍을 통해 매끄럽고 평평한 절단면이 드러난 후 마이크로톰의 휠 크랭크를 회전시켜 4μm 두께의 슬라이스를 절단합니다.
   10. 제거한 부분을 순차적으로 물 표면에 부드럽게 놓습니다. 단면이 완전히 확장되면 각 단면 사이의 접합부에서 깨진 조각을 분리합니다.
   11. 섹션 아래의 유리 슬라이드를 기울이고 접촉하면 수직 동작으로 슬라이드를 물 표면에서 천천히 고르게 들어 올립니다. 섹션은 유리 슬라이드에 부착됩니다.

2. 폐 미세혈관 검출을 위한 면역형광 염색

1. 파라핀이 함유된 조각을 65°C 오븐에 60분 동안 넣습니다.
2. 슬라이스를 슬라이드 랙에 놓고 염색 용기에서 다음 단계를 수행합니다: 크실렌 1, 크실렌 2 및 크실렌 3을 각각 15분 동안 담근 다음 크실렌/에탄올(1:1)에 5분 동안 담근 다음 100% 에탄올 #1, 100% 에탄올 #2, 85% 에탄올, 75% 에탄올 및 증류수에 각각 5분 동안 담그십시오.
3. 개질된 구연산나트륨 항원 회수 용액을 탈이온수로 50배 희석합니다. 끓을 때까지 전자레인지를 고출력으로 예열한 다음 슬라이드를 항원 추출물에 넣습니다. 슬라이드를 항원 추출물에 15분 동안 끓인 다음 실온으로 자연 냉각시킵니다.
4. PBS로 슬라이드를 각각 5분 동안 두 번 세척합니다. 0.25% 트리톤으로 각각 10분 동안 두 번 투과시킵니다.
5. 면역조직화학 펜으로 조직을 둘러싸고 실온(RT)에서 1시간 동안 5% BSA로 배양합니다. PBS로 슬라이드를 5분 동안 한 번 세척합니다.
6. Alexa-647 Fluor conjugated IB₄ 및 DAPI 염색을 수행합니다.
   1. IB₄ 를 얼음 위에 두고 1% BSA로 50:1로 희석합니다. 원 주위의 과도한 물을 제거하고 희석된 IB₄ 50-100 μL를 각 조직 섹션에 첨가하고 4°C에서 밤새 배양합니다(이 단계부터 모든 절차를 어두운 곳에서 수행).
   2. PBS로 슬라이드를 각각 5분 동안 세 번 세척합니다. 10분 동안 0.25% 트리톤으로 투과시킵니다.
7. DAPI(10μg/mL)를 PBS로 1:10의 비율로 희석하고 RT에서 5분 동안 각 조직 절편에 50-100μL를 추가합니다.
8. PBS로 슬라이드를 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.
9. 빛에 노출되지 않도록 슬라이드에 페이드 방지 장착 매체를 한 방울 떨어뜨립니다. 슬라이드를 자연 건조시킨 다음 형광 현미경으로 핵과 표적 신호의 이미지를 관찰하고 캡처합니다.

3. 폐 미세혈관 밀도의 정량화

1. 이미지를 획득합니다.
   1. 젊은 연령층과 노년층 모두에서 각 폐엽에 대해 10x 대물렌즈 아래에서 폐 미세혈관 밀도 신호와 DAPI 신호를 관찰합니다.
   2. 관찰 결과를 기반으로 각 채널의 광원 강도와 노출 시간을 표준화합니다. 각 폐엽의 전체 영역을 커버하는 이중 채널 이미지를 캡처합니다. 두 개의 채널이 있는 ND2 형식으로 이미지를 저장합니다(그림 2).
2. 이미지 J를 사용하여 정량화합니다(보충 그림 1).
   1. ImageJ 소프트웨어를 실행합니다.
   2. 표시된 이미지를 ImageJ로 가져온 다음 로드를 진행하고 선택합니다. 그에 따라 채널을 분할합니다. DAPI 및 IB₄ 채널 모두에 대해 ND2 형식으로 파일을 로드합니다.
   3. Analyze(분석) > Set Scale>(스케일 설정)로 이동하여 이미지 매개변수를 0.48μm/pixel(사진 매개변수에 따라 다름)로 구성> Global > OK로 이동합니다.
   4. 동일한 표시 범위를 설정하여 이미지 표현 효과를 조정합니다. 이미지를 선택하고 밝기/대비>> > 설정할 조정합니다. 두 채널 각각에 대한 표시 범위를 개별적으로 설정, IB₄ : 0-10000; DAPI: 0-20000입니다.
   5. 배경 신호의 영향을 제거하려면 다음 단계를 진행하십시오. 프로세스 > 수학 > 빼기를 클릭합니다. 배경에서 Magic Wand 도구에 의해 감지된 신호 값을 기반으로 배경 신호를 뺍니다(IB₄: 3000; 단피:300.
   6. 원본 이미지에 가장 잘 맞는 임계값을 선택하려면 이미지 > 복제로 이동합니다.
   7. 원본 및 복제 이미지 > 유형 > 8비트를 모두 선택합니다.
   8. 폐 미세혈관을 정확하게 식별하기 위해 적절한 임계값을 선택합니다. 이미지를 클릭하고 > 임계값 조정 > 인터모드(원본 다이어그램에 대해 가장 현실적인 임계값 선택) > 어두운 배경 > 적용> 선택합니다.
   9. 동맥 및 정맥을 포함하여 쥐 폐의 큰 혈관에서 IB₄ 양성 신호 제거: 마술 지팡이 도구를 사용하여 복제된 이미지와 비교하여 더 큰 혈관을 선택한 다음 삭제를 클릭합니다(더 큰 혈관의 내피 세포에서 IB₄ 양성 신호가 제거될 때까지 반복).
      참고: IB₄ 염색 신호는 마우스 폐의 동맥 및 정맥의 내피 세포에서 감지됩니다. 폐 미세혈관 발생에 대한 특정 검사를 달성하려면 더 큰 혈관의 내피 세포에서 신호 병소를 균일하게 제거하는 것이 좋습니다.
   10. 목표 신호의 개수를 세고, 분석 > 측정 설정을 클릭하고, 면적, 임계값으로 제한 및 레이블 표시를 선택합니다. 그런 다음 입자 분석을 선택하고 크기: 0-무한대; 원형도 : 0.00-1.00; 쇼 : 과도한 마스크; 요약 을 선택하고 확인을 클릭합니다.
   11. [Summarize Results > File]> [Save as]를 선택합니다.
3. 데이터 분석 및 통계
   1. 동일한 이미지에서 IB₄ 양성 초점과 DAPI 양성 초점의 수를 각각 일치시키고 통합 테이블로 구성합니다.
   2. 표시된 젊은 또는 연령 그룹의 각 엽에 대한 IB₄ 양성 병소 및 DAPI 양성 병소의 총 수를 요약합니다.
      1. IB4_{양성 병}소의 총 수를 각 엽의 총 DAPI 염색 병소 수로 다른 그룹별로 나누어 IB4 양성 병소의 백분율(%)을 계산합니다. 그림 3A와 같이 IB₄ 양성 병소의 수, DAPI 염색 병소의 수 및 IB₄ 양성 병소의 비율(%)을 제시합니다.
   3. 데이터 분석 소프트웨어를 실행하고 새 열 테이블을 만듭니다.
      참고: 여기서는 GraphPad Prism 9를 사용하여 통계 분석을 수행했습니다.
   4. 그룹 A에서 그룹 J까지 순차적으로 "젊은 두개엽", "늙은 두개엽", "젊은 중엽", "오래된 중간엽", "젊은 꼬리엽", "오래된 꼬리엽", "젊은 부속엽", "오래된 액세서리 엽", "젊은 좌엽", "늙은 좌엽"으로 이름을 지정합니다. 그런 다음 해당 IB₄ 양성 초점(%)을 표에 입력합니다(보충 표 1).
   5. 쌍별 비교를 위해 쌍을 이루지 않은 t-검정을 활용하여 두 연령 그룹 간의 해당 지역에서 유의한 차이를 평가합니다. 5개의 로브에 대해 총 5번의 비교를 수행합니다.
   6. 결과 시각화를 위한 그래프를 만듭니다(그림 3B). 막대 차트를 선택하고 그림에 통계 분석을 포함합니다.

결과

주요 기관지와 작은 기도 가지의 병변을 구별하려면 이 두 가지 유형의 기도에서 병변의 연속적인 구조를 관찰하는 것이 중요합니다. 이는 그림 1에 설명된 절단 및 임베딩 절차에 따라 달성할 수 있습니다. 다양한 방향으로 향하고 그물망과 같은 구조를 가진 쥐의 수많은 폐엽을 감안할 때 다른 고형 조직에 비해 붕괴에 더 취약합니다. 대상 부위의...

토론

폐 미세혈관 밀도에 대한 연구는 폐 생리학적 과정을 이해하고 호흡기 질환에 대한 바이오마커를 정의하는 데 중요한 의미를 갖습니다. 폐 순환은 내피 세포의 가느다란 층으로 둘러싸인 광범위한 모세관 표면적을 자랑합니다. 이들 세포와 폐포 상피 세포의 조화로운 병치는 복잡한 가스 교환 과정을 용이하게 하기 위해 특별히 설계된 깨지기 쉬운 폐포-모세혈관 막을 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole	MCE	HY-D0814	Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4	Thermo	I32450	Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer	Abcam	AB104135	Sample Fixation
Antigen Repair Fluid	Biosharp	BL151A	Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette	ActivFlo	39LC-500-1	Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064-50G	Sealing Solution
Cold Plate	Leica	HistoCore Arcadia H	Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven	Taisite	101-0AB	High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade	Leica	14035838383	Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds	Shitai	26155166627	Fixing Tissue Samples
Ethanol	Kelong	CAS 64-17-5	Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150	Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath	Leica	HI1220	Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens	Biosharp	BC004	Water-blocking Agent
Medical Forceps	Shanghai Medical Equipment	N/A	Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope	Nikon	Ts2	Imaging Device
Mounting Media	Jiangyuan	Tasteless	Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax	SCHLEDEN	80200-0014	Fixing Tissue Structure
PBS	Beyotime	C0221A	Wash Buffer
Pentobarbital Sodium	Beijing Chemical Reagent Company	Q/H82-F158-2002	Anesthetic
Rotary Microtome	Biobase	Bk-2258	Preparing Slices
Sterile Scissors	Shanghai Medical Equipment	N/A	segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel	Shanghai Medical Equipment	N/A	Cutting Tissue Samples
Triton	Solarbio	T8200	Permeabilization Solution
Wash-Free Slide	PLATINUM PRO	PRO-04	Fixing Samples for Staining
Xylene	SUM	XK13-011-00031	Tissue De-waxing Solution