量化小鼠跨小叶的肺微血管密度

摘要

在这里，我们描述了一种简单而经济的方案，使用异凝集素 B₄ 的单次染色对整个小鼠肺组织的肺微血管密度进行无偏倚定量。

摘要

肺血管生成的异常交替与肺微血管功能障碍有关，与血管壁完整性、血流调节和气体交换密切相关。在小鼠模型中，肺叶在大小、形状、位置和血管形成方面表现出显着差异，但现有方法在量化微血管密度时缺乏对这些变化的考虑。这种局限性阻碍了肺微血管功能障碍的全面研究和不同小叶之间微血管循环的潜在重塑。我们的方案通过采用两种切片方法来量化肺微血管密度变化，利用小鼠不同叶上气道分支的大小、形状和分布来解决这一差距。然后，我们利用异凝集素 B₄ （IB₄） 染色标记不同切片上的肺微血管内皮细胞，然后使用免费提供的软件 ImageJ 进行无偏倚的微血管密度分析。这里介绍的结果突出了随着年龄的增长，肺小叶微血管密度的变化程度不同，比较了年轻和老年小鼠。该方案为肺微血管密度的无偏量化提供了一种简单且具有成本效益的方法，促进了肺微血管系统的生理和病理方面的研究。

引言

内皮细胞 （EC） 是一种位于血管内层的特殊类型的细胞，覆盖整个动脉和静脉树，在维持血管和器官的稳定性方面起着至关重要的作用¹。肺是高度血管化的器官，在肺部起着重要的生理和病理作用，例如形成血管壁、调节血流、促进气体交换、调节炎症反应、控制血小板活性、分泌参与血管生长的调节物质、修复和维持凝血平衡。

肺微血管内皮细胞 （LMECs） 是肺组织的特异性内皮细胞，特别是在肺的微血管系统（毛细血管）中，将它们与肺部更普遍的动脉和静脉内皮细胞区分开来。这些细胞具有多种功能，包括调节血管张力、控制血管通透性、参与炎症反应的调节和调节血栓形成。它们在肺循环、调节气体交换和营养物质运输中起着至关重要的作用，并参与与肺部相关的各种生理和病理过程，很可能会导致衰老²。此外，肺血管生成的异常交替与肺微血管功能障碍有关³。Larissa L. 等人使用常规内皮细胞标志物 CD31 和空间定位（特别是肺的外围区域），观察到与年轻小鼠（4 个月大）相比，老年小鼠（18 个月大）的微血管内皮细胞密度显著降低⁴。在与哮喘相关的肺部病理学背景下，Makoto H. 等人证明，与对照受试者相比，哮喘患者用抗 IV 胶原染色的支气管活检标本中的血管诱导显着增加⁵。最近，通过引入透射和扫描电子显微镜技术，Maximilian A. 等人报告了死于 Covid-19 或甲型流感 （H1N1） 的患者中与肠敏感和发芽血管生成相关的特征的数量密度显着增加⁶。显然，异常的微血管发生与肺功能障碍有关。然而，目前没有简单、经济的方法可用于量化微血管密度的变化。

在小鼠模型中，肺通常分为五个不同的肺叶:右颅叶、右中叶、右尾叶、左颅叶和左尾叶。每个肺叶在大小、形状、位置和可能的血管形成方面表现出独特的特征，有助于有效的气体交换和潜在的肺循环协同调节。然而，据我们所知，在研究肺微血管变化时，没有方法可以解释这些肺叶之间的差异。

本研究提出了一种对小鼠小叶进行切片的新方法，利用 IB₄（肺微内皮细胞⁷ 的明确标志物）对肺微血管密度进行无偏倚定量评估。这种创新方法通过考虑小鼠单个肺叶的不同特性，解决了更全面地了解小鼠肺微血管改变的需求。作为证明，在衰老小鼠中，肺
在尾叶和左叶内特别观察到微血管密度。该协议强调了将肺叶特异性分析整合到小鼠肺微血管景观变化研究中的重要性。值得注意的是，该方法为寻求全面了解肺发育和病变的生理和病理进展的研究人员提供了有价值的研究参考，超越了血管生成。

研究方案

所有实验均按照四川大学动物研究委员会 （No K2023023） 的伦理准则进行。

1. 小鼠肺叶石蜡切片的制备

1. 从小鼠获取肺组织。
   1. 选择在 6 周和 16 个月时发生的雄性 C57Bl/6 小鼠，以评估不同年龄组小鼠肺部的微血管密度。
   2. 通过腹膜内注射在小鼠中施用 100 mg/kg 戊巴比妥钠。麻醉后通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。打开胸腔并获取肺组织。
2. 准备石蜡切片。
   1. 将组织置于 4% 多聚甲醛溶液中，该溶液是组织体积的 10 倍，以固定组织，以保持其形态和结构并防止降解。
      注意:最近开发了一种新方法，用于在小鼠肺的血管灌注固定过程中给空气充气。据报道，这种方法可以更好地保留气道、肺泡细胞和间质的形态和位置，使其更适合肺组织学研究。对于拥有相应设备和耗材以及自制仪器的实验室，建议使用此方法⁸。
   2. 切开肺叶以确定嵌入方向（图 1）。
      1. 固定 3 小时后，分离五个肺叶（在眼睛的直接观察下），分别嵌入右肺的颅叶、中叶和副肺叶，切片朝向垂直叶与支气管连接的方向。
      2. 将右肺尾叶沿垂直于肺叶-支气管连接处的方向从左到右切成 4 毫米 2 块，并将切片嵌入蜡块中，切割面朝上。
      3. 在左肺叶上切三刀。在主支气管交界处上方横向进行第一次切割，在顶部下方 2 毫米处。在主支气管交界处上方横向进行第二次切割，在顶部下方 5 毫米处。在凸轮末端进行第三次切割，距离顶部下方 8 毫米。丢弃最上面的组织，将剩余的三块包裹在蜡块中，切割面朝上。
         注:当将多个肺块包埋在一起时，可以使用显微镜擦拭纸将它们包裹起来，然后再将它们放入组织包埋盒中以继续脱水过程。
      4. 将组织重新固定在固定剂中 24 小时。
   3. 将组织块放入容器中，在流水下冲洗 15 分钟。
   4. 依次将组织置于以下溶液中:65% 乙醇 30 分钟，75% 乙醇 30 分钟，85% 乙醇 30 分钟，95% 乙醇 I 60 分钟，95% 乙醇 II 60 分钟，无水乙醇 I 60 分钟，无水乙醇 II 60 分钟，70% 乙醇 120 分钟，80% 乙醇 120 分钟， 90% 乙醇 120 分钟，95% 乙醇 120 分钟，无水乙醇 I 120 分钟，无水乙醇 II 120 分钟。
   5. 将组织置于二甲苯 I 中 30 分钟，将二甲苯 II 中放置 30 分钟。
   6. 将组织置于低于 54 °C 的软蜡中 1 小时，硬蜡 I 在 58 °C 下放置 1 小时，硬蜡 II 在 58 °C 下放置 30 分钟。
   7. 选择合适的模具尺寸，填充适量的液体石蜡，并使用镊子将包埋框架中的组织以正确的方向定位在模具中心的包埋框架中。将模具和组织放在包埋机的冷冻区域，然后用镊子轻轻按压组织。
   8. 当石蜡开始略微变白时，迅速将未覆盖的包埋框架放在模具顶部，进行第二次注蜡，密封包埋框架底部的孔。将整个模具转移到冷冻台进行成型。
   9. 将蜡块固定到切片机上并通过粗切和精细修整露出光滑平坦的切割表面后，旋转切片机的轮式曲柄以切割厚度为 4 μm 的切片。
   10. 按顺序将去除的部分平稳地放在水面上。一旦各部分完全展开，在每个部分之间的连接处分离破损的碎片。
   11. 将载玻片倾斜到该部分下方，接触时，以垂直运动缓慢均匀地将载玻片抬出水面。切片将粘附在载玻片上。

2. 免疫荧光染色检测肺微血管系统

1. 将石蜡包埋的切片放入 65 °C 的烘箱中 60 分钟。
2. 将切片放在载玻片架上，并在染色罐中执行以下步骤:将二甲苯 1、二甲苯 2 和二甲苯 3 各浸入 15 分钟，然后浸入二甲苯/乙醇 （1:1） 中 5 分钟，100% 乙醇 #1、100% 乙醇 #2、85% 乙醇、75% 乙醇和蒸馏水各 5 分钟。
3. 用去离子水将修饰的柠檬酸钠抗原修复溶液稀释 50 倍。将微波炉以高功率预热至沸腾，然后将玻片放入抗原提取物中。让玻片在抗原提取物中煮沸 15 分钟，然后自然冷却至室温。
4. 用 PBS 洗涤载玻片两次，每次 5 分钟。用 0.25% Triton 透化两次，每次 10 分钟。
5. 用免疫组织化学笔环绕组织，并在室温 （RT） 下与 5% BSA 孵育 1 小时。用 PBS 洗涤载玻片一次，持续 5 分钟。
6. 进行 Alexa-647 Fluor 偶联的 IB₄ 和 DAPI 染色。
   1. 将 IB₄ 放在冰上，用 1% BSA 以 1:50 的比例稀释。去除圆圈周围多余的水，向每个组织切片中加入 50-100 μL 稀释的 IB₄ ，并在 4 °C 下孵育过夜（从此步骤开始，在黑暗中执行所有程序）。
   2. 用 PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。用 0.25% Triton 透化 10 分钟。
7. 用 PBS 以 1:10 的比例稀释 DAPI （10 μg/mL），并在 RT 下向每个组织切片中添加 50-100 μL，持续 5 分钟。
8. 用 PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。
9. 在载玻片上滴一滴抗褪色封固剂，避免光照。风干玻片，然后在荧光显微镜下观察和捕获细胞核和目标信号的图像。

3. 肺微血管密度的定量

1. 获取图像。
   1. 在 10 倍目标下观察年轻人和老年人每个肺叶的肺微血管密度信号和 DAPI 信号。
   2. 根据观测结果，标准化每个通道的光源强度和曝光时间。捕获覆盖每个肺叶整个区域的双通道图像。将图像保存为具有两个通道的 ND2 格式（图 2）。
2. 使用图像 J 进行定量（补充图 1）。
   1. 启动 ImageJ 软件。
   2. 将指示的图像导入 ImageJ，然后继续加载并选择它们。相应地拆分通道。为 DAPI 和 IB₄ 通道加载 ND2 格式的文件。
   3. 导航到 分析>设置比例>将图像参数配置为 0.48 μm/像素 （取决于摄影参数）， >全局>确定。
   4. 设置相同的显示范围以调整图像呈现效果。选择 图像>调整>亮度/对比度>设置。分别设置两个通道的显示范围，IB₄:0-10000;DAPI:0-20000。
   5. 要消除背景信号的影响，请继续执行以下步骤:单击 处理 > 数学 > 减去;根据魔 术棒 工具在背景上检测到的信号值减去背景信号，IB₄:3000;DAPI:300 的。
   6. 要选择与原始图像最匹配的阈值，请转到 Image > Duplicate。
   7. 选择 原始图像 和 复制 图像 > 类型 > 8 位。
   8. 选择合适的阈值以精确识别肺微血管系统。点击 图片 > 调整阈值 > Intermodes > （根据原始图表选择最真实的阈值），勾选 > 深色背景 > 应用.
   9. 消除小鼠肺部大血管（包括动脉和静脉）的 IB₄ 阳性信号:使用 魔术棒 工具选择与复制图像相比较大的血管，然后单击 "删除"（重复此操作，直到较大血管的内皮细胞中的 IB₄ 阳性信号被去除）。
      注意:在小鼠肺动脉和静脉的内皮细胞中检测到 IB₄ 染色信号。为了实现对肺微血管系统的发生进行特异性检查，建议均匀去除较大血管内皮细胞中的信号灶。
   10. 计算目标信号的数量，单击 Analyze > Set Measurements，然后勾选 Area、Limit to Threshold 和 Display Label。然后选择 Analyze Particles 并设置 Size: 0-infinity;圆度:0.00-1.00;显示:过度蒙版;勾选 总结 并单击 OK。
   11. 选择 Summarize Results > File > Save as （另存为）。
3. 数据分析与统计
   1. 将同一图像中 IB₄ 阳性病灶和 DAPI 阳性病灶的数量分别匹配并组织到一个统一的表格中。
   2. 总结指定年轻组或年龄组中每个肺叶的 IB₄ 阳性病灶和 DAPI 阳性病灶的总数。
      1. 通过将 IB₄ 阳性病灶的总数除以不同组每个叶中 DAPI 染色病灶的总数来计算 IB4 阳性病灶的百分比 （%）。如图 3A 所示，显示 IB₄ 阳性病灶的数量、DAPI 染色病灶的数量和 IB₄ 阳性病灶的百分比 （%）。
   3. 启动数据分析软件并创建一个新的 table 表。
      注意:GraphPad Prism 9 在这里用于统计分析。
   4. 依次将它们从 A 组命名为 J 组，分别为 "年轻颅叶"、"老颅叶"、"年轻中叶"、"老中叶"、"年轻尾叶"、"老尾叶"、"年轻副叶"、"老左叶"、"老左叶"。然后，将相应的 IB₄ 阳性病灶 （%） 输入到表中（补充表 1）。
   5. 利用未配对的 t 检验进行成对比较，以评估两个年龄组之间相应区域的显著差异。对 5 个叶进行总共 5 次比较。
   6. 创建用于结果可视化的图表（图 3B）。选择条形图并在图中包含统计分析。

结果

为了区分主要支气管分支和小气道分支的病变，确保观察到这两种类型的气道病变的连续结构至关重要。这可以通过遵循 图 1 中概述的切割和嵌入程序来实现。鉴于小鼠的肺叶众多，这些肺叶朝向不同方向并具有网状结构，因此与其他实体组织相比，它们更容易塌陷。为了清晰直观地观察目标区域的病变，建议在切割前将组织样本固定数小时。

...

讨论

肺微血管密度的研究对于理解肺部生理过程以及定义呼吸系统疾病的生物标志物具有重要意义。肺循环拥有广泛的毛细血管表面积，被一层细长的内皮细胞包裹。这些细胞和肺泡上皮细胞的和谐并置产生了一个脆弱的肺泡毛细血管膜，该膜专门设计用于促进气体交换的复杂过程³。这种细胞间通讯在调节一系列肺生理过程中起着关键作用，强调了这种密?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole	MCE	HY-D0814	Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4	Thermo	I32450	Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer	Abcam	AB104135	Sample Fixation
Antigen Repair Fluid	Biosharp	BL151A	Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette	ActivFlo	39LC-500-1	Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064-50G	Sealing Solution
Cold Plate	Leica	HistoCore Arcadia H	Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven	Taisite	101-0AB	High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade	Leica	14035838383	Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds	Shitai	26155166627	Fixing Tissue Samples
Ethanol	Kelong	CAS 64-17-5	Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150	Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath	Leica	HI1220	Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens	Biosharp	BC004	Water-blocking Agent
Medical Forceps	Shanghai Medical Equipment	N/A	Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope	Nikon	Ts2	Imaging Device
Mounting Media	Jiangyuan	Tasteless	Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax	SCHLEDEN	80200-0014	Fixing Tissue Structure
PBS	Beyotime	C0221A	Wash Buffer
Pentobarbital Sodium	Beijing Chemical Reagent Company	Q/H82-F158-2002	Anesthetic
Rotary Microtome	Biobase	Bk-2258	Preparing Slices
Sterile Scissors	Shanghai Medical Equipment	N/A	segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel	Shanghai Medical Equipment	N/A	Cutting Tissue Samples
Triton	Solarbio	T8200	Permeabilization Solution
Wash-Free Slide	PLATINUM PRO	PRO-04	Fixing Samples for Staining
Xylene	SUM	XK13-011-00031	Tissue De-waxing Solution