Quantificando a densidade microvascular pulmonar em camundongos através de lóbulos

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo simples e econômico para realizar a quantificação imparcial da densidade microvascular pulmonar para tecido pulmonar de camundongos inteiros usando coloração única de Isolectina B₄.

Resumo

A alternância anormal da angiogênese pulmonar está relacionada à disfunção microvascular pulmonar e está profundamente ligada à integridade da parede vascular, regulação do fluxo sanguíneo e troca gasosa. Em modelos murinos, os lobos pulmonares exibem diferenças significativas de tamanho, forma, localização e vascularização, mas os métodos existentes não levam em consideração essas variações ao quantificar a densidade microvascular. Essa limitação dificulta o estudo abrangente da disfunção microvascular pulmonar e o potencial remodelamento da circulação microvasculatura em diferentes lóbulos. Nosso protocolo aborda essa lacuna empregando dois métodos de seccionamento para quantificar as alterações da densidade microvascular pulmonar, aproveitando o tamanho, a forma e a distribuição dos ramos das vias aéreas em lobos distintos em camundongos. Em seguida, utilizamos a coloração com isolectina B₄ (IB₄) para marcar células endoteliais microvasculares pulmonares em diferentes fatias, seguida de análise imparcial da densidade microvascular usando o software ImageJ disponível gratuitamente. Os resultados apresentados aqui destacam vários graus de alterações na densidade microvascular nos lóbulos pulmonares com o envelhecimento, comparando camundongos jovens e velhos. Este protocolo oferece uma abordagem direta e econômica para quantificação imparcial da densidade microvascular pulmonar, facilitando a pesquisa sobre aspectos fisiológicos e patológicos da microvasculatura pulmonar.

Introdução

As células endoteliais (CEs) são um tipo especial de célula localizada no revestimento interno dos vasos sanguíneos, cobrindo toda a árvore arterial e venosa e desempenhando um papel crucial na manutenção da estabilidade dos vasos sanguíneos e órgãos¹. Os pulmões são órgãos altamente vascularizados e desempenham papéis fisiológicos e patológicos essenciais nos pulmões, como formar a parede vascular, regular o fluxo sanguíneo, facilitar as trocas gasosas, modular as respostas inflamatórias, controlar a atividade plaquetária, secretar substâncias reguladoras envolvidas no crescimento vascular, reparar e manter o equilíbrio da coagulação.

As células endoteliais microvasculares pulmonares (LMECs) são células endoteliais específicas do tecido pulmonar, particularmente na microvasculatura (capilares) dos pulmões, distinguindo-as das células endoteliais arteriais e venosas mais generalizadas nos pulmões. Essas células têm várias funções, incluindo regular o tônus vascular, controlar a permeabilidade vascular, participar da regulação das respostas inflamatórias e regular a formação de trombos. Desempenham um papel crucial na circulação pulmonar, regulando as trocas gasosas e o transporte de nutrientes, e estão envolvidos em vários processos fisiológicos e patológicos relacionados aos pulmões, passíveis de envelhecimento². Além disso, a alternância anormal da angiogênese pulmonar está relacionada à disfunção microvascular pulmonar³. Empregando o marcador convencional de células endoteliais CD31 e localização espacial (especificamente, as regiões periféricas dos pulmões), Larissa L. et al. observaram uma diminuição significativa na densidade de células endoteliais microvasculares em camundongos idosos (18 meses de idade) em comparação com seus colegas mais jovens (4 meses de idade)⁴. No contexto da patologia pulmonar associada à asma, Makoto H. e col. demonstraram um aumento substancial na indução de vasos em espécimes de biópsia brônquica corados com anticolágeno IV de pacientes asmáticos em comparação com indivíduos controles⁵. Recentemente, ao introduzir as técnicas de microscopia eletrônica de transmissão e varredura, Maximilian A. et al. relataram um aumento notável na densidade numérica de características relacionadas à angiogênese intussusceptiva e germinativa em pacientes que morreram de Covid-19 ou Influenza A (H1N1)⁶. Evidentemente, a gênese microvascular anormal está ligada à disfunção pulmonar. No entanto, atualmente não existe um método simples e econômico disponível para quantificar as mudanças na densidade microvascular.

Em modelos murinos, os pulmões são convencionalmente segmentados em cinco lobos distintos: cranial direito, médio direito, caudal direito, cranial esquerdo e caudal esquerdo. Cada lobo exibe características únicas em termos de tamanho, forma, localização e provável vascularização, contribuindo para a troca gasosa eficiente e regulação potencialmente sinérgica da circulação pulmonar. No entanto, até onde sabemos, nenhuma metodologia leva em conta as diferenças entre esses lobos pulmonares ao investigar alterações microvasculares pulmonares.

Este estudo apresenta um novo método para seccionamento de lóbulos em camundongos, utilizando IB₄, um marcador bem definido de células microendoteliais pulmonares⁷, para avaliação quantitativa imparcial da densidade microvascular pulmonar. Essa abordagem inovadora aborda a necessidade de uma compreensão mais abrangente das alterações microvasculares nos pulmões murinos, considerando as propriedades distintas dos lobos individuais dos camundongos. Como demonstração, em camundongos idosos, uma redução significativa na
A densidade microvascular é observada especificamente no lobo caudal e no lobo esquerdo. O protocolo ressalta a importância de integrar análises específicas do lobo nas investigações de mudanças na paisagem microvascular dos pulmões murinos. Notavelmente, este método fornece referências de pesquisa valiosas para investigadores que buscam uma compreensão abrangente da progressão fisiológica e patológica dos desenvolvimentos e lesões pulmonares, estendendo-se além da angiogênese.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados seguindo as diretrizes éticas do Comitê de Pesquisa Animal da Universidade de Sichuan (No K2023023).

1. Preparação de seções de parafina para lobos pulmonares de camundongos

1. Adquira tecido pulmonar do camundongo.
   1. Escolha camundongos C57Bl/6 machos com 6 semanas e 16 meses para avaliar a densidade microvascular em pulmões de camundongos em diferentes faixas etárias.
   2. Administrar 100 mg/kg de pentobarbital sódico por injeção intraperitoneal em camundongos. Eutanásia dos camundongos por luxação cervical após anestesia. Abra a cavidade torácica e obtenha tecido pulmonar.
2. Prepare seções de parafina.
   1. Fixe o tecido colocando-o em uma solução de paraformaldeído a 4% que é 10 vezes o volume do tecido para preservar sua morfologia e estrutura e evitar a degradação.
      NOTA: Um novo método recente foi desenvolvido para inflar o ar durante a perfusão-fixação vascular em pulmões murinos. Este método é relatado para preservar melhor morfologia e localização das vias aéreas, células alveolares e interstício, tornando-os mais adequados para estudos histológicos pulmonares. Este método é recomendado para laboratórios com os equipamentos e consumíveis correspondentes com instrumentos fabricados internamente⁸.
   2. Corte o lóbulo pulmonar para determinar a direção de incorporação (Figura 1).
      1. Após 3 h de fixação, separar os cinco lobos pulmonares (sob observação direta dos olhos) e incorporar os lobos cranial, médio e acessório do pulmão direito separadamente, com cortes orientados na direção da conexão lobo-brônquio vertical.
      2. Corte o lobo caudal do pulmão direito em 2 pedaços a 4 mm da esquerda para a direita na direção perpendicular à conexão lobo pulmonar-brônquio e incorpore as fatias em um bloco de cera com a superfície cortada voltada para cima.
      3. Faça três cortes no lobo do pulmão esquerdo. Faça o primeiro corte transversalmente acima da junção brônquica principal, 2 mm abaixo do topo. Faça o segundo corte transversalmente acima da junção brônquica principal, 5 mm abaixo do topo. Faça o terceiro corte no final do lóbulo, 8 mm abaixo do topo. Descarte o pedaço superior de tecido e envolva os três pedaços restantes em um bloco de cera com a superfície cortada voltada para cima.
         NOTA: Ao incorporar várias peças de pulmão, um papel de limpeza de microscópio pode ser usado para embrulhá-las antes de colocá-las em uma caixa de incorporação de lenços de papel para continuar o processo de desidratação.
      4. Fixe novamente o tecido no fixador por 24 h.
   3. Coloque o bloco de tecido em um recipiente e lave-o em água corrente por 15 min.
   4. Colocar sequencialmente o tecido nas seguintes soluções: etanol a 65% durante 30 min, etanol a 75% durante 30 min, etanol a 85% durante 30 min, etanol a 95% I durante 60 min, etanol a 95% II durante 60 min, etanol absoluto I durante 60 min, etanol absoluto II durante 60 min, etanol a 70% durante 120 min, etanol a 80% durante 120 min, Etanol a 90% por 120 min, etanol a 95% por 120 min, etanol absoluto I por 120 min e etanol absoluto II por 120 min.
   5. Coloque o tecido em xileno I por 30 min e xileno II por 30 min.
   6. Colocar o tecido em cera mole a uma temperatura inferior a 54 °C durante 1 h, cera dura I a 58 °C durante 1 h e cera dura II a 58 °C durante 30 min.
   7. Selecione um tamanho de molde adequado, preencha-o com uma quantidade adequada de parafina líquida e use uma pinça para posicionar o tecido na estrutura de incorporação no centro do molde na direção correta. Coloque o molde e o tecido na área de congelamento da máquina de incorporação e pressione suavemente o tecido com uma pinça.
   8. Quando a parafina começar a clarear ligeiramente, posicione rapidamente a estrutura de incorporação descoberta no topo do molde e execute a segunda injeção de cera, selando os orifícios na parte inferior da estrutura de incorporação. Transfira todo o molde para a mesa de congelamento para moldagem.
   9. Depois de prender o bloco de cera no fatiador e revelar a superfície de corte lisa e plana por meio de um corte áspero e fino, gire a manivela da roda do micrótomo para cortar fatias com uma espessura de 4 μm.
   10. Coloque suavemente as seções removidas na superfície da água em ordem sequencial. Uma vez que as seções estejam totalmente estendidas, separe as peças quebradas nas junções entre cada seção.
   11. Incline uma lâmina de vidro por baixo da seção e, ao entrar em contato, levante lenta e uniformemente a lâmina para fora da superfície da água em um movimento vertical. As seções irão aderir à lâmina de vidro.

2. Coloração de imunofluorescência para detecção de microvasculatura pulmonar

1. Coloque as fatias embebidas em parafina em um forno a 65 °C por 60 min.
2. Coloque as fatias em uma grade deslizante e execute as seguintes etapas em frascos de coloração: imergir xileno 1, xileno 2 e xileno 3 por 15 min cada, seguido de imersão em xileno/etanol (1:1) por 5 min, 100% etanol #1, 100% etanol #2, 85% etanol, 75% etanol e água destilada por 5 min cada.
3. Diluir a solução de recuperação do antígeno de citrato de sódio modificado 50 vezes com água deionizada. Pré-aqueça o micro-ondas em potência alta até ferver e, em seguida, coloque a lâmina no extrato de antígeno. Deixe a lâmina ferver no extrato de antígeno por 15 min e depois esfrie naturalmente até a temperatura ambiente.
4. Lave as lâminas duas vezes com PBS por 5 min cada. Permeabilize com 0,25% de Triton duas vezes por 10 min cada.
5. Circunde o tecido com uma caneta de imuno-histoquímica e incube-o com 5% de BSA à temperatura ambiente (RT) por 1 h. Lave as lâminas uma vez com PBS por 5 min.
6. Execute a coloração Alexa-647 Fluor conjugada IB₄ e DAPI.
   1. Mantenha o IB₄ no gelo e dilua-o 1:50 com 1% de BSA. Remova o excesso de água ao redor do círculo, adicione 50-100 μL do IB₄ diluído a cada seção de tecido e incube durante a noite a 4 ° C (a partir desta etapa, execute todos os procedimentos no escuro).
   2. Lave as lâminas três vezes com PBS por 5 min cada. Permeabilize com 0,25% de Triton por 10 min.
7. Diluir o DAPI (10 μg/ml) com PBS na proporção de 1:10 e adicionar 50-100 μL a cada secção de tecido à RT durante 5 min.
8. Lave as lâminas três vezes com PBS por 5 min cada.
9. Aplique uma gota de meio de montagem anti-desbotamento nas lâminas, evitando a exposição à luz. Seque a lâmina ao ar e, em seguida, observe e capture imagens do núcleo e dos sinais do alvo sob um microscópio de fluorescência.

3. Quantificação da densidade microvascular pulmonar

1. Adquira imagens.
   1. Observe os sinais de densidade microvascular pulmonar e os sinais DAPI sob uma objetiva de 10x para cada lobo pulmonar nas faixas etárias jovem e idosa.
   2. Padronize a intensidade da fonte de luz e o tempo de exposição para cada canal com base nos resultados da observação. Capture as imagens de canal duplo cobrindo toda a área de cada lobo pulmonar. Salve a imagem no formato ND2 com dois canais (Figura 2).
2. Quantificar utilizando a imagem J (Figura 1 suplementar).
   1. Inicie o software ImageJ.
   2. Importe as imagens indicadas para o ImageJ e, em seguida, prossiga para carregá-las e selecione-as. Divida os canais de acordo. Carregue um arquivo no formato ND2 para os canais DAPI e IB₄ .
   3. Navegue até Analisar > Definir escala > Configure os parâmetros da imagem como 0,48 μm/pixel (dependendo dos parâmetros da fotografia) > Global > OK.
   4. Defina o mesmo intervalo de exibição para ajustar o efeito de apresentação da imagem. Selecione Imagem> ajuste > conjunto de > brilho/contraste. Defina a faixa de exibição para cada um dos dois canais separadamente, IB₄: 0-10000; DAPI: 0-20000.
   5. Para eliminar a influência dos sinais de fundo, prossiga com as seguintes etapas: Clique em Processar > matemática > Subtrair; Subtraia o sinal de fundo com base nos valores de sinal detectados pela ferramenta Varinha Mágica no fundo, IB₄: 3000; DAPI:300.
   6. Para selecionar o valor limite que melhor se alinha com a imagem original, vá para Imagem > Duplicar.
   7. Selecione a imagem original e duplicada > Tipo > 8 bits.
   8. Selecione um valor limite apropriado para identificar com precisão a microvasculatura pulmonar. Clique na imagem > Ajustar > limite > intermodos (escolha o limite mais realista em relação ao diagrama original), marque > fundo escuro > Aplicar.
   9. Elimine os sinais positivos do IB₄ de grandes vasos sanguíneos no pulmão do camundongo, incluindo artérias e veias: Use a ferramenta Varinha Mágica para selecionar vasos sanguíneos maiores em comparação com a imagem duplicada e clique em Excluir (repita isso até que os sinais positivos do IB₄ nas células endoteliais de vasos sanguíneos maiores sejam removidos).
      NOTA: Os sinais de coloração IB₄ são detectados nas células endoteliais das artérias e veias do pulmão do camundongo. Para obter um exame específico das ocorrências de microvasculatura pulmonar, recomenda-se remover uniformemente os focos de sinal nas células endoteliais de vasos sanguíneos maiores.
   10. Conte o número de sinais de destino, clique em Analisar > Definir Medições e marque Área, Limite ao Limite e Rótulo de Exibição. Em seguida, selecione Analisar partículas e defina Tamanho: 0-infinito; Circularidade: 0,00-1,00; Mostrar: Máscaras excessivas; marque Resumir e clique em OK.
   11. Escolha Resumir resultados > arquivo > Salvar como.
3. Análise de dados e estatística
   1. Combine e organize o número de focos positivos IB₄ e focos positivos DAPI, respectivamente, na mesma imagem em uma tabela unificada.
   2. Resuma o número total de focos positivos IB₄ e focos positivos DAPI para cada lobo em grupos jovens ou etários indicados.
      1. Calcule a porcentagem de focos positivos para IB4 (%) dividindo o número total de focos positivos para IB₄ pelo número total de focos de coloração DAPI em cada lobo por diferentes grupos. Apresente o número de focos positivos para IB₄ , o número de focos de coloração DAPI e a porcentagem de focos positivos para IB₄ (%) conforme mostrado na Figura 3A.
   3. Inicie o software de análise de dados e crie uma nova tabela de colunas.
      NOTA: O GraphPad Prism 9 foi usado aqui para análise estatística.
   4. Nomeie-os sequencialmente do Grupo A ao Grupo J como "Lobo craniano jovem", "Lobo craniano antigo", "Lobo médio jovem", "Lobo médio antigo", "Lobo caudal jovem", "Lobo caudal antigo", "Lobo acessório jovem", "Lobo acessório antigo", "Lobo esquerdo jovem", "Lobo esquerdo antigo". Em seguida, insira os focos positivos IB₄ correspondentes (%) na tabela (Tabela Suplementar 1).
   5. Utilize testes t não pareados para comparação de pares para avaliar diferenças significativas nas regiões correspondentes entre as duas faixas etárias. Realize um total de cinco comparações para cinco lóbulos.
   6. Crie um gráfico para visualização de resultados (Figura 3B). Opte por um gráfico de barras e inclua a análise estatística na figura.

Resultados

Para distinguir entre as lesões nos brônquios principais e nos ramos das pequenas vias aéreas, é fundamental garantir que a estrutura contínua das lesões nesses dois tipos de vias aéreas seja observada. Isso pode ser alcançado seguindo os procedimentos de corte e incorporação descritos na Figura 1. Dados os numerosos lobos pulmonares em camundongos, que são orientados em várias direções e possuem uma estrutura semelhante a uma malha, eles são ...

Discussão

O estudo da densidade microvascular pulmonar tem implicações significativas para a compreensão dos processos fisiológicos pulmonares e também para a definição de biomarcadores(es) para doenças respiratórias. A circulação pulmonar possui uma extensa área de superfície capilar envolvida por uma fina camada de células endoteliais. A justaposição harmoniosa dessas células e células epiteliais alveolares dá origem a uma frágil membrana alvéolo-capilar projetada especifica...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole	MCE	HY-D0814	Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4	Thermo	I32450	Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer	Abcam	AB104135	Sample Fixation
Antigen Repair Fluid	Biosharp	BL151A	Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette	ActivFlo	39LC-500-1	Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064-50G	Sealing Solution
Cold Plate	Leica	HistoCore Arcadia H	Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven	Taisite	101-0AB	High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade	Leica	14035838383	Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds	Shitai	26155166627	Fixing Tissue Samples
Ethanol	Kelong	CAS 64-17-5	Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150	Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath	Leica	HI1220	Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens	Biosharp	BC004	Water-blocking Agent
Medical Forceps	Shanghai Medical Equipment	N/A	Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope	Nikon	Ts2	Imaging Device
Mounting Media	Jiangyuan	Tasteless	Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax	SCHLEDEN	80200-0014	Fixing Tissue Structure
PBS	Beyotime	C0221A	Wash Buffer
Pentobarbital Sodium	Beijing Chemical Reagent Company	Q/H82-F158-2002	Anesthetic
Rotary Microtome	Biobase	Bk-2258	Preparing Slices
Sterile Scissors	Shanghai Medical Equipment	N/A	segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel	Shanghai Medical Equipment	N/A	Cutting Tissue Samples
Triton	Solarbio	T8200	Permeabilization Solution
Wash-Free Slide	PLATINUM PRO	PRO-04	Fixing Samples for Staining
Xylene	SUM	XK13-011-00031	Tissue De-waxing Solution