Quantificando a densidade microvascular pulmonar em camundongos através de lóbulos

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo simples e econômico para realizar a quantificação imparcial da densidade microvascular pulmonar para tecido pulmonar de camundongos inteiros usando coloração única de Isolectina B₄.

Resumo

A alternância anormal da angiogênese pulmonar está relacionada à disfunção microvascular pulmonar e está profundamente ligada à integridade da parede vascular, regulação do fluxo sanguíneo e troca gasosa. Em modelos murinos, os lobos pulmonares exibem diferenças significativas de tamanho, forma, localização e vascularização, mas os métodos existentes não levam em consideração essas variações ao quantificar a densidade microvascular. Essa limitação dificulta o estudo abrangente da disfunção microvascular pulmonar e o potencial remodelamento da circulação microvasculatura em diferentes lóbulos. Nosso protocolo aborda essa lacuna empregando dois métodos de seccionamento para quantificar as alterações da densidade microvascular pulmonar, aproveitando o tamanho, a forma e a distribuição dos ramos das vias aéreas em lobos distintos em camundongos. Em seguida, utilizamos a coloração com isolectina B₄ (IB₄) para marcar células endoteliais microvasculares pulmonares em diferentes fatias, seguida de análise imparcial da densidade microvascular usando o software ImageJ disponível gratuitamente. Os resultados apresentados aqui destacam vários graus de alterações na densidade microvascular nos lóbulos pulmonares com o envelhecimento, comparando camundongos jovens e velhos. Este protocolo oferece uma abordagem direta e econômica para quantificação imparcial da densidade microvascular pulmonar, facilitando a pesquisa sobre aspectos fisiológicos e patológicos da microvasculatura pulmonar.

Introdução

As células endoteliais (CEs) são um tipo especial de célula localizada no revestimento interno dos vasos sanguíneos, cobrindo toda a árvore arterial e venosa e desempenhando um papel crucial na manutenção da estabilidade dos vasos sanguíneos e órgãos¹. Os pulmões são órgãos altamente vascularizados e desempenham papéis fisiológicos e patológicos essenciais nos pulmões, como formar a parede vascular, regular o fluxo sanguíneo, facilitar as trocas gasosas, modular as respostas inflamatórias, controlar a atividade plaquetária, secretar substâncias reguladoras envolvidas no crescimento vascula....

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados seguindo as diretrizes éticas do Comitê de Pesquisa Animal da Universidade de Sichuan (No K2023023).

1. Preparação de seções de parafina para lobos pulmonares de camundongos

1. Adquira tecido pulmonar do camundongo.
   1. Escolha camundongos C57Bl/6 machos com 6 semanas e 16 meses para avaliar a densidade microvascular em pulmões de camundongos em diferentes faixas etárias.
   2. Administrar 100 mg/kg de pentobarbital sódico por injeção intraperitoneal em camundongos. Eutanásia dos camundongos por luxação cervical após anestesia. Abra a ca....

Discussão

O estudo da densidade microvascular pulmonar tem implicações significativas para a compreensão dos processos fisiológicos pulmonares e também para a definição de biomarcadores(es) para doenças respiratórias. A circulação pulmonar possui uma extensa área de superfície capilar envolvida por uma fina camada de células endoteliais. A justaposição harmoniosa dessas células e células epiteliais alveolares dá origem a uma frágil membrana alvéolo-capilar projetada especifica.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole	MCE	HY-D0814	Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4	Thermo	I32450	Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer	Abcam	AB104135	Sample Fixation
Antigen Repair Fluid	Biosharp	BL151A	Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette	ActivFlo	39LC-500-1	Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064-50G	Sealing Solution
Cold Plate	Leica	HistoCore Arcadia H	Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven	Taisite	101-0AB	High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade	Leica	14035838383	Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds	Shitai	26155166627	Fixing Tissue Samples
Ethanol	Kelong	CAS 64-17-5	Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150	Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath	Leica	HI1220	Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens	Biosharp	BC004	Water-blocking Agent
Medical Forceps	Shanghai Medical Equipment	N/A	Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope	Nikon	Ts2	Imaging Device
Mounting Media	Jiangyuan	Tasteless	Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax	SCHLEDEN	80200-0014	Fixing Tissue Structure
PBS	Beyotime	C0221A	Wash Buffer
Pentobarbital Sodium	Beijing Chemical Reagent Company	Q/H82-F158-2002	Anesthetic
Rotary Microtome	Biobase	Bk-2258	Preparing Slices
Sterile Scissors	Shanghai Medical Equipment	N/A	segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel	Shanghai Medical Equipment	N/A	Cutting Tissue Samples
Triton	Solarbio	T8200	Permeabilization Solution
Wash-Free Slide	PLATINUM PRO	PRO-04	Fixing Samples for Staining
Xylene	SUM	XK13-011-00031	Tissue De-waxing Solution