Quantification de la densité microvasculaire pulmonaire chez la souris à travers les lobules

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole simple et économique pour effectuer une quantification non biaisée de la densité microvasculaire pulmonaire pour des tissus pulmonaires de souris entières en utilisant une coloration unique de l’isolectine B₄.

Résumé

L’alternance anormale de l’angiogenèse pulmonaire est liée à un dysfonctionnement microvasculaire pulmonaire et est profondément liée à l’intégrité de la paroi vasculaire, à la régulation du flux sanguin et aux échanges gazeux. Dans les modèles murins, les lobes pulmonaires présentent des différences significatives de taille, de forme, d’emplacement et de vascularisation, mais les méthodes existantes ne tiennent pas compte de ces variations lors de la quantification de la densité microvasculaire. Cette limitation entrave l’étude complète du dysfonctionnement microvasculaire pulmonaire et le remodelage potentiel de la circulation microvasculaire à travers différents lobules. Notre protocole comble cette lacune en utilisant deux méthodes de sectionnement pour quantifier les changements de densité microvasculaire pulmonaire, en exploitant la taille, la forme et la distribution des branches des voies respiratoires à travers des lobes distincts chez la souris. Nous utilisons ensuite la coloration à l’isolectine B₄ (IB₄) pour marquer les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires sur différentes tranches, suivie d’une analyse non biaisée de la densité microvasculaire à l’aide du logiciel ImageJ disponible gratuitement. Les résultats présentés ici mettent en évidence divers degrés de changements de densité microvasculaire dans les lobules pulmonaires avec le vieillissement, en comparant des souris jeunes et âgées. Ce protocole offre une approche simple et rentable pour la quantification non biaisée de la densité microvasculaire pulmonaire, facilitant la recherche sur les aspects physiologiques et pathologiques de la microvascularisation pulmonaire.

Introduction

Les cellules endothéliales (CE) sont un type spécial de cellules situées sur la paroi interne des vaisseaux sanguins, couvrant l’ensemble de l’arbre artériel et veineux et jouant un rôle crucial dans le maintien de la stabilité des vaisseaux sanguins et des organes¹. Les poumons sont des organes hautement vascularisés et jouent des rôles physiologiques et pathologiques essentiels dans les poumons, tels que la formation de la paroi vasculaire, la régulation du flux sanguin, la facilitation des échanges gazeux, la modulation des réponses inflammatoires, le contrôle de l’activité plaquettaire, la sécrétion de substances régulatrices impliquées dans la croissance vasculaire, la réparation et le maintien de l’équilibre de la coagulation.

Les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (LMEC) sont des cellules endothéliales spécifiques du tissu pulmonaire, en particulier dans la microvascularisation (capillaires) des poumons, ce qui les distingue des cellules endothéliales artérielles et veineuses plus généralisées des poumons. Ces cellules ont diverses fonctions, notamment la régulation du tonus vasculaire, le contrôle de la perméabilité vasculaire, la participation à la régulation des réponses inflammatoires et la régulation de la formation de thrombus. Ils jouent un rôle crucial dans la circulation pulmonaire, régulant les échanges gazeux et le transport des nutriments, et sont impliqués dans divers processus physiologiques et pathologiques liés aux poumons, probablement pour le vieillissement². De plus, l’alternance anormale de l’angiogenèse pulmonaire est liée à un dysfonctionnement microvasculaire pulmonaire3^. En utilisant le marqueur conventionnel des cellules endothéliales CD31 et la localisation spatiale (en particulier, les régions périphériques des poumons), Larissa L. et al. ont observé une diminution significative de la densité des cellules endothéliales microvasculaires chez les souris âgées (18 mois) par rapport à leurs homologues plus jeunes (4 mois)⁴. Dans le contexte de la pathologie pulmonaire associée à l’asthme, Makoto H. et al. ont démontré une augmentation substantielle de l’induction vasculaire dans des échantillons de biopsie bronchique colorés avec de l’anti-collagène IV de patients asthmatiques par rapport aux sujets témoins⁵. Récemment, en introduisant les techniques de transmission et de microscopie électronique à balayage, Maximilian A. et al. ont rapporté une augmentation notable de la densité numérique des caractéristiques liées à l’angiogenèse insensible et germinative chez les patients décédés du Covid-19 ou de la grippe A (H1N1)⁶. De toute évidence, la genèse microvasculaire anormale est liée à un dysfonctionnement pulmonaire. Cependant, il n’existe actuellement aucune méthode simple et économique pour quantifier les changements de densité microvasculaire.

Dans les modèles murins, les poumons sont conventionnellement segmentés en cinq lobes distincts : crâne droit, milieu droit, caudale droite, crâne gauche et caudale gauche. Chaque lobe présente des caractéristiques uniques en termes de taille, de forme, d’emplacement et de vascularisation probable, contribuant à un échange gazeux efficace et à une régulation potentiellement synergique de la circulation pulmonaire. Cependant, à notre connaissance, aucune méthodologie ne tient compte des différences entre ces lobes pulmonaires lors de l’étude des changements microvasculaires pulmonaires.

Cette étude présente une nouvelle méthode de sectionnement des lobules chez la souris, en utilisant IB₄, un marqueur bien défini des cellules micro-endothéliales pulmonaires⁷, pour une évaluation quantitative non biaisée de la densité microvasculaire pulmonaire. Cette approche novatrice répond au besoin d’une compréhension plus complète des altérations microvasculaires dans les poumons murins en tenant compte des propriétés distinctes des lobes individuels des souris. À titre de démonstration, chez les souris vieillissantes, une réduction significative de la
La densité microvasculaire est observée spécifiquement dans le lobe caudal et le lobe gauche. Le protocole souligne l’importance d’intégrer des analyses spécifiques aux lobes dans les études sur les changements dans le paysage microvasculaire des poumons murins. Cette méthode fournit notamment des références de recherche précieuses pour les chercheurs qui cherchent à comprendre de manière exhaustive la progression physiologique et pathologique des développements et des lésions pulmonaires, allant au-delà de l’angiogenèse.

Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives éthiques du Comité de recherche animale de l’Université du Sichuan (n° K2023023).

1. Préparation de coupes de paraffine pour les lobes pulmonaires de souris

1. Acquérir du tissu pulmonaire de la souris.
   1. Choisissez des souris mâles C57Bl/6 à 6 semaines et 16 mois pour évaluer la densité microvasculaire dans les poumons de souris dans différents groupes d’âge.
   2. Administrer 100 mg/kg de pentobarbital sodique par injection intrapéritonéale chez la souris. Euthanasier les souris par luxation cervicale après anesthésie. Ouvrez la cavité thoracique et prélevez du tissu pulmonaire.
2. Préparez des sections de paraffine.
   1. Fixez le tissu en le plaçant dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % soit 10 fois le volume du tissu pour préserver sa morphologie et sa structure et prévenir sa dégradation.
      REMARQUE : Une nouvelle méthode récente a été mise au point pour gonfler l’air lors de la perfusion-fixation vasculaire dans les poumons murins. Cette méthode préserverait une meilleure morphologie et une meilleure localisation des voies respiratoires, des cellules alvéolaires et de l’interstitium, ce qui les rendrait plus appropriées pour les études histologiques pulmonaires. Cette méthode est recommandée pour les laboratoires disposant de l’équipement et des consommables correspondants avec des instruments fabriqués en interne⁸.
   2. Coupez le lobe pulmonaire pour déterminer la direction de l’encastrement (Figure 1).
      1. Après 3 h de fixation, séparez les cinq lobes pulmonaires (sous observation directe des yeux) et intégrez séparément les lobes crânien, moyen et accessoire du poumon droit, avec des sections orientées dans le sens de la connexion verticale lobe-bronche.
      2. Coupez le lobe caudal du poumon droit en 2 morceaux à 4 mm de gauche à droite dans la direction perpendiculaire à la connexion lobe pulmonaire-bronche, et enfoncez les tranches dans un bloc de cire avec la surface coupée vers le haut.
      3. Faites trois incisions dans le lobe gauche du poumon. Faites la première incision transversalement au-dessus de la jonction bronchique principale, à 2 mm en dessous du haut. Faites la deuxième coupe transversalement au-dessus de la jonction bronchique principale, 5 mm en dessous du haut. Faites la troisième entaille à l’extrémité du lobe, à 8 mm en dessous du haut. Jetez le morceau de tissu le plus haut et enfermez les trois morceaux restants dans un bloc de cire avec la surface coupée vers le haut.
         REMARQUE : Lors de l’enrobage de plusieurs morceaux de poumon ensemble, un papier d’essuyage de microscope peut être utilisé pour les envelopper avant de les placer dans une boîte d’enrobage de tissu pour poursuivre le processus de déshydratation.
      4. Fixez à nouveau le tissu dans le fixateur pendant 24 h.
   3. Placez le bloc de mouchoir dans un récipient et rincez-le à l’eau courante pendant 15 min.
   4. Placez séquentiellement le tissu dans les solutions suivantes : 65 % d’éthanol pendant 30 min, 75 % d’éthanol pendant 30 min, 85 % d’éthanol pendant 30 min, 95 % d’éthanol I pendant 60 min, 95 % d’éthanol II pendant 60 min, éthanol absolu I pendant 60 min, éthanol absolu II pendant 60 min, 70 % d’éthanol pendant 120 min, 80 % d’éthanol pendant 120 min, 90 % d’éthanol pendant 120 min, 95 % d’éthanol pendant 120 min, éthanol absolu I pendant 120 min et éthanol absolu II pendant 120 min.
   5. Placez le mouchoir dans le xylène I pendant 30 min et le xylène II pendant 30 min.
   6. Placez le mouchoir dans de la cire molle à une température inférieure à 54 °C pendant 1 h, de la cire dure I à 58 °C pendant 1 h et de la cire dure II à 58 °C pendant 30 min.
   7. Sélectionnez une taille de moule appropriée, remplissez-le d’une quantité appropriée de paraffine liquide et utilisez une pince pour positionner le tissu dans le cadre d’enrobage au centre du moule dans la bonne direction. Placez le moule et le tissu dans la zone de congélation de la machine d’enrobage et appuyez doucement sur le tissu avec une pince.
   8. Lorsque la paraffine commence à blanchir légèrement, positionnez rapidement le cadre d’enrobage découvert sur le dessus du moule et effectuez la deuxième injection de cire, en scellant les trous au bas du cadre d’enrobage. Transférez l’ensemble du moule sur la table de congélation pour le moulage.
   9. Après avoir fixé le bloc de cire sur la trancheuse et révélé la surface de coupe lisse et plate grâce à une coupe grossière et fine, tournez la manivelle de la roue du microtome pour couper des tranches d’une épaisseur de 4 μm.
   10. Placez doucement les sections retirées sur la surface de l’eau dans l’ordre séquentiel. Une fois les sections complètement déployées, séparez les morceaux cassés aux jonctions entre chaque section.
   11. Inclinez une glissière en verre sous la section et, au contact, soulevez lentement et uniformément la glissière hors de la surface de l’eau dans un mouvement vertical. Les sections adhéreront à la glissière de verre.

2. Coloration par immunofluorescence pour la détection de la microvascularisation pulmonaire

1. Placez les tranches de paraffine dans un four à 65 °C pendant 60 min.
2. Placez les tranches sur une grille coulissante et effectuez les étapes suivantes dans des bocaux de coloration : immergez le xylène 1, le xylène 2 et le xylène 3 pendant 15 minutes chacun, puis plongez dans du xylène/éthanol (1:1) pendant 5 min, 100 % éthanol #1, 100 % éthanol #2, 85 % d’éthanol, 75 % d’éthanol et de l’eau distillée pendant 5 minutes chacun.
3. Diluez la solution modifiée de récupération de l’antigène du citrate de sodium 50 fois avec de l’eau désionisée. Préchauffez le micro-ondes à puissance élevée jusqu’à ébullition, puis placez la lame dans l’extrait d’antigène. Laissez la lame bouillir dans l’extrait d’antigène pendant 15 minutes, puis refroidissez naturellement à température ambiante.
4. Lavez les lames deux fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune. Perméabiliser avec 0,25% de Triton deux fois pendant 10 min chacune.
5. Encerclez le tissu avec un stylo d’immunohistochimie et incubez-le avec 5 % de BSA à température ambiante (RT) pendant 1 h. Lavez les lames une fois avec du PBS pendant 5 min.
6. Effectuez la coloration Alexa-647 Fluor conjuguée IB₄ et DAPI.
   1. Gardez l’IB₄ sur de la glace et diluez-le 1:50 avec 1% de BSA. Retirez l’excès d’eau autour du cercle, ajoutez 50 à 100 μL de l’IB₄ dilué à chaque section de tissu et incubez toute la nuit à 4 °C (à partir de cette étape, effectuez toutes les procédures dans l’obscurité).
   2. Lavez les lames trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune. Perméabiliser avec 0,25% de Triton pendant 10 min.
7. Diluer le DAPI (10 μg/mL) avec du PBS dans un rapport de 1:10 et ajouter 50-100 μL à chaque section de tissu à RT pendant 5 min.
8. Lavez les lames trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune.
9. Appliquez une goutte de support de montage anti-décoloration sur les diapositives, en évitant l’exposition à la lumière. Faites sécher la lame à l’air libre, puis observez et capturez des images du noyau et des signaux cibles au microscope à fluorescence.

3. Quantification de la densité microvasculaire pulmonaire

1. Acquérir des images.
   1. Observez les signaux de densité microvasculaire pulmonaire et les signaux DAPI sous un objectif 10x pour chaque lobe pulmonaire dans les groupes d’âge jeunes et âgés.
   2. Normaliser l’intensité de la source lumineuse et le temps d’exposition pour chaque canal en fonction des résultats d’observation. Capturez les images à double canal couvrant toute la surface de chaque lobe pulmonaire. Enregistrez l’image au format ND2 avec deux canaux (Figure 2).
2. Quantifier à l’aide de l’image J (figure supplémentaire 1).
   1. Lancez le logiciel ImageJ.
   2. Importez les images indiquées dans ImageJ, puis procédez au chargement et à la sélection. Divisez les canaux en conséquence. Chargez un fichier au format ND2 pour les canaux DAPI et IB₄ .
   3. Accédez à Analyser > définir l’échelle > Configurer les paramètres d’image à 0,48 μm/pixel (en fonction des paramètres de photographie) > Global > OK.
   4. Définissez la même plage d’affichage pour ajuster l’effet de présentation de l’image. Sélectionnez Image> ajustez > luminosité/contraste > Set. Réglez séparément la plage d’affichage pour chacun des deux canaux, IB₄ : 0-10000 ; DAPI : 0-20000.
   5. Pour éliminer l’influence des signaux d’arrière-plan, procédez comme suit : Cliquez sur Traiter > Mathématiques > Soustraire ; Soustrayez le signal d’arrière-plan en fonction des valeurs de signal détectées par l’outil Baguette magique en arrière-plan, IB₄ : 3000 ; DAPI : 300.
   6. Pour sélectionner la valeur de seuil qui correspond le mieux à l’image d’origine, accédez à Image > Dupliquer.
   7. Sélectionnez l’image originale et dupliquée > le type > 8 bits.
   8. Sélectionnez une valeur seuil appropriée pour identifier précisément la microvascularisation pulmonaire. Cliquez sur Image > Ajuster > seuil > intermodes (choisissez le seuil le plus réaliste par rapport au diagramme d’origine), cochez > Fond sombre > Appliquer.
   9. Éliminez les signaux positifs IB₄ des gros vaisseaux sanguins du poumon de la souris, y compris les artères et les veines : utilisez l’outil Baguette magique pour sélectionner des vaisseaux sanguins plus gros par rapport à l’image dupliquée, puis cliquez sur Supprimer (répétez l’opération jusqu’à ce que les signaux positifs IB₄ dans les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins plus gros soient supprimés).
      REMARQUE : Les signaux de coloration IB₄ sont détectés dans les cellules endothéliales des artères et des veines du poumon de souris. Pour réaliser un examen spécifique des occurrences de microvascularisation pulmonaire, il est recommandé d’éliminer uniformément les foyers de signal dans les cellules endothéliales des gros vaisseaux sanguins.
   10. Comptez le nombre de signaux cibles, cliquez sur Analyser > Définir les mesures, puis cochez Zone, Limiter au seuil et Afficher l’étiquette. Sélectionnez ensuite Analyser les particules et définissez Taille : 0-infini ; Circularité : 0,00-1,00 ; Spectacle : Masques excessifs ; cochez Résumer et cliquez sur OK.
   11. Choisissez Résumer les résultats > Fichier > Enregistrer sous.
3. Analyse des données et statistiques
   1. Faites correspondre et organisez le nombre de foyers positifs IB₄ et de foyers positifs DAPI, respectivement, sur la même image dans un tableau unifié.
   2. Résumez le nombre total de foyers positifs IB₄ et de foyers positifs DAPI pour chaque lobe dans les groupes de jeunes ou d’âge indiqués.
      1. Calculez le pourcentage de foyers IB4 positifs (%) en divisant le nombre total de foyers positifs_IB4 par le nombre total de foyers de coloration DAPI dans chaque lobe par différents groupes. Présentez le nombre de foyers positifs IB₄ , le nombre de foyers de coloration DAPI et le pourcentage de foyers positifs IB₄ (%) comme le montre la figure 3A.
   3. Lancez le logiciel d’analyse de données et créez une nouvelle table de colonnes.
      REMARQUE : Le GraphPad Prism 9 a été utilisé ici pour l’analyse statistique.
   4. Nommez-les séquentiellement du groupe A au groupe J comme suit : « Jeune lobe crânien », « Vieux lobe crânien », « Jeune lobe moyen », « Jeune lobe caudal », « Vieux lobe caudal », « Jeune lobe accessoire », « Vieux lobe accessoire », « Jeune lobe gauche », « Vieux lobe gauche ». Ensuite, entrez les foyers positifs IB₄ correspondants (%) dans le tableau (tableau supplémentaire 1).
   5. Utilisez des tests t non appariés pour la comparaison par paires afin d’évaluer les différences significatives dans les régions correspondantes entre les deux groupes d’âge. Effectuez un total de cinq comparaisons pour cinq lobes.
   6. Créez un graphique pour la visualisation des résultats (Figure 3B). Optez pour un graphique à barres et incluez une analyse statistique dans la figure.

Résultats

Pour faire la distinction entre les lésions des bronches principales et les petites branches des voies respiratoires, il est crucial de s’assurer que la structure continue des lésions de ces deux types de voies respiratoires est observée. Cela peut être réalisé en suivant les procédures de coupe et d’enrobage décrites à la figure 1. Étant donné les nombreux lobes pulmonaires chez la souris, qui sont orientés dans différentes directions et po...

Discussion

L’étude de la densité microvasculaire pulmonaire a des implications importantes pour la compréhension des processus physiologiques pulmonaires et aussi pour la définition des biomarqueurs des maladies respiratoires. La circulation pulmonaire présente une grande surface capillaire enveloppée d’une fine couche de cellules endothéliales. La juxtaposition harmonieuse de ces cellules et des cellules épithéliales alvéolaires donne naissance à une fragile membrane alvéolaire-cap...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole	MCE	HY-D0814	Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4	Thermo	I32450	Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer	Abcam	AB104135	Sample Fixation
Antigen Repair Fluid	Biosharp	BL151A	Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette	ActivFlo	39LC-500-1	Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064-50G	Sealing Solution
Cold Plate	Leica	HistoCore Arcadia H	Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven	Taisite	101-0AB	High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade	Leica	14035838383	Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds	Shitai	26155166627	Fixing Tissue Samples
Ethanol	Kelong	CAS 64-17-5	Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150	Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath	Leica	HI1220	Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens	Biosharp	BC004	Water-blocking Agent
Medical Forceps	Shanghai Medical Equipment	N/A	Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope	Nikon	Ts2	Imaging Device
Mounting Media	Jiangyuan	Tasteless	Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax	SCHLEDEN	80200-0014	Fixing Tissue Structure
PBS	Beyotime	C0221A	Wash Buffer
Pentobarbital Sodium	Beijing Chemical Reagent Company	Q/H82-F158-2002	Anesthetic
Rotary Microtome	Biobase	Bk-2258	Preparing Slices
Sterile Scissors	Shanghai Medical Equipment	N/A	segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel	Shanghai Medical Equipment	N/A	Cutting Tissue Samples
Triton	Solarbio	T8200	Permeabilization Solution
Wash-Free Slide	PLATINUM PRO	PRO-04	Fixing Samples for Staining
Xylene	SUM	XK13-011-00031	Tissue De-waxing Solution