هندسة الخلايا الدبقية الصغيرة المستحثة بالدم البشري لأبحاث الدماغ العكسية

Summary

تحدد هذه الدراسة نهجا جديدا لإنشاء خلايا شبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية (iMG) والتي تمكن من التقييم غير المباشر لالتهاب الدماغ. يقدم هذا نموذجا خلويا قد يكون مفيدا للبحث الذي يركز على الالتهاب المحتمل للدماغ والاضطرابات العصبية والنفسية المرتبطة به.

Abstract

أبرزت التحقيقات الحديثة التي تستخدم النماذج الحيوانية أهمية الخلايا الدبقية الصغيرة كمعدلات مناعية حاسمة في مختلف الأمراض العصبية والنفسية والجسدية. تحليل الدماغ بعد الوفاة والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني هي طرق بحث تمثيلية تقيم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في المرضى من البشر. كشفت النتائج عن تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في أدمغة المرضى الذين يعانون من اضطرابات عصبية نفسية مختلفة وألم مزمن. ومع ذلك ، فإن التقنية المذكورة أعلاه تسهل فقط تقييم الجوانب المحدودة لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة.

بدلا من خزعة الدماغ وتقنية الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، ابتكرنا في البداية تقنية لتوليد خلايا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة (iMG) المستحثة مباشرة من وحيدات الدم المحيطية البشرية المشتقة حديثا عن طريق استكمالها بعامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم والإنترلوكين 34 لمدة 2 أسابيع. يمكن استخدام خلايا iMG هذه لإجراء تحليلات مورفولوجية وجزيئية ديناميكية تتعلق بقدرة البلعمة وإطلاق السيتوكين بعد تحفيز الإجهاد على المستوى الخلوي. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام تحليل شامل للنسخ للتحقق من التشابه بين خلايا iMG البشرية والخلايا الدبقية الصغيرة الأولية في الدماغ.

قد تكون خلايا iMG المشتقة من المريض بمثابة علامات بديلة رئيسية للتنبؤ بالتنشيط الدبقي الصغير في أدمغة البشر وقد ساعدت في الكشف عن الفيزيولوجيا المرضية الديناميكية غير المعروفة سابقا للخلايا الدبقية الصغيرة في المرضى الذين يعانون من مرض ناسو هاكولا ، والألم العضلي الليفي ، والاضطراب ثنائي القطب ، ومرض مويامويا. لذلك ، تعمل التقنية القائمة على iMG كأداة قيمة للترجمة العكسية وتوفر رؤى جديدة في توضيح ديناميكية الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة في مجموعة متنوعة من الأمراض العقلية والجسدية.

Introduction

في السنوات الأخيرة ، اقترح أن يؤدي التهاب الدماغ أدوارا محورية في الفيزيولوجيا المرضية لمختلف اضطرابات الدماغ والاضطرابات العصبية والنفسية. تم تسليط الضوء على الخلايا الدبقية الصغيرة كخلايا مناعية رئيسية من خلال تحليل الدماغ البشري بعد الوفاة وتقنيات التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET)^1،2،3،4. تكشف تحليلات تصوير الدماغ والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني بعد الوفاة عن نتائج مهمة. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب غير فعالة من حيث التقاط الأنشطة الجزيئية الديناميكية للخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في الدماغ بالكامل. لذلك ، هناك حاجة إلى است....

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة كيوشو وامتثل لجميع أحكام إعلان هلسنكي. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المشاركين ، بما في ذلك المتطوعين والمرضى الأصحاء ، لتحليل دمائهم ونشر بياناتهم. يتم سرد المواد والمعدات في جدول المواد ، ويتم تفصيل تركيبات الحلول في الجدول 1.

1. إعداد الوسائط والمخازن المؤقتة للتجارب

1. تحضير وسط العزل عن طريق استكمال RPMI-1640 بمصل بقري جنيني معطل حراري بنسبة 10٪ (56 درجة مئوية ، 30 دقيقة) و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
2. قم بإعداد المخزن المؤقت العازل عن طريق استكمال المحلول العازل الأساسي بمحلول مخزون مصل البقر (BSA)....

النتائج

الأهم من ذلك ، هناك قدر كبير من عدم التجانس على مستوى الشخص ومستوى التوقيت في خصائص خلايا iMG بما في ذلك الأشكال والتعبيرات الجينية. تفترض خلايا iMG في بعض الأفراد مظهرا متفرعا العديد (الشكل 1 أ) ، بينما تظل كروية في حالات أخرى (الشكل 1 ب). قد تختلف خصائص iMG حتى داخ?.......

Discussion

قد تكون التقنيات التحليلية التي تستخدم خلايا iMG بمثابة أدوات بحث عكسية قوية ^5,6. لتوليد كميات كافية من خلايا iMG البشرية ، يجب على المجربين تصميم دراساتهم مع مراعاة بعض القضايا. عينات الدم المستمدة من البشر حساسة للغاية. وبالتالي ، فإن العينات التي تم الحصول عل.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% paraformaldehyde	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI solution	DOJINDO	28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Nacalai Tesque	14249-24	described as "PBS (−)"
Fetal Bovine Serum	biowest	S1760-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	described as "density gradient medium"
Human FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	described as "magnetic column"
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	described as "magnetic stand"
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144	described as "mounting media"
recombinant human GM-CSF	R&D Systems	215-GM
recombinant human IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	secondary antibody, rabbit, 1:1000