역번역 뇌 연구를 위한 인간 혈액 유도 미세아교세포 유사 세포 엔지니어링

요약

이 연구는 뇌 염증의 간접 평가를 가능하게 하는 인간 단핵구 유래 미세아교세포(iMG) 세포의 확립을 위한 새로운 접근 방식을 설명합니다. 이는 뇌의 잠재적 염증 및 관련 신경 정신 질환에 초점을 맞춘 연구에 도움이 될 수 있는 세포 모델을 제시합니다.

초록

동물 모델을 사용한 최근 연구는 다양한 신경정신과 및 신체 질환에서 중요한 면역학적 조절인자로서 미세아교세포의 중요성을 강조했습니다. 사후 뇌 분석 및 양전자 방출 단층 촬영 영상은 인간 환자의 미세아교세포 활성화를 평가하는 대표적인 연구 방법입니다. 이 연구 결과는 다양한 신경 정신 질환과 만성 통증을 나타내는 환자의 뇌에서 미세아교세포의 활성화를 밝혔습니다. 그럼에도 불구하고, 앞서 언급한 기법은 단지 미세아교세포 활성화의 제한된 측면의 평가를 용이하게 할 뿐입니다.

뇌 생검과 유도만능줄기세포 기법 대신, 초기에는 갓 유래한 인간 말초혈액 단핵구에서 직접 유도된 미세아교세포(iMG)를 생성하여 과립구-대식세포 집락 자극 인자와 인터루킨 34를 2주 동안 보충하는 기술을 고안했습니다. 이러한 iMG 세포는 세포 수준 스트레스 자극 후 식세포 용량 및 사이토카인 방출에 관한 동적 형태학적 및 분자 수준 분석을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 최근에는 인간 iMG 세포와 뇌 원발성 미세아교세포의 유사성을 확인하기 위해 종합적인 전사체 분석이 사용되고 있습니다.

환자 유래 iMG 세포는 인간 뇌의 미세아교세포 활성화를 예측하기 위한 주요 대리 마커 역할을 할 수 있으며, Nasu-Hakola 병, 섬유근육통, 양극성 장애 및 Moyamoya 병 환자에서 이전에 알려지지 않은 미세아교세포의 동적 병태생리를 밝히는 데 도움이 되었습니다. 따라서 iMG 기반 기법은 가치 있는 역번역 도구 역할을 하며 다양한 정신 및 신체 질환에서 미세아교세포의 분자 병태생리를 역학적으로 규명하기 위한 새로운 통찰력을 제공합니다.

서문

최근 몇 년 동안 뇌 염증은 다양한 뇌 및 신경 정신 질환의 병태 생리학에서 중추적인 역할을 하는 것으로 제안되었습니다. 미세아교세포는 인간의 사후 뇌 분석 및 양전자 방출 단층촬영(PET) 기반 생체 영상 기법 1,2,3,4에 의해 주요 면역조절 세포로 각광받고 있습니다. 사후 뇌 및 PET 영상 분석에서 중요한 결과가 밝혀졌습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 접근 방식은 뇌에서 인간 미세아교세포의 역동적인 분자 활동을 전체적으로 포착하는 측면에서 비효율적입니다. 따라서 분자 및 세포 수준에서 인간의 미세아교세포 기능과 기능 장애를 종합적으로 평가할 수 있는 새로운 전략이 필요합니다.

2014년에 우리는 원래 직접 유도된 미세아교세포(iMG) 세포 ^5,6을 생산하는 새로운 기술을 설계했으며, 2016년에 인간 유도 만능줄기세포(iPSC) 유래 미세아교세포 유사 세포가 처음 발표되기 전이었습니다

프로토콜

연구 프로토콜은 규슈 대학 윤리 위원회의 승인을 받았으며 헬싱키 선언의 모든 조항을 준수했습니다. 건강한 지원자와 환자를 포함한 모든 참가자로부터 혈액을 분석하고 데이터를 게시하기 위해 서면 동의서를 받았습니다. 재료 및 장비는 재료 표에 나열되어 있으며 용액의 구성은 표 1에 자세히 설명되어 있습니다.

1. 실험을 위한 배지 및 완충액 준비

1. RPMI-1640에 10% 열불활성화 소 태아 혈청(56°C, 30분) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충하여 분리 배지를 준비합니다.
2. 염기성 완충액에 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 원액을 보충하여 분리 완충액을 준비하고 여과(0.22μm)를 통해 멸균합니다.

2. 전혈에서 단핵 세포의 분리

1. 15mL의 밀도 그래디언트 매체를 50mL 밀도 그래디언트 원심분리 튜브에 옮기고 20°C에서 1분 동안 1,000× g 으로 원심분리합니다.
   참고: 50mL 밀도 구배 원심분리 튜브당 15mL의 혈액을 분리합니다. 혈액량이 많을 때는 튜브의 수를 늘립니다....

토론

iMG 세포를 이용한 분석 기법은 강력한 역번역 연구 도구로 작용할 수 있다 ^5,6. 충분한 양의 인간 iMG 세포를 생성하기 위해 실험자는 특정 문제를 고려하여 연구를 설계해야 합니다. 인간에서 추출한 혈액 샘플은 매우 민감합니다. 결과적으로, 얻어진 샘플은 신속한 처리와 오염을 방지하기 위한 세심한 취급을 보증합니다. 특히, 혈액 샘플은 채취 후 즉?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% paraformaldehyde	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI solution	DOJINDO	28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Nacalai Tesque	14249-24	described as "PBS (−)"
Fetal Bovine Serum	biowest	S1760-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	described as "density gradient medium"
Human FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	described as "magnetic column"
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	described as "magnetic stand"
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144	described as "mounting media"
recombinant human GM-CSF	R&D Systems	215-GM
recombinant human IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	secondary antibody, rabbit, 1:1000