역번역 뇌 연구를 위한 인간 혈액 유도 미세아교세포 유사 세포 엔지니어링

요약

이 연구는 뇌 염증의 간접 평가를 가능하게 하는 인간 단핵구 유래 미세아교세포(iMG) 세포의 확립을 위한 새로운 접근 방식을 설명합니다. 이는 뇌의 잠재적 염증 및 관련 신경 정신 질환에 초점을 맞춘 연구에 도움이 될 수 있는 세포 모델을 제시합니다.

초록

동물 모델을 사용한 최근 연구는 다양한 신경정신과 및 신체 질환에서 중요한 면역학적 조절인자로서 미세아교세포의 중요성을 강조했습니다. 사후 뇌 분석 및 양전자 방출 단층 촬영 영상은 인간 환자의 미세아교세포 활성화를 평가하는 대표적인 연구 방법입니다. 이 연구 결과는 다양한 신경 정신 질환과 만성 통증을 나타내는 환자의 뇌에서 미세아교세포의 활성화를 밝혔습니다. 그럼에도 불구하고, 앞서 언급한 기법은 단지 미세아교세포 활성화의 제한된 측면의 평가를 용이하게 할 뿐입니다.

뇌 생검과 유도만능줄기세포 기법 대신, 초기에는 갓 유래한 인간 말초혈액 단핵구에서 직접 유도된 미세아교세포(iMG)를 생성하여 과립구-대식세포 집락 자극 인자와 인터루킨 34를 2주 동안 보충하는 기술을 고안했습니다. 이러한 iMG 세포는 세포 수준 스트레스 자극 후 식세포 용량 및 사이토카인 방출에 관한 동적 형태학적 및 분자 수준 분석을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 최근에는 인간 iMG 세포와 뇌 원발성 미세아교세포의 유사성을 확인하기 위해 종합적인 전사체 분석이 사용되고 있습니다.

환자 유래 iMG 세포는 인간 뇌의 미세아교세포 활성화를 예측하기 위한 주요 대리 마커 역할을 할 수 있으며, Nasu-Hakola 병, 섬유근육통, 양극성 장애 및 Moyamoya 병 환자에서 이전에 알려지지 않은 미세아교세포의 동적 병태생리를 밝히는 데 도움이 되었습니다. 따라서 iMG 기반 기법은 가치 있는 역번역 도구 역할을 하며 다양한 정신 및 신체 질환에서 미세아교세포의 분자 병태생리를 역학적으로 규명하기 위한 새로운 통찰력을 제공합니다.

서문

최근 몇 년 동안 뇌 염증은 다양한 뇌 및 신경 정신 질환의 병태 생리학에서 중추적인 역할을 하는 것으로 제안되었습니다. 미세아교세포는 인간의 사후 뇌 분석 및 양전자 방출 단층촬영(PET) 기반 생체 영상 기법 1,2,3,4에 의해 주요 면역조절 세포로 각광받고 있습니다. 사후 뇌 및 PET 영상 분석에서 중요한 결과가 밝혀졌습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 접근 방식은 뇌에서 인간 미세아교세포의 역동적인 분자 활동을 전체적으로 포착하는 측면에서 비효율적입니다. 따라서 분자 및 세포 수준에서 인간의 미세아교세포 기능과 기능 장애를 종합적으로 평가할 수 있는 새로운 전략이 필요합니다.

2014년에 우리는 원래 직접 유도된 미세아교세포(iMG) 세포 ^5,6을 생산하는 새로운 기술을 설계했으며, 2016년에 인간 유도 만능줄기세포(iPSC) 유래 미세아교세포 유사 세포가 처음 발표되기 전이었습니다⁷. 단 2주 만에 사이토카인, 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF) 및 인터루킨 34(IL-34)를 최적화하여 인간 말초 혈액 단핵구를 iMG 세포로 전환하는 데 성공했습니다. 우리가 이 기술을 개발했을 때, iPS 세포 또는 섬유아세포로부터 신경 세포를 유도하는 혁신적인 재프로그래밍 방법이 전 세계적으로 막 널리 보급되기 시작했습니다 8,9,10,11. 그러나, 당시에는 iPS 유래 소교세포를 유도하는 방법이 아직 보고되지 않았으며, 인간 체세포 유래 소교세포 모델의 생성이 요구되고 있었다. 대식세포 집락 자극 인자인 GM-CSF 및 IL-34와 같은 사이토카인이 미세아교세포^12,13,14,15의 발달 및 유지에 필요한 것으로 보고되었기 때문에 이러한 사이토카인의 조합을 직접 적용하여 혈액 단핵구에서 미세아교세포 모델을 생성할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 마지막으로 GM-CSF와 IL-34⁵를 결합하여 단핵구에서 유래한 미세아교세포 모델을 개발하는 데 성공했다. 또한, 이러한 사이토카인 조합 중 일부는 iPS 세포(^7,16)로부터 미세아교세포를 유도하기 위해 사용되며, 미세아교세포 특성을 획득하는데 중요한 인자로 가정된다.

iPSC 방법과 달리 iMG 세포는 유전자 변형이 필요하지 않으며 간단한 화학적 유도로 매우 짧은 시간에 생성할 수 있어 시간과 재정적 비용이 절감됩니다. 또한 iMG 세포는 유전자 재프로그래밍이 필요하지 않기 때문에 iMG 세포는 인간 미세아교세포의 특성뿐만 아니라 상태도 평가할 수 있는 강력한 대리 세포라고 생각합니다. 2014년 iMG 기술에 대한 초기 논문에서 iMG 세포가 단핵구 및 대식세포와 구별될 수 있는 인간 미세아교세포의 표현형을 나타낸다는 것을 확인했습니다. 예를 들어, iMG 세포는 막관통 단백질 119(TMEM 119) 및 퓨린성 수용체 P2RY12 ^5,17을 포함한 단핵구 및 전형적인 미세아교세포 마커보다 CX3C 케모카인 수용체 1(CX3CR1) 및 C-C 케모카인 수용체 2형(CCR2)의 과발현 비율을 나타냈습니다. 최근에는 뇌 수술을 받은 동일한 환자에서 말초 혈액 유래 iMG 세포가 잘 알려진 미세아교세포 마커의 유전자 발현 프로필에서 뇌 미세아교세포와 유사하다는 것을 확인했습니다¹⁸. iMG 세포는 식세포작용(phagocytosis) 및 사이토카인(cytokine) 생성과 같은 분자 수준의 동적 기능을 분석할 수 있으며, 사후 뇌 연구 및 PET 연구의 단점을 보완할 수 있을 것으로 기대됩니다.

우리는 Nasu-Hakola^{병 5}, 섬유 근육통¹⁹, 양극성 장애^20,21 또는 Moyamoya^{병 22}로 진단된 환자에서 미세아교세포와 관련된 이전에 알려지지 않은 동적 병태생리학적 메커니즘을 발견했습니다. 더욱이, 우리의 독창적인 방법론에 기초하여, 다양한 실험실에서 iMG 세포(특정 실험실은 이러한 세포에 대한 대체 이름을 지정함)를 중요한 역번역 연구 도구로 사용하였다⁽23,24,25,26,27). Sellgren et al.은 우리의 권고에 따라 iMG 세포를 성공적으로 생성하고 마이크로어레이 분석을 수행하여 이러한 세포가 인간의 뇌 미세아교세포(²³)와 매우 유사하다는 것을 밝혔습니다. 최근에는 RNA 염기서열 분석¹⁸을 사용하여 인간 iMG 세포와 뇌 원발성 미세아교세포의 유사성을 확인했습니다.

이 연구는 신경 정신 질환에 초점을 맞춘 역번역 연구를 촉진하기 위해 인간 말초 혈액에서 iMG 세포를 생성하는 방법론을 문서화하는 것을 목표로 했습니다. 이 기술은 유전자 전달 장치나 숙련된 인력이 부족한 열악한 실험실에서도 짧은 기간 내에 미세아교세포 모델을 쉽게 생성할 수 있는 합리적인 분석 도구로서의 잠재력을 제시합니다.

프로토콜

연구 프로토콜은 규슈 대학 윤리 위원회의 승인을 받았으며 헬싱키 선언의 모든 조항을 준수했습니다. 건강한 지원자와 환자를 포함한 모든 참가자로부터 혈액을 분석하고 데이터를 게시하기 위해 서면 동의서를 받았습니다. 재료 및 장비는 재료 표에 나열되어 있으며 용액의 구성은 표 1에 자세히 설명되어 있습니다.

1. 실험을 위한 배지 및 완충액 준비

1. RPMI-1640에 10% 열불활성화 소 태아 혈청(56°C, 30분) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충하여 분리 배지를 준비합니다.
2. 염기성 완충액에 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 원액을 보충하여 분리 완충액을 준비하고 여과(0.22μm)를 통해 멸균합니다.

2. 전혈에서 단핵 세포의 분리

1. 15mL의 밀도 그래디언트 매체를 50mL 밀도 그래디언트 원심분리 튜브에 옮기고 20°C에서 1분 동안 1,000× g 으로 원심분리합니다.
   참고: 50mL 밀도 구배 원심분리 튜브당 15mL의 혈액을 분리합니다. 혈액량이 많을 때는 튜브의 수를 늘립니다.
2. 헤파린 튜브에 수집된 혈액을 반전으로 균질화하고 화재 멸균 핀셋으로 채혈 튜브의 뚜껑을 제거합니다.
3. 밀도 구배 원심분리 튜브의 밀도 구배 배지에 동일한 부피(10-15mL)의 혈액을 분주합니다.
4. 원심분리기의 감속 수준을 1단계 중 4단계로 설정하고 실온(RT)에서 1,000 ×g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
   알림: 이 감속 속도에서 180× g (1,000rpm)의 회전 속도가 3분 내에 정지합니다.
5. 50mL 밀도 구배 원심분리 튜브와 동일한 수의 50mL 원심분리기 튜브를 준비하고 각 튜브에 10mL의 PBS(-)를 채웁니다.
6. 원심분리 후 버피 코트에서 약 1cm 위까지 플라즈마의 최상층을 제거합니다.
   알림: 흡입 피펫을 튜브에 수직으로 삽입하고 액체 표면의 중심에서 조심스럽게 흡입합니다. 버피 코트를 방해하지 않도록 과도하게 흡입하지 마십시오.
7. 50mL 밀도 구배 원심분리 튜브에 남아 있는 모든 상층액을 10mL의 PBS(-)가 포함된 원심분리 튜브로 디캔팅합니다.
8. 원심분리기의 감속 수준을 3단계 중 4단계로 재설정하고 RT에서 250× g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 이 단계에서 50mL 원심분리기 튜브 1개와 15mL 원심분리기 튜브 2개와 100μm 세포 여과기를 준비합니다.
9. 원심분리 후 원심분리기의 온도를 4°C로 설정합니다. 원심분리기 튜브 바닥에 빨간색 둘레가 있는 흰색 펠릿을 검색합니다. 흡인으로 상층액을 제거하고 두드려 펠릿을 부드럽게 풉니다.
10. 화염 멸균 핀셋을 사용하여 50mL 코니컬 튜브에 100μm 세포 여과기를 배치합니다.
11. 13mL의 분리 배지를 원심분리 튜브 중 하나에 통합하고 내벽을 세척하여 세포를 제대로 수집합니다. 셀 현탁액을 가져와서 나머지 원심분리 튜브를 연속적으로 세척합니다. 모든 튜브에서 세포를 수집한 후 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과하여 50mL 원뿔형 튜브로 넣습니다.
    알림: 분리 매체는 분리 프로세스 전반에 걸쳐 냉각되어야 합니다(단계 2.11-2.16).
12. 2.11단계에서 설명한 대로 각 튜브를 13mL의 분리 매체로 다시 세척합니다. 총 26mL의 세포 현탁액을 수집합니다.
13. 두 개의 15mL 코니컬 튜브에 동일한 양을 분주하고, 세포를 열거하고, 2.16단계에서 격리 완충액의 적절한 농도(총 세포^10,7 개당 완충액 60μL)를 계산합니다.
    참고: 15mL 원뿔형 튜브는 2.16단계에서 피펫팅할 때 액체 부피가 작고 액체 거품이 쉽게 발생하기 때문에 작업하는 것이 좋습니다.
14. 250× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
15. 원심분리하는 동안 마그네틱 스탠드(특히 컬럼과 접촉하는 부분)를 70% 에탄올로 철저히 소독하고 벤치에 올려 자연 건조시킵니다. 절연 버퍼를 얼음 위에 유지하십시오.
16. 흡인으로 상층액을 제거하고(이 단계에서 적혈구가 존재하기 때문에 ~1mm 두께의 빨간색 펠릿을 찾으십시오), 적절한 양의 분리 완충액을 추가한 다음 ~20x 피펫팅하여 펠릿을 부드럽게 풉니다.

3. CD11b 마이크로비드를 이용한 단핵구 분리

1. 적용 전 10초 동안 Vortex human FcR 차단 시약. 필요한 양의 시약(총 세포 10,7개당 20μL의 FcR 차단 시약)을 통합하고 4°C의 챔버에서 5분 동안 배양합니다.
2. 적용하기 전에 CD11b 마이크로비즈를 10초 동안 소용돌이시킵니다. 필요한 양의 시약^{(총 7} 개 세포당 20μL의 CD11b 마이크로비드)을 넣고 4°C 챔버에서 20분 동안 배양하면서 5분마다 손으로 교반합니다.
3. 배양 후 10mL의 분리 완충액을 추가하고 부드러운 피펫팅으로 현탁시킨 다음 300× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
4. 원심분리하는 동안 마그네틱 컬럼을 마그네틱 스탠드에 놓고 3mL의 분리 버퍼로 헹굽니다.
   알림: 기둥의 자기 부분을 만지지 말고 기둥을 올바르게 배치하십시오. 기둥에 기포가 들어가면 피펫으로 제거하십시오. 격리 버퍼는 분리 프로세스 전반에 걸쳐 냉각되어야 합니다(단계 3.4-3.9).
5. 흡인으로 원심분리 후 상층액을 제거하고, 1mL의 분리 완충액을 주입하고, 피펫팅으로 부드럽게 혼합한 다음 현탁액을 컬럼에 적용합니다.
6. 컬럼 리저버가 비워질 때마다 3mL의 분리 완충액을 추가하여 컬럼을 3번 세척합니다.
7. 자기 부분을 건드리지 않고 15mL 원뿔형 튜브에 컬럼을 놓습니다. 5mL의 분리 완충액을 컬럼에 통합하고 플런저를 튜브에 삽입하여 컬럼을 통해 액체를 밀어냅니다.
8. 튜브에 수집된 셀 현탁액을 300× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
9. 상층액을 흡인하고 세포를 분리 배지에 재현탁시킵니다. 5단계에서 계산된 셀 수의 ~10~2.13%가 복구되므로 셀 수에 따라 현탁액을 조정합니다.
   알림: 절연 매체는 RT에서 사용해야 하며 4°C의 급격한 온도 변화를 피하기 위해 가열하지 않아야 합니다.
10. 세포를 열거하고 500μL의 세포 현탁액을 40 × 10⁴ cells/mL의 농도로 24웰 플레이트의 각 웰에 분주하고 밤새 배양합니다.
    알림: 셀 현탁액은 다른 플레이트에 필요한 조정된 파종 부피에 따라 적절하게 피펫팅해야 합니다. 예를 들어, 12웰 플레이트의 웰 1개에 대해 1mL, 8웰 챔버 슬라이드의 웰 1개에 대해 250μL입니다.
11. 마지막으로, 시설에서 정한 감염성 폐기물 처리 정책에 따라 오염된 장비를 폐기하거나 소독합니다.

4. 단핵구에서 iMG 세포 유도

1. 1% 항생제-항진균 용액, 10ng/mL 재조합 인간 GM-CSF 및 100ng/mL 재조합 인간 IL-34를 기저 유도 배지에 보충하여 유도 배지를 준비합니다.
2. 전날의 파종에서 분리 매체를 유도 매체로 교체합니다. 플레이트를 앞으로 기울이고 파스퇴르 피펫으로 웰 바닥의 앞쪽 가장자리에서 고갈된 매체를 즉시 흡입합니다. 한 번에 최대 1개의 플레이트(= 24웰)의 비율로 매체를 교체하고 즉시 500μL의 유도 매체를 부드럽게 통합합니다.
   참고: 이 단계에서는 부착된 단핵구를 선택해야 합니다.
3. 유도를 완료하기 위해 14일 동안 세포를 배양합니다.
4. 14일 후에 배지를 500μL의 유도 매체로 다시 교체합니다. 그 후, 세포의 유도 후 유지 관리를 위해 유도 매체를 매주 500μL의 새로운 유도 매체로 교체합니다.

5. 면역세포화학(Immunocytochemistry)

1. 8단계에서 세포로 파종된 3.10웰 챔버 슬라이드에서 배지를 흡인으로 제거하고 PBS(-)로 헹굽니다.
2. 4% 파라포름알데히드로 RT에서 20분 동안 세포를 고정합니다.
3. 정착 시약을 제거하고 PBS(-)로 3 x 5분 동안 세포를 헹굽니다.
4. RT에서 0.1% Triton X-100을 포함하는 PBS(-)로 세포를 투과시킵니다.
5. 투과된 세포를 RT에서 1시간 동안 차단 용액(3% BSA/PBS(-))으로 배양합니다.
6. 4 °C에서 1 차 항체 (Table of Materials)로 세포를 밤새 배양합니다.
   참고: 모든 항체는 차단 용액에 희석됩니다.
7. PBS(-)로 3 x 5분 동안 세포를 각각 5분 동안 헹굽니다.
8. 헹굼 된 세포를 RT (Table of Materials)에서 1 시간 동안 적절한 형광 태그 된 2 차 항체로 배양합니다.
9. PBS(-)로 세포를 3 x 5분 동안 헹구어 2차 항체를 제거합니다.
10. PBS(-)로 희석한 DAPI(1:10,000) 용액으로 RT에서 5분 동안 세포를 배양합니다.
11. PBS (-)로 3 x 5 분 동안 세포를 헹굽니다.
12. 장착 매체를 사용하여 웰을 장착하고 형광 현미경으로 세포를 시각화합니다.

결과

중요한 것은 형태학 및 유전자 발현을 포함하여 iMG 세포의 특성에는 많은 개인 수준 및 타이밍 수준의 이질성이 있다는 것입니다. 특정 개체의 iMG 세포는 수많은 분지 모양을 취하는 반면(그림 1A) 다른 개체에서는 구형 상태를 유지합니다(그림 1B). iMG 특성은 단일 개체 내에서도 다를 수 있으므로 iMG 세포는 질병 상태 바이오마커를 검출하기 위한 중추?...

토론

iMG 세포를 이용한 분석 기법은 강력한 역번역 연구 도구로 작용할 수 있다 ^5,6. 충분한 양의 인간 iMG 세포를 생성하기 위해 실험자는 특정 문제를 고려하여 연구를 설계해야 합니다. 인간에서 추출한 혈액 샘플은 매우 민감합니다. 결과적으로, 얻어진 샘플은 신속한 처리와 오염을 방지하기 위한 세심한 취급을 보증합니다. 특히, 혈액 샘플은 채취 후 즉?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% paraformaldehyde	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI solution	DOJINDO	28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Nacalai Tesque	14249-24	described as "PBS (−)"
Fetal Bovine Serum	biowest	S1760-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	described as "density gradient medium"
Human FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	described as "magnetic column"
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	described as "magnetic stand"
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144	described as "mounting media"
recombinant human GM-CSF	R&D Systems	215-GM
recombinant human IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	secondary antibody, rabbit, 1:1000