Ters Translasyonel Beyin Araştırmaları için İnsan Kanı Kaynaklı Mikroglia Benzeri Hücrelerin Mühendisliği

Özet

Bu çalışma, beyin iltihabının dolaylı olarak değerlendirilmesini sağlayan insan monosit türevli mikroglia benzeri (iMG) hücrelerin kurulması için yeni bir yaklaşımı tanımlamaktadır. Bu, beynin potansiyel iltihabına ve ilişkili nöropsikiyatrik bozukluklara odaklanan araştırmalar için faydalı olabilecek bir hücresel model sunar.

Özet

Hayvan modelleri kullanılarak yapılan son araştırmalar, mikroglianın çeşitli nöropsikiyatrik ve fiziksel hastalıklarda önemli immünolojik modülatörler olarak önemini vurgulamıştır. Postmortem beyin analizi ve pozitron emisyon tomografisi görüntüleme, insan hastalarda mikroglial aktivasyonu değerlendiren temsili araştırma yöntemleridir; Bulgular, çeşitli nöropsikiyatrik bozukluklar ve kronik ağrı ile başvuran hastaların beyinlerinde mikroglia aktivasyonunu ortaya koymuştur. Bununla birlikte, yukarıda bahsedilen teknik, mikroglial aktivasyonun sınırlı yönlerinin değerlendirilmesini sadece kolaylaştırır.

Beyin biyopsisi ve indüklenmiş pluripotent kök hücre tekniği yerine, başlangıçta taze türetilmiş insan periferik kan monositlerinden doğrudan indüklenmiş mikroglia benzeri (iMG) hücreleri, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör ve interlökin 34 ile 2 hafta boyunca takviye ederek üretmek için bir teknik geliştirdik. Bu iMG hücreleri, hücresel düzeyde stres stimülasyonunu takiben fagositik kapasite ve sitokin salınımları ile ilgili dinamik morfolojik ve moleküler düzeyde analizler yapmak için kullanılabilir. Son zamanlarda, insan iMG hücreleri ile beyin primer mikroglia arasındaki benzerliği doğrulamak için kapsamlı transkriptom analizi kullanılmıştır.

Hastadan türetilen iMG hücreleri, insan beynindeki mikroglial aktivasyonu tahmin etmek için anahtar vekil belirteçler olarak hizmet edebilir ve Nasu-Hakola hastalığı, fibromiyalji, bipolar bozukluk ve Moyamoya hastalığı olan hastalarda daha önce bilinmeyen dinamik mikroglia patofizyolojisinin ortaya çıkarılmasına yardımcı olmuştur. Bu nedenle, iMG tabanlı teknik, değerli bir ters çeviri aracı olarak hizmet eder ve çeşitli zihinsel ve fiziksel hastalıklarda mikroglianın moleküler patofizyolojisini dinamik olarak aydınlatmak için yeni bilgiler sağlar.

Giriş

Son yıllarda, beyin inflamasyonunun çeşitli beyin ve nöropsikiyatrik bozuklukların patofizyolojisinde önemli roller üstlendiği öne sürülmüştür; mikroglia, insan ölüm sonrası beyin analizi ve pozitron emisyon tomografisi (PET) tabanlı biyo-görüntüleme teknikleri 1,2,3,4 ile anahtar immünomodülatör hücreler olarak vurgulanmıştır. Postmortem beyin ve PET görüntüleme analizleri önemli bulgular ortaya koymaktadır; Bununla birlikte, bu yaklaşımlar, beyindeki insan mikrogliasının dinamik moleküler aktivitelerini bir bütün olarak yakalamak açısından....

Protokol

Çalışma protokolü, Kyushu Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylandı ve Helsinki Bildirgesi'nin tüm hükümlerine uydu. Sağlıklı gönüllüler ve hastalar da dahil olmak üzere tüm katılımcılardan kanlarını analiz etmek ve verilerini yayınlamak için yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Malzemeler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir ve çözeltilerin bileşimleri Tablo 1'de detaylandırılmıştır.

1. Deneyler için ortam ve tamponların hazırlanması

1. RPMI-1640'ı %10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (56 °C, 30 dakika) ve %1 penisilin-streptomisin ile takviye ederek izolasy....

Tartışmalar

iMG hücrelerini kullanan analitik teknikler, güçlü ters translasyonel araştırma araçları olarak hizmet edebilir ^5,6. Yeterli miktarda insan iMG hücresi üretmek için, deneyciler çalışmalarını belirli konuları dikkate alarak tasarlamalıdır. İnsanlardan alınan kan örnekleri son derece hassastır; Sonuç olarak, elde edilen numuneler, kontaminasyonu önlemek için hızlı işlemeyi ve titiz işlemeyi garanti eder. Spesifik olarak, kan örnekleri.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% paraformaldehyde	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI solution	DOJINDO	28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Nacalai Tesque	14249-24	described as "PBS (−)"
Fetal Bovine Serum	biowest	S1760-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	described as "density gradient medium"
Human FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	described as "magnetic column"
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	described as "magnetic stand"
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144	described as "mounting media"
recombinant human GM-CSF	R&D Systems	215-GM
recombinant human IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	secondary antibody, rabbit, 1:1000