Engineering von humanen blutinduzierten Mikroglia-ähnlichen Zellen für die reverse-translationale Hirnforschung

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt einen neuartigen Ansatz für die Etablierung von humanen Monozyten-abgeleiteten Mikroglia-ähnlichen (iMG) Zellen, die eine indirekte Beurteilung von Hirnentzündungen ermöglichen. Dies stellt ein zelluläres Modell dar, das für die Forschung nützlich sein könnte, die sich auf mögliche Entzündungen des Gehirns und damit verbundene neuropsychiatrische Erkrankungen konzentriert.

Zusammenfassung

Neuere Untersuchungen mit Tiermodellen haben die Bedeutung von Mikroglia als wichtige immunologische Modulatoren bei verschiedenen neuropsychiatrischen und physikalischen Erkrankungen hervorgehoben. Die postmortale Hirnanalyse und die Positronen-Emissions-Tomographie sind repräsentative Forschungsmethoden, die die Aktivierung von Mikroglia bei menschlichen Patienten bewerten. Die Ergebnisse haben die Aktivierung von Mikroglia im Gehirn von Patienten mit verschiedenen neuropsychiatrischen Störungen und chronischen Schmerzen gezeigt. Nichtsdestotrotz erleichtert die oben genannte Technik lediglich die Beurteilung begrenzter Aspekte der Mikrogliaaktivierung.

Anstelle der Hirnbiopsie und der induzierten pluripotenten Stammzelltechnik entwickelten wir zunächst eine Technik, um direkt induzierte Mikroglia-ähnliche (iMG) Zellen aus frisch gewonnenen menschlichen peripheren Blutmonozyten zu erzeugen, indem wir sie 2 Wochen lang mit Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor und Interleukin 34 ergänzten. Diese iMG-Zellen können verwendet werden, um dynamische morphologische und molekulare Analysen zur phagozytischen Kapazität und zur Zytokinfreisetzung nach zellulärer Stressstimulation durchzuführen. In jüngster Zeit wurde eine umfassende Transkriptomanalyse eingesetzt, um die Ähnlichkeit zwischen menschlichen iMG-Zellen und primären Mikroglia des Gehirns zu überprüfen.

Die von Patienten stammenden iMG-Zellen können als wichtige Surrogatmarker für die Vorhersage der Mikrogliaaktivierung im menschlichen Gehirn dienen und haben bei der Enthüllung der bisher unbekannten dynamischen Pathophysiologie von Mikroglia bei Patienten mit Nasu-Hakola-Krankheit, Fibromyalgie, bipolarer Störung und Moyamoya-Krankheit geholfen. Daher dient die iMG-basierte Technik als wertvolles reverse-translationales Werkzeug und bietet neue Einblicke in die Aufklärung der dynamischen Pathophysiologie von Mikroglia bei einer Vielzahl von psychischen und physischen Erkrankungen.

Einleitung

In den letzten Jahren wurde vermutet, dass Gehirnentzündungen eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie verschiedener Gehirn- und neuropsychiatrischer Erkrankungen einnehmen; Die Mikroglia wurden durch postmortale Hirnanalysen beim Menschen und Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-basierte Bioimaging-Verfahren als wichtige immunmodulatorische Zellen hervorgehoben 1,2,3,4. Postmortale Hirn- und PET-Bildgebungsanalysen zeigen signifikante Befunde; Dennoch sind diese Ansätze ineffizient, wenn es darum geht, die dynamischen molekularen Aktiv....

Protokoll

Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Universität Kyushu genehmigt und entsprach allen Bestimmungen der Deklaration von Helsinki. Von allen Teilnehmern, einschließlich gesunder Probanden und Patienten, wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt, um ihr Blut zu analysieren und ihre Daten zu veröffentlichen. Materialien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt, und die Zusammensetzungen der Lösungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

1. Vorbereitung von Medien und Puffern für Versuche

1. Bereiten Sie das Isolationsmedium vor, indem Sie RPMI-1640 mit ....

Diskussion

Analysetechniken, die iMG-Zellen verwenden, können als wirksame reverse-translationale Forschungsinstrumente dienen ^5,6. Um ausreichende Mengen an menschlichen iMG-Zellen zu erzeugen, sollten die Experimentatoren ihre Studien unter Berücksichtigung bestimmter Aspekte konzipieren. Blutproben, die von Menschen stammen, sind äußerst empfindlich; Folglich rechtfertigen die erhaltenen Proben eine schnelle Verarbeitung und eine sorgfältige Handhabung, um eine Kont.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% paraformaldehyde	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI solution	DOJINDO	28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Nacalai Tesque	14249-24	described as "PBS (−)"
Fetal Bovine Serum	biowest	S1760-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	described as "density gradient medium"
Human FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	described as "magnetic column"
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	described as "magnetic stand"
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144	described as "mounting media"
recombinant human GM-CSF	R&D Systems	215-GM
recombinant human IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	secondary antibody, rabbit, 1:1000