Ingeniería de células similares a la microglía inducidas por sangre humana para la investigación traslacional inversa del cerebro

Resumen

Este estudio delinea un enfoque novedoso para el establecimiento de células similares a la microglía (iMG) derivadas de monocitos humanos que permiten la evaluación indirecta de la inflamación cerebral. Esto presenta un modelo celular que puede ser beneficioso para la investigación centrada en la posible inflamación del cerebro y los trastornos neuropsiquiátricos asociados.

Resumen

Investigaciones recientes que emplean modelos animales han puesto de manifiesto la importancia de la microglía como moduladores inmunológicos cruciales en diversas enfermedades neuropsiquiátricas y físicas. El análisis cerebral postmortem y la tomografía por emisión de positrones son métodos de investigación representativos que evalúan la activación microglial en pacientes humanos; Los hallazgos han revelado la activación de la microglía en los cerebros de pacientes que presentan diversos trastornos neuropsiquiátricos y dolor crónico. No obstante, la técnica mencionada se limita a facilitar la evaluación de aspectos limitados de la activación microglial.

En lugar de la biopsia cerebral y la técnica de células madre pluripotentes inducidas, inicialmente ideamos una técnica para generar células similares a la microglía (iMG) inducidas directamente a partir de monocitos de sangre periférica humana recién derivados suplementándolos con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos e interleucina 34 durante 2 semanas. Estas células iMG se pueden emplear para realizar análisis dinámicos, morfológicos y moleculares a nivel genético sobre la capacidad fagocítica y la liberación de citoquinas después de la estimulación del estrés a nivel celular. Recientemente, se ha utilizado un análisis exhaustivo del transcriptoma para verificar la similitud entre las células iMG humanas y la microglía primaria del cerebro.

Las células iMG derivadas de pacientes pueden servir como marcadores sustitutos clave para predecir la activación de la microglía en el cerebro humano y han ayudado a revelar la fisiopatología dinámica de la microglía previamente desconocida en pacientes con enfermedad de Nasu-Hakola, fibromialgia, trastorno bipolar y enfermedad de Moyamoya. Por lo tanto, la técnica basada en iMG sirve como una valiosa herramienta de traducción inversa y proporciona nuevos conocimientos para dilucidar la fisiopatología molecular de la microglía en una variedad de enfermedades mentales y físicas.

Introducción

En los últimos años, se ha sugerido que la inflamación cerebral asume un papel fundamental en la fisiopatología de diversos trastornos cerebrales y neuropsiquiátricos; las microglías han sido destacadas como células inmunomoduladoras clave por el análisis cerebral postmortem humano y las técnicas de bioimagen basadas en tomografía por emisión de positrones (PET) 1,2,3,4. Los análisis de imágenes postmortem del cerebro y la PET revelan hallazgos significativos; Sin embargo, estos enfoques son ineficientes en términos de capturar las actividades moleculares dinámicas de la microglía humana en el cerebro en su totalidad. Por lo tanto, se requieren estrategias novedosas que permitan la evaluación integral de las funciones y disfunciones de la microglía humana a nivel molecular y celular.

En 2014, originalmente diseñamos una técnica novedosa para^{producir células similares} a la microglía (iMG) inducidas directamente ^5,6, antes de la primera publicación de células similares a la microglía derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) en 2016⁷. En solo 2 semanas, convertimos con éxito monocitos de sangre periférica humana en células iMG mediante la optimización de las citocinas, el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y la interleucina 34 (IL-34). Cuando desarrollamos esta técnica, el innovador método de reprogramación de inducción de células neuronales a partir de células iPS o fibroblastos apenas comenzaba a prevalecer en el mundo 8,9,10,11. Sin embargo, en ese momento, aún no se había informado de un método para inducir células microgliales derivadas de iPS, y se deseaba la generación de un modelo microglial derivado de células somáticas humanas. Dado que se informó que citocinas como GM-CSF e IL-34, factor estimulante de colonias de macrófagos, eran necesarias para el desarrollo y mantenimiento de la microglía 12,13,14,15, planteamos la hipótesis de que una combinación de estas citocinas podría aplicarse directamente para generar un modelo celular microglial a partir de monocitos sanguíneos. Finalmente, logramos desarrollar un modelo de microglía derivada de monocitos mediante la combinación de GM-CSF e IL-34⁵. Además, algunas de estas combinaciones de citocinas también se emplean para inducir microglía a partir de células iPS ^7,16 y se supone que son un factor importante en la adquisición de características microgliales.

A diferencia de los métodos iPSC, las células iMG no requieren ninguna modificación genética y pueden generarse en muy poco tiempo mediante una simple inducción química, lo que se traduce en menores costes económicos y de tiempo. Además, las células iMG no requieren reprogramación genética, por lo que creemos que las células iMG son potentes células sustitutas para evaluar no solo los rasgos sino también los estados de la microglía humana. En el artículo inicial sobre la técnica iMG en 2014, confirmamos que las células iMG exhiben un fenotipo de microglía humana, que puede ser distinto de los monocitos y macrófagos. Por ejemplo, las células iMG exhibieron una relación de sobreexpresión del receptor de quimiocinas CX3C 1 (CX3CR1) y el receptor de quimiocinas C-C tipo 2 (CCR2) que los monocitos y los marcadores típicos de la microglía, incluida la proteína transmembrana 119 (TMEM 119) y el receptor purinérgico P2RY12 ^5,17. Recientemente, validamos que las células iMG derivadas de sangre periférica se asemejan a la microglía cerebral en su perfil de expresión génica de marcadores microgliales bien conocidos en el mismo paciente que se sometió a cirugías cerebrales¹⁸. Las células iMG pueden analizarse para determinar sus funciones dinámicas a nivel molecular, como la fagocitosis y la producción de citoquinas, y se espera que compensen las desventajas de la investigación cerebral postmortem y los estudios PET.

Hemos descubierto mecanismos fisiopatológicos dinámicos desconocidos que involucran a la microglía en pacientes diagnosticados con enfermedad de Nasu-Hakola⁵, fibromialgia¹⁹, trastorno bipolar^20,21 o enfermedad de Moyamoya²². Además, sobre la base de nuestra metodología original, varios laboratorios han empleado las células iMG (ciertos laboratorios han designado nombres alternativos a estas células) como una herramienta crucial de investigación traslacional inversa 23,24,25,26,27. Sellgren et al. generaron con éxito células iMG de acuerdo con nuestras recomendaciones y realizaron un análisis de microarrays, que reveló que estas células se parecen mucho a la microglía del cerebro humano²³. Recientemente, confirmamos la semejanza entre las células iMG humanas y la microglía primaria del cerebro utilizando la secuenciación de ARN¹⁸.

Este estudio tuvo como objetivo documentar la metodología para generar células iMG a partir de sangre periférica humana para facilitar la investigación traslacional inversa centrada en enfermedades neuropsiquiátricas. Esta técnica presenta el potencial como una herramienta analítica razonable que puede producir sin esfuerzo modelos celulares microgliales en un corto período de tiempo, incluso en laboratorios mal equipados que carecen de aparatos de transferencia de genes o personal competente.

Protocolo

El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Kyushu y cumplió con todas las disposiciones de la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes, incluidos voluntarios y pacientes sanos, para analizar su sangre y publicar sus datos. Los materiales y equipos se enumeran en la Tabla de Materiales, y las composiciones de las soluciones se detallan en la Tabla 1.

1. Preparación de medios y tampones para experimentos

1. Prepare el medio de aislamiento suplementando RPMI-1640 con un 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (56 °C, 30 min) y 1% de penicilina-estreptomicina.
2. Preparar el tampón de aislamiento complementando la solución tampón básica con una solución madre de albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5% y esterilizarla por filtración (0,22 μm).

2. Aislamiento de células mononucleares a partir de sangre total

1. Transfiera 15 mL del medio de gradiente de densidad a un tubo de centrifugación de gradiente de densidad de 50 mL y centrifugue a 1.000 × g durante 1 min a 20 °C.
   NOTA: Aísle 15 mL de sangre por tubo de centrifugación en gradiente de densidad de 50 mL. Aumente el número de tubos cuando el volumen sanguíneo sea alto.
2. Homogeneizar la sangre recogida en los tubos de heparina por inversión y retirar la tapa del tubo de extracción de sangre con pinzas esterilizadas al fuego.
3. Dispense un volumen igual (10-15 mL) de sangre al medio de gradiente de densidad en el tubo de centrifugación de gradiente de densidad.
4. Ajuste el nivel de deceleración de la centrífuga a 1 de 4 niveles y la centrífuga a 1.000 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: A esta tasa de desaceleración, una velocidad de rotación de 180 × g (1.000 rpm) se detiene en 3 min.
5. Prepare un número igual de tubos de centrífuga de 50 ml que de tubos de centrifugación en gradiente de densidad de 50 ml y llene cada tubo con 10 ml de PBS (-).
6. Retire la capa superior de plasma hasta aproximadamente 1 cm por encima de la capa leucocitaria después de la centrifugación.
   NOTA: Inserte una pipeta de aspiración verticalmente en el tubo y aspire con cuidado desde el centro de la superficie del líquido. No aspire en exceso para evitar perturbar el pelaje leuco.
7. Decantar todo el sobrenadante restante del tubo de centrifugación en gradiente de densidad de 50 mL en un tubo de centrífuga que contenga 10 mL de PBS (-).
8. Restablezca el nivel de desaceleración de la centrífuga a 3 o 4 niveles y centrifuga a 250 × g durante 10 minutos en RT. Durante este paso, prepare un tubo de centrífuga de 50 ml y dos de 15 ml y un filtro de células de 100 μm.
9. Después de la centrifugación, establezca la temperatura de la centrífuga a 4 °C. Busque una bolita blanca con una periferia roja en la parte inferior del tubo de centrífuga. Retire el sobrenadante por aspiración y afloje el pellet suavemente golpeando.
10. Coloque un filtro de células de 100 μm en el tubo cónico de 50 ml con pinzas esterilizadas contra incendios.
11. Incorpore 13 mL de medio aislante en uno de los tubos centrífugos y lave la pared interna para recoger las células correctamente. Tome la suspensión celular y lave los tubos centrífugos restantes de manera consecutiva. Después de recolectar las células de todos los tubos, filtre la suspensión celular a través de un filtro celular en el tubo cónico de 50 ml.
    NOTA: El medio de aislamiento debe enfriarse durante todo el proceso de aislamiento (pasos 2.11-2.16).
12. Lave cada tubo nuevamente con 13 mL de medio de aislamiento como se describe en el paso 2.11. Recoge un total de 26 mL de suspensión celular.
13. Dispense cantidades iguales en dos tubos cónicos de 15 ml, enumere las células y calcule la concentración adecuada de tampón de aislamiento (60 μl de tampón por 10⁷ células en total) para el paso 2.16.
    NOTA: El tubo cónico de 15 ml es mejor para trabajar porque el volumen de líquido es pequeño y el líquido burbujea fácilmente al pipetear en el paso 2.16.
14. Centrifugar a 250 × g durante 10 min a 4 °C.
15. Durante la centrifugación, desinfecte a fondo el soporte magnético (especialmente la parte en contacto con la columna) con etanol al 70% y colóquelo en el banco para que se seque al aire. Mantenga el tampón de aislamiento en hielo.
16. Retire el sobrenadante por aspiración (en esta etapa, busque gránulos rojos de ~ 1 mm de grosor debido a la presencia de glóbulos rojos), agregue la cantidad adecuada de tampón de aislamiento y afloje el gránulo suavemente pipeteando ~ 20 veces.

3. Aislamiento de monocitos mediante microperlas CD11b

1. Reactivo de bloqueo Vortex Human FcR durante 10 s antes de la aplicación. Incorporar la cantidad necesaria de reactivo (20 μL de reactivo de bloqueo FcR por 10⁷ células en total) e incubar en una cámara a 4 °C durante 5 min.
2. Agite las microesferas CD11b durante 10 s antes de la aplicación. Incorporar la cantidad necesaria de reactivo (20 μL de microperlas CD11b por cada 10⁷ células en total) e incubar en una cámara de 4 °C durante 20 min agitando a mano cada 5 min.
3. Después de la incubación, añadir 10 ml de tampón de aislamiento, suspender mediante un pipeteo suave y centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
4. Durante la centrifugación, coloque la columna magnética en el soporte magnético y enjuáguela con 3 ml de tampón de aislamiento.
   NOTA: Absténgase de tocar la parte magnética de la columna y colóquela correctamente. Si entran burbujas en la columna, retírelas con una pipeta. El tampón de aislamiento debe enfriarse durante todo el proceso de aislamiento (pasos 3.4-3.9).
5. Retirar el sobrenadante post-centrifugación por aspiración, incorporar 1 mL de tampón de aislamiento, mezclar pipeteando suavemente y aplicar la suspensión sobre la columna.
6. Lave la columna 3 veces agregando 3 ml de tampón de aislamiento cada vez que el depósito de la columna esté vacío.
7. Coloque la columna en un tubo cónico de 15 mL sin tocar la parte magnética; incorpore 5 mL de tampón de aislamiento en la columna y fuerce el líquido a través de la columna con un émbolo insertado en el tubo.
8. Centrifugar la suspensión celular recogida en el tubo a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
9. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en un medio de aislamiento. Como se recuperará ~ 5-10% del número de celdas contadas en el paso 2.13, ajuste el volumen de suspensión de acuerdo con el número de celdas.
   NOTA: El medio de aislamiento debe usarse a RT y no calentarse para evitar cambios bruscos de temperatura desde 4 °C.
10. Enumerar las células y 500 μL de suspensión celular en cada pocillo de placas de 24 pocillos a una concentración de 40 × 10⁴ células/mL e incubar durante la noche.
    NOTA: Las suspensiones celulares deben pipetearse adecuadamente de acuerdo con el volumen de siembra ajustado requerido para las diferentes placas. Por ejemplo, 1 mL para un pocillo en una placa de 12 pocillos y 250 μL para un pocillo en un portaobjetos de cámara de 8 pocillos.
11. Finalmente, deseche o desinfecte el equipo contaminado de acuerdo con la política de manejo de desechos infecciosos establecida por la instalación.

4. Inducción de células iMG a partir de monocitos

1. Prepare el medio de inducción suplementando el medio de inducción basal con una solución antibiótica-antimicótica al 1%, 10 ng/mL de GM-CSF humano recombinante y 100 ng/mL de IL-34 humana recombinante.
2. Reemplace el medio de aislamiento de la siembra del día anterior por medio de inducción. Incline la placa hacia adelante y aspire rápidamente el medio agotado desde el borde frontal del fondo del pocillo con una pipeta Pasteur. Reemplace el medio a razón de un máximo de 1 placa (= 24 pocillos) a la vez e incorpore inmediatamente 500 μL de medio de inducción suavemente.
   NOTA: Los monocitos adheridos deben seleccionarse en este paso.
3. Incubar las células durante 14 días para completar la inducción.
4. Vuelva a sustituir el medio por 500 μL de medio de inducción después de 14 días. Posteriormente, para el mantenimiento posterior a la inducción de las células, reemplace el medio de inducción con 500 μL de medio de inducción fresco cada semana.

5. Inmunocitoquímica

1. Retire el medio del portaobjetos de la cámara de 8 pocillos sembrado con células en el paso 3.10 por aspiración y enjuague con PBS (-).
2. Fijar las celdas durante 20 min a RT con un 4% de paraformaldehído.
3. Retire el reactivo fijador y enjuague las células durante 3 x 5 min con PBS (-).
4. Permeabilizar las células con PBS (-) que contiene 0,1% de Triton X-100 en RT.
5. Incubar las células permeabilizadas con una solución de bloqueo (3% BSA/PBS (-)) durante 1 h a RT.
6. Incubar las células durante la noche con anticuerpos primarios (Tabla de Materiales) a 4 °C.
   NOTA: Todos los anticuerpos se diluyen en una solución bloqueante.
7. Enjuague las celdas durante 3 x 5 min con PBS (-) durante 5 min cada una.
8. Incubar las células enjuagadas con los anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia apropiados durante 1 h en RT (Tabla de Materiales).
9. Enjuague las células durante 3 x 5 min con PBS (-) para eliminar los anticuerpos secundarios.
10. Incubar las células con una solución de DAPI (1:10.000) diluida con PBS (-) durante 5 min en RT.
11. Enjuague las celdas durante 3 x 5 min con PBS (-).
12. Monte el pocillo utilizando el medio de montaje y visualice las células bajo un microscopio de fluorescencia.

Resultados

Es importante destacar que existe una gran heterogeneidad a nivel de persona y de tiempo en los caracteres de las células iMG, incluidas las morfologías y las expresiones génicas. Las células iMG en ciertos individuos asumen una apariencia ramificada numerosa (Figura 1A), mientras que en otros permanecen esféricas (Figura 1B). Las características de la iMG pueden diferir incluso dentro de un mismo individuo, lo que convierte a las células iMG en una herra...

Discusión

Las técnicas analíticas que emplean células iMG pueden servir como potentes herramientas de investigación traslacional inversa ^5,6. Para generar cantidades suficientes de células iMG humanas, los experimentadores deben diseñar sus estudios teniendo en cuenta ciertas cuestiones. Las muestras de sangre derivadas de seres humanos son extremadamente sensibles; En consecuencia, las muestras obtenidas justifican un procesamiento rápido y un manejo meticuloso par...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% paraformaldehyde	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI solution	DOJINDO	28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Nacalai Tesque	14249-24	described as "PBS (−)"
Fetal Bovine Serum	biowest	S1760-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	described as "density gradient medium"
Human FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	described as "magnetic column"
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	described as "magnetic stand"
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144	described as "mounting media"
recombinant human GM-CSF	R&D Systems	215-GM
recombinant human IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	secondary antibody, rabbit, 1:1000