Ingeniería de células similares a la microglía inducidas por sangre humana para la investigación traslacional inversa del cerebro

Resumen

Este estudio delinea un enfoque novedoso para el establecimiento de células similares a la microglía (iMG) derivadas de monocitos humanos que permiten la evaluación indirecta de la inflamación cerebral. Esto presenta un modelo celular que puede ser beneficioso para la investigación centrada en la posible inflamación del cerebro y los trastornos neuropsiquiátricos asociados.

Resumen

Investigaciones recientes que emplean modelos animales han puesto de manifiesto la importancia de la microglía como moduladores inmunológicos cruciales en diversas enfermedades neuropsiquiátricas y físicas. El análisis cerebral postmortem y la tomografía por emisión de positrones son métodos de investigación representativos que evalúan la activación microglial en pacientes humanos; Los hallazgos han revelado la activación de la microglía en los cerebros de pacientes que presentan diversos trastornos neuropsiquiátricos y dolor crónico. No obstante, la técnica mencionada se limita a facilitar la evaluación de aspectos limitados de la activación microglial.

En lugar de la biopsia cerebral y la técnica de células madre pluripotentes inducidas, inicialmente ideamos una técnica para generar células similares a la microglía (iMG) inducidas directamente a partir de monocitos de sangre periférica humana recién derivados suplementándolos con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos e interleucina 34 durante 2 semanas. Estas células iMG se pueden emplear para realizar análisis dinámicos, morfológicos y moleculares a nivel genético sobre la capacidad fagocítica y la liberación de citoquinas después de la estimulación del estrés a nivel celular. Recientemente, se ha utilizado un análisis exhaustivo del transcriptoma para verificar la similitud entre las células iMG humanas y la microglía primaria del cerebro.

Las células iMG derivadas de pacientes pueden servir como marcadores sustitutos clave para predecir la activación de la microglía en el cerebro humano y han ayudado a revelar la fisiopatología dinámica de la microglía previamente desconocida en pacientes con enfermedad de Nasu-Hakola, fibromialgia, trastorno bipolar y enfermedad de Moyamoya. Por lo tanto, la técnica basada en iMG sirve como una valiosa herramienta de traducción inversa y proporciona nuevos conocimientos para dilucidar la fisiopatología molecular de la microglía en una variedad de enfermedades mentales y físicas.

Introducción

En los últimos años, se ha sugerido que la inflamación cerebral asume un papel fundamental en la fisiopatología de diversos trastornos cerebrales y neuropsiquiátricos; las microglías han sido destacadas como células inmunomoduladoras clave por el análisis cerebral postmortem humano y las técnicas de bioimagen basadas en tomografía por emisión de positrones (PET) 1,2,3,4. Los análisis de imágenes postmortem del cerebro y la PET revelan hallazgos significativos; Sin embargo, estos enfoques son ineficientes en términos de capturar las actividad....

Protocolo

El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Kyushu y cumplió con todas las disposiciones de la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes, incluidos voluntarios y pacientes sanos, para analizar su sangre y publicar sus datos. Los materiales y equipos se enumeran en la Tabla de Materiales, y las composiciones de las soluciones se detallan en la Tabla 1.

1. Preparación de medios y tampones para experimentos

1. Prepare el medio de aislamiento suplementando RPMI-1640 con un 10% de suero fetal....

Discusión

Las técnicas analíticas que emplean células iMG pueden servir como potentes herramientas de investigación traslacional inversa ^5,6. Para generar cantidades suficientes de células iMG humanas, los experimentadores deben diseñar sus estudios teniendo en cuenta ciertas cuestiones. Las muestras de sangre derivadas de seres humanos son extremadamente sensibles; En consecuencia, las muestras obtenidas justifican un procesamiento rápido y un manejo meticuloso par.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% paraformaldehyde	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI solution	DOJINDO	28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Nacalai Tesque	14249-24	described as "PBS (−)"
Fetal Bovine Serum	biowest	S1760-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	described as "density gradient medium"
Human FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	described as "magnetic column"
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	described as "magnetic stand"
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144	described as "mounting media"
recombinant human GM-CSF	R&D Systems	215-GM
recombinant human IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	secondary antibody, rabbit, 1:1000