Ingénierie de cellules microgliales induites par le sang humain pour la recherche sur le cerveau à traduction inverse

Résumé

Cette étude définit une nouvelle approche pour l’établissement de cellules microgliales (iMG) dérivées de monocytes humains qui permettent l’évaluation indirecte de l’inflammation cérébrale. Il s’agit d’un modèle cellulaire qui pourrait être bénéfique pour la recherche axée sur l’inflammation potentielle du cerveau et les troubles neuropsychiatriques associés.

Résumé

Des recherches récentes utilisant des modèles animaux ont mis en évidence l’importance de la microglie en tant que modulateurs immunologiques cruciaux dans diverses maladies neuropsychiatriques et physiques. L’analyse cérébrale post-mortem et l’imagerie par tomographie par émission de positrons sont des méthodes de recherche représentatives qui évaluent l’activation microgliale chez les patients humains. Les résultats ont révélé l’activation de la microglie dans le cerveau de patients présentant divers troubles neuropsychiatriques et des douleurs chroniques. Néanmoins, la technique susmentionnée ne fait que faciliter l’évaluation d’aspects limités de l’activation microgliale.

Au lieu de la biopsie cérébrale et de la technique des cellules souches pluripotentes induites, nous avons initialement conçu une technique pour générer des cellules de type microglie (iMG) directement induites à partir de monocytes de sang périphérique humain fraîchement dérivés en les complétant avec du facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages et de l’interleukine 34 pendant 2 semaines. Ces cellules iMG peuvent être utilisées pour effectuer des analyses morphologiques et moléculaires dynamiques concernant la capacité phagocytaire et les libérations de cytokines suite à une stimulation du stress au niveau cellulaire. Récemment, une analyse complète du transcriptome a été utilisée pour vérifier la similitude entre les cellules iMG humaines et la microglie primaire du cerveau.

Les cellules iMG dérivées de patients peuvent servir de marqueurs de substitution clés pour prédire l’activation microgliale dans le cerveau humain et ont contribué à dévoiler une physiopathologie dynamique de la microglie jusqu’alors inconnue chez les patients atteints de la maladie de Nasu-Hakola, de la fibromyalgie, du trouble bipolaire et de la maladie de Moyamoya. Par conséquent, la technique basée sur l’iMG constitue un outil précieux de traduction inverse et fournit de nouvelles perspectives pour élucider la dynamique de la physiopathologie moléculaire de la microglie dans diverses maladies mentales et physiques.

Introduction

Au cours des dernières années, il a été suggéré que l’inflammation cérébrale joue un rôle central dans la physiopathologie de divers troubles cérébraux et neuropsychiatriques ; les microglies ont été mises en évidence comme des cellules immunomodulatrices clés par l’analyse cérébrale post-mortem humaine et les techniques de bio-imagerie basées sur la tomographie par émission de positons (TEP) 1,2,3,4. Les analyses post-mortem du cerveau et de l’imagerie TEP révèlent des résultats significatifs ; Néanmoins, ces approches sont inefficaces en termes de capture des activités moléculaires dynamiques de la microglie humaine dans le cerveau dans leur intégralité. Par conséquent, de nouvelles stratégies sont nécessaires pour permettre une évaluation complète des fonctions et des dysfonctionnements microgliaux humains aux niveaux moléculaire et cellulaire.

En 2014, nous avons initialement mis au point une nouvelle technique pour produire^{des cellules} microglia-like (iMG) directement induites ^5,6, avant la première publication de cellules microglia-like dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSC) en 2016⁷. En seulement 2 semaines, nous avons réussi à convertir les monocytes du sang périphérique humain en cellules iMG en optimisant les cytokines, le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) et l’interleukine 34 (IL-34). Lorsque nous avons développé cette technique, la méthode innovante de reprogrammation consistant à induire des cellules neuronales à partir de cellules iPS ou de fibroblastes commençait tout juste à s’imposer dans le monde 8,9,10,11. Cependant, à cette époque, une méthode pour induire des cellules microgliales dérivées d’iPS n’avait pas encore été rapportée, et la génération d’un modèle microglial dérivé de cellules somatiques humaines était souhaitée. Étant donné que des cytokines telles que GM-CSF et IL-34, facteur de stimulation des colonies de macrophages, ont été signalées comme étant nécessaires au développement et au maintien de la microglie 12,13,14,15, nous avons émis l’hypothèse qu’une combinaison de ces cytokines pourrait être appliquée directement pour générer un modèle cellulaire microglial à partir de monocytes sanguins. Enfin, nous avons réussi à développer un modèle de microglie dérivé des monocytes en combinant GM-CSF et IL-34⁵. De plus, certaines de ces combinaisons de cytokines sont également utilisées pour induire des cellules microgliales à partir de cellules iPS ^7,16 et sont supposées être un facteur important dans l’acquisition des caractéristiques microgliales.

Contrairement aux méthodes iPSC, les cellules iMG ne nécessitent aucune modification génétique et peuvent être générées en très peu de temps par simple induction chimique, ce qui permet de réduire les coûts en temps et en argent. De plus, les cellules iMG ne nécessitent pas de reprogrammation génétique, nous pensons donc que les cellules iMG sont de puissantes cellules de substitution pour évaluer non seulement les traits mais aussi les états de la microglie humaine. Dans l’article initial sur la technique iMG en 2014, nous avons confirmé que les cellules iMG présentent un phénotype de la microglie humaine, qui peut être distinct des monocytes et des macrophages. Par exemple, les cellules iMG ont présenté un rapport de surexpression du récepteur des chimiokines CX3C 1 (CX3CR1) et du récepteur des chimiokines C-C de type 2 (CCR2) par rapport aux monocytes et aux marqueurs microgliaux typiques, y compris la protéine transmembranaire 119 (TMEM 119) et le récepteur purinergique P2RY12 ^5,17. Récemment, nous avons validé que les cellules iMG dérivées du sang périphérique ressemblent à la microglie cérébrale dans leur profil d’expression génique de marqueurs microgliaux bien connus chez le même patient qui a subi une chirurgie cérébrale¹⁸. Les cellules iMG peuvent être analysées pour des fonctions dynamiques au niveau moléculaire, telles que la phagocytose et la production de cytokines, et devraient compenser les inconvénients de la recherche cérébrale post-mortem et des études TEP.

Nous avons découvert des mécanismes physiopathologiques dynamiques jusqu’alors inconnus impliquant la microglie chez des patients diagnostiqués avec la maladie de Nasu-Hakola⁵, la fibromyalgie¹⁹, le trouble bipolaire^20,21 ou la maladie de Moyamoya²². De plus, sur la base de notre méthodologie originale, divers laboratoires ont utilisé les cellules iMG (certains laboratoires ont désigné d’autres noms pour ces cellules) comme un outil de recherche translationnel inverse crucial 23,24,25,26,27. Sellgren et al. ont réussi à générer des cellules iMG conformément à nos recommandations et ont effectué une analyse de microréseau, qui a révélé que ces cellules ressemblent étroitement à la microglie du cerveau humain²³. Récemment, nous avons confirmé la ressemblance entre les cellules iMG humaines et la microglie primaire du cerveau en utilisant le séquençage de l’ARN¹⁸.

Cette étude visait à documenter la méthodologie de génération de cellules iMG à partir de sang périphérique humain afin de faciliter la recherche translationnelle inverse axée sur les maladies neuropsychiatriques. Cette technique présente le potentiel d’un outil analytique raisonnable qui peut produire sans effort des modèles de cellules microgliales en peu de temps, même dans des laboratoires mal équipés qui manquent d’appareils de transfert de gènes ou de personnel compétent.

Protocole

Le protocole d’étude a été approuvé par le Comité d’éthique de l’Université de Kyushu et était conforme à toutes les dispositions de la Déclaration d’Helsinki. Tous les participants, y compris les volontaires en bonne santé et les patients, ont obtenu le consentement éclairé de tous les participants, pour analyser leur sang et publier leurs données. Les matériaux et les équipements sont répertoriés dans le tableau des matériaux, et les compositions des solutions sont détaillées dans le tableau 1.

1. Préparation des milieux et des tampons pour les expériences

1. Préparez le milieu d’isolement en complétant le RPMI-1640 avec 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (56 °C, 30 min) et 1 % de pénicilline-streptomycine.
2. Préparez le tampon d’isolement en complétant la solution tampon basique avec une solution mère d’albumine sérique bovine (BSA) à 0,5 % et stérilisez-la par filtration (0,22 μm).

2. Isolement de cellules mononucléées à partir du sang total

1. Transvaser 15 mL du milieu à gradient de densité dans un tube de centrifugation à gradient de densité de 50 mL et centrifuger à 1 000 × g pendant 1 min à 20 °C.
   REMARQUE : Isolez 15 ml de sang par tube de centrifugation à gradient de densité de 50 ml. Augmentez le nombre de tubes lorsque le volume sanguin est élevé.
2. Homogénéiser le sang recueilli dans les tubes d’héparine par inversion et retirer le couvercle du tube de prélèvement sanguin à l’aide d’une pince à épiler stérilisée au feu.
3. Distribuer un volume égal (10 à 15 ml) de sang dans le milieu à gradient de densité dans le tube de centrifugation à gradient de densité.
4. Réglez le niveau de décélération de la centrifugeuse sur 1 des 4 niveaux et centrifugez à 1 000 × g pendant 10 min à température ambiante (RT).
   REMARQUE : À ce taux de décélération, une vitesse de rotation de 180 × g (1 000 tr/min) s’arrête en 3 min.
5. Préparez un nombre égal de tubes à centrifuger de 50 mL et de tubes de centrifugation à gradient de densité de 50 mL et remplissez chaque tube avec 10 mL de PBS (−).
6. Retirez la couche supérieure de plasma jusqu’à environ 1 cm au-dessus de la couche leucocytaire après la centrifugation.
   REMARQUE : Insérez une pipette d’aspiration verticalement dans le tube et aspirez soigneusement à partir du centre de la surface du liquide. Ne pas trop aspirer pour éviter de déranger la couche leucocytaire.
7. Décantez tout le surnageant restant du tube de centrifugation à gradient de densité de 50 mL dans un tube à centrifuger contenant 10 mL de PBS (−).
8. Réinitialisez le niveau de décélération de la centrifugeuse à 3 ou 4 niveaux et centrifugez à 250 × g pendant 10 min à RT. Au cours de cette étape, préparez un tube à centrifuger de 50 mL et deux tubes à centrifuger de 15 mL ainsi qu’une crépine à cellules de 100 m.
9. Après la centrifugation, établissez la température de la centrifugeuse à 4 °C. Recherchez une pastille blanche avec une périphérie rouge au fond du tube de centrifugation. Retirer le surnageant par aspiration et détacher doucement la pastille en tapotant dessus.
10. Placez une crépine à cellules de 100 μm sur le tube conique de 50 mL à l’aide d’une pince à épiler stérilisée au feu.
11. Incorporer 13 ml de milieu d’isolement dans l’un des tubes centrifugés et laver la paroi interne pour bien recueillir les cellules. Prenez la suspension cellulaire et lavez les tubes centrifugés restants de manière consécutive. Après avoir recueilli les cellules de tous les tubes, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine à cellules dans le tube conique de 50 ml.
    REMARQUE : Le fluide d’isolement doit être refroidi tout au long du processus d’isolement (étapes 2.11-2.16).
12. Lavez de nouveau chaque tube avec 13 ml de milieu d’isolement comme décrit à l’étape 2.11. Prélever un total de 26 mL de suspension cellulaire.
13. Répartissez des quantités égales dans deux tubes coniques de 15 mL, énumérez les cellules et calculez la concentration appropriée de tampon d’isolement (60 μL de tampon pour 10⁷ cellules au total) pour l’étape 2.16.
    REMARQUE : Il est préférable de travailler avec le tube conique de 15 ml car le volume de liquide est faible et le liquide bouillonne facilement lors du pipetage à l’étape 2.16.
14. Centrifugeuse à 250 × g pendant 10 min à 4 °C.
15. Lors de la centrifugation, désinfectez soigneusement le support magnétique (en particulier la partie en contact avec la colonne) avec de l’éthanol à 70% et placez-le sur le banc pour le faire sécher à l’air. Gardez le tampon d’isolement sur de la glace.
16. Retirez le surnageant par aspiration (à ce stade, recherchez des pastilles rouges de ~1 mm d’épaisseur en raison de la présence de globules rouges), ajoutez la quantité appropriée de tampon d’isolement et détachez doucement la pastille en pipetant ~20x.

3. Isolement des monocytes à l’aide de microbilles CD11b

1. Réactif de blocage du FcR humain Vortex pendant 10 s avant l’application. Incorporer la quantité requise de réactif (20 μL de réactif bloquant FcR pour 10^{à 7} cellules au total) et incuber dans une chambre à 4 °C pendant 5 min.
2. Vortex les microbilles CD11b pendant 10 s avant l’application. Incorporer la quantité requise de réactif (20 μL de microbilles CD11b pour 10^{à 7} cellules au total) et incuber dans une chambre à 4 °C pendant 20 min en agitant à la main toutes les 5 min.
3. Après l’incubation, ajouter 10 mL de tampon d’isolement, suspendre par pipetage doux et centrifuger à 300 × g pendant 10 min à 4 °C.
4. Pendant la centrifugation, placez la colonne magnétique sur le support magnétique et rincez-la avec 3 mL de tampon d’isolement.
   REMARQUE : Évitez de toucher la partie magnétique de la colonne et positionnez correctement la colonne. Si des bulles pénètrent dans la colonne, retirez-les à l’aide d’une pipette. Le tampon d’isolement doit être réfrigéré tout au long du processus d’isolement (étapes 3.4 à 3.9).
5. Retirer le surnageant de postcentrifugation par aspiration, incorporer 1 mL de tampon d’isolement, mélanger par pipetage doux et appliquer la suspension sur la colonne.
6. Lavez la colonne 3 fois en ajoutant 3 ml de tampon d’isolement chaque fois que le réservoir de la colonne est vide.
7. Placez la colonne dans un tube conique de 15 mL sans toucher la partie magnétique ; incorporer 5 mL de tampon d’isolement dans la colonne et forcer le liquide à s’écouler à travers la colonne à l’aide d’un piston inséré dans le tube.
8. Centrifuger la suspension cellulaire recueillie dans le tube à 300 × g pendant 10 min à 4 °C.
9. Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un milieu d’isolement. Comme ~5 à 10 % du nombre de cellules comptées à l’étape 2.13 sera récupéré, ajustez le volume de suspension en fonction du nombre de cellules.
   REMARQUE : Le fluide d’isolation doit être utilisé à RT et non chauffé pour éviter un changement rapide de température à partir de 4 °C.
10. Énumérer les cellules et aliquote 500 μL de suspension cellulaire dans chaque puits de plaques à 24 puits à une concentration de 40 × 10⁴ cellules/mL et incuber pendant la nuit.
    REMARQUE : Les suspensions cellulaires doivent être pipetées de manière appropriée en fonction du volume de semis ajusté requis pour différentes plaques. Par exemple, 1 mL pour un puits dans une plaque à 12 puits et 250 μL pour un puits dans une lame à chambre à 8 puits.
11. Enfin, éliminer ou désinfecter l’équipement contaminé conformément à la politique de manipulation des déchets infectieux établie par l’installation.

4. Induction de cellules iMG à partir de monocytes

1. Préparez le milieu d’induction en complétant le milieu d’induction basal avec une solution d’antibiotique-antimycosique à 1 %, 10 ng/mL de GM-CSF humain recombinant et 100 ng/mL d’IL-34 humaine recombinante.
2. Remplacez le milieu d’isolement de l’ensemencement de la veille par un milieu à induction. Inclinez la plaque vers l’avant et aspirez rapidement le fluide appauvri par le bord avant du fond du puits à l’aide d’une pipette Pasteur. Remplacez le fluide à raison d’un maximum de 1 plaque (= 24 puits) à la fois, et incorporez immédiatement 500 μL de fluide à induction en douceur.
   REMARQUE : Les monocytes adhérents doivent être sélectionnés dans cette étape.
3. Incuber les cellules pendant 14 jours pour terminer l’induction.
4. Remplacez à nouveau le milieu par 500 μL de milieu à induction après 14 jours. Par la suite, pour l’entretien post-induction des cellules, remplacez le milieu d’induction par 500 μL de milieu d’induction frais chaque semaine.

5. Immunocytochimie

1. Retirer le milieu de la lame de chambre à 8 puits ensemencée de cellules à l’étape 3.10 par aspiration et rincer avec du PBS (-).
2. Fixez les cellules pendant 20 min à RT avec 4% de paraformaldéhyde.
3. Retirer le réactif fixateur et rincer les cellules pendant 3 x 5 min avec du PBS (-).
4. Perméabiliser les cellules avec du PBS (-) contenant 0,1 % de Triton X-100 à RT.
5. Incuber les cellules perméabilisées avec une solution bloquante (3% BSA/PBS (−)) pendant 1 h à RT.
6. Incuber les cellules pendant la nuit avec des anticorps primaires (Table des matières) à 4 °C.
   REMARQUE : Tous les anticorps sont dilués dans une solution bloquante.
7. Rincez les cellules pendant 3 x 5 minutes avec du PBS (-) pendant 5 minutes chacune.
8. Incuber les cellules rincées avec les anticorps secondaires appropriés marqués par fluorescence pendant 1 h à RT (Table of Materials).
9. Rincez les cellules pendant 3 x 5 minutes avec du PBS (-) pour éliminer les anticorps secondaires.
10. Incuber les cellules avec une solution de DAPI (1:10 000) diluée avec du PBS (-) pendant 5 min à RT.
11. Rincer les cellules pendant 3 x 5 min avec du PBS (-).
12. Montez le puits à l’aide du milieu de montage et visualisez les cellules au microscope à fluorescence.

Résultats

Il est important de noter qu’il existe une grande hétérogénéité au niveau de la personne et au niveau du moment dans les caractères des cellules iMG, y compris les morphologies et les expressions génétiques. Chez certains individus, les cellules iMG prennent une apparence de nombreuses ramifications (Figure 1A), tandis que chez d’autres, elles restent sphériques (Figure 1B). Les caractéristiques de l’iMG peuvent différer même au sein d’un mê...

Discussion

Les techniques analytiques utilisant des cellules iMG peuvent constituer de puissants outils de recherche translationnelle inverse ^5,6. Pour générer des quantités suffisantes de cellules iMG humaines, les expérimentateurs doivent concevoir leurs études en tenant compte de certains problèmes. Les échantillons de sang provenant d’êtres humains sont extrêmement sensibles ; Par conséquent, les échantillons obtenus nécessitent un traitement rapide et une...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% paraformaldehyde	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI solution	DOJINDO	28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Nacalai Tesque	14249-24	described as "PBS (−)"
Fetal Bovine Serum	biowest	S1760-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	described as "density gradient medium"
Human FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	described as "magnetic column"
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	described as "magnetic stand"
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144	described as "mounting media"
recombinant human GM-CSF	R&D Systems	215-GM
recombinant human IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	secondary antibody, rabbit, 1:1000