Ingegnerizzazione di cellule simili alla microglia indotte dal sangue umano per la ricerca cerebrale traslazionale inversa

Riepilogo

Questo studio delinea un nuovo approccio per la creazione di cellule simili alla microglia (iMG) derivate da monociti umani che consentono la valutazione indiretta dell'infiammazione cerebrale. Questo presenta un modello cellulare che può essere utile per la ricerca incentrata sulla potenziale infiammazione del cervello e sui disturbi neuropsichiatrici associati.

Abstract

Recenti indagini su modelli animali hanno evidenziato l'importanza delle microglia come modulatori immunologici cruciali in varie malattie neuropsichiatriche e fisiche. L'analisi cerebrale post mortem e l'imaging con tomografia a emissione di positroni sono metodi di ricerca rappresentativi che valutano l'attivazione microgliale nei pazienti umani; I risultati hanno rivelato l'attivazione della microglia nel cervello di pazienti che presentano vari disturbi neuropsichiatrici e dolore cronico. Tuttavia, la tecnica di cui sopra facilita semplicemente la valutazione di aspetti limitati dell'attivazione microgliale.

Al posto della biopsia cerebrale e della tecnica delle cellule staminali pluripotenti indotte, abbiamo inizialmente ideato una tecnica per generare cellule simili alla microglia indotte direttamente (iMG) da monociti del sangue periferico umano appena derivati, integrandole con un fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi e interleuchina 34 per 2 settimane. Queste cellule iMG possono essere impiegate per eseguire analisi morfologiche dinamiche e a livello molecolare riguardanti la capacità fagocitaria e il rilascio di citochine in seguito a stimolazione da stress a livello cellulare. Recentemente, l'analisi completa del trascrittoma è stata utilizzata per verificare la somiglianza tra le cellule iMG umane e la microglia primaria cerebrale.

Le cellule iMG derivate dal paziente possono fungere da marcatori surrogati chiave per prevedere l'attivazione della microglia nel cervello umano e hanno contribuito alla rivelazione della fisiopatologia dinamica precedentemente sconosciuta della microglia in pazienti con malattia di Nasu-Hakola, fibromialgia, disturbo bipolare e malattia di Moyamoya. Pertanto, la tecnica basata su iMG funge da prezioso strumento di traduzione inversa e fornisce nuove intuizioni per chiarire la fisiopatologia molecolare della microglia in una varietà di malattie mentali e fisiche.

Introduzione

Negli ultimi anni, è stato suggerito che l'infiammazione cerebrale assuma un ruolo fondamentale nella fisiopatologia di vari disturbi cerebrali e neuropsichiatrici; le microglia sono state evidenziate come cellule immunomodulatorie chiave dall'analisi cerebrale post mortem umana e dalle tecniche di bio-imaging basate sulla tomografia a emissione di positroni (PET) 1,2,3,4. Le analisi di imaging cerebrale e PET postmortem rivelano risultati significativi; Tuttavia, questi approcci sono inefficienti in termini di cattura delle attività molecolari dinamiche delle microglia umane nel cervello nella loro interezza. Pertanto, sono necessarie nuove strategie per consentire la valutazione completa delle funzioni e delle disfunzioni della microglia umana a livello molecolare e cellulare.

Nel 2014, abbiamo originariamente ingegnerizzato una nuova tecnica per produrre cellule simili alla microglia indotte direttamente (iMG) ^5,6, prima della prima pubblicazione di cellule simili alla microglia derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) nel 2016⁷. In sole 2 settimane, abbiamo convertito con successo i monociti del sangue periferico umano in cellule iMG ottimizzando le citochine, il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) e l'interleuchina 34 (IL-34). Quando abbiamo sviluppato questa tecnica, l'innovativo metodo di riprogrammazione per indurre cellule neuronali da cellule iPS o fibroblasti stava appena iniziando a prevalere nel mondo 8,9,10,11. Tuttavia, a quel tempo, non era ancora stato riportato un metodo per indurre cellule microgliali derivate da iPS e si desiderava la generazione di un modello microgliale derivato da cellule somatiche umane. Poiché citochine come GM-CSF e IL-34, fattore stimolante le colonie di macrofagi, sono state riportate come necessarie per lo sviluppo e il mantenimento della microglia 12,13,14,15, abbiamo ipotizzato che una combinazione di queste citochine potrebbe essere applicata direttamente per generare un modello cellulare microgliale da monociti del sangue. Infine, siamo riusciti a sviluppare un modello di microglia derivato dai monociti combinando GM-CSF e IL-34⁵. Inoltre, alcune di queste combinazioni di citochine sono impiegate anche per indurre la microglia dalle cellule iPS ^7,16 e si presume che siano un fattore importante nell'acquisizione delle caratteristiche microgliali.

A differenza dei metodi iPSC, le cellule iMG non richiedono alcuna modificazione genetica e possono essere generate in brevissimo tempo mediante semplice induzione chimica, con conseguente riduzione dei tempi e dei costi finanziari. Inoltre, le cellule iMG non richiedono la riprogrammazione genetica, quindi riteniamo che le cellule iMG siano potenti cellule surrogate per valutare non solo i tratti ma anche gli stati della microglia umana. Nell'articolo iniziale sulla tecnica iMG nel 2014, abbiamo confermato che le cellule iMG mostrano un fenotipo di microglia umana, che può essere distinto dai monociti e dai macrofagi. Ad esempio, le cellule iMG hanno mostrato un rapporto di sovraespressione del recettore delle chemochine CX3C 1 (CX3CR1) e del recettore delle chemochine C-C di tipo 2 (CCR2) rispetto ai monociti e ai tipici marcatori della microglia, tra cui la proteina transmembrana 119 (TMEM 119) e il recettore purinergico P2RY12 ^5,17. Recentemente, abbiamo convalidato che le cellule iMG derivate dal sangue periferico assomigliano alla microglia cerebrale nel loro profilo di espressione genica di marcatori microgliali ben noti nello stesso paziente che ha subito interventi chirurgici al cervello¹⁸. Le cellule iMG possono essere analizzate per funzioni dinamiche a livello molecolare, come la fagocitosi e la produzione di citochine, e si prevede che compensino gli svantaggi della ricerca cerebrale post-mortem e degli studi PET.

Abbiamo scoperto meccanismi fisiopatologici dinamici precedentemente sconosciuti che coinvolgono la microglia in pazienti con diagnosi di malattia di Nasu-Hakola⁵, fibromialgia¹⁹, disturbo bipolare^20,21 o malattia di Moyamoya²². Inoltre, sulla base della nostra metodologia originale, vari laboratori hanno impiegato le cellule iMG (alcuni laboratori hanno designato nomi alternativi a queste cellule) come strumento cruciale di ricerca traslazionale inversa 23,24,25,26,27. Sellgren et al. hanno generato con successo cellule iMG in conformità con le nostre raccomandazioni e hanno condotto un'analisi di microarray, che ha rivelato che queste cellule assomigliano molto alla microglia cerebrale umana²³. Recentemente, abbiamo confermato la somiglianza tra le cellule iMG umane e la microglia primaria cerebrale utilizzando il sequenziamento dell'RNA¹⁸.

Questo studio mirava a documentare la metodologia per generare cellule iMG dal sangue periferico umano per facilitare la ricerca traslazionale inversa incentrata sulle malattie neuropsichiatriche. Questa tecnica presenta il potenziale come uno strumento analitico ragionevole in grado di produrre senza sforzo modelli cellulari microgliali in un breve periodo, anche in laboratori mal attrezzati che mancano di apparecchiature di trasferimento genico o personale competente.

Protocollo

Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Kyushu e ha rispettato tutte le disposizioni della Dichiarazione di Helsinki. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti, compresi i volontari sani e i pazienti, per analizzare il loro sangue e pubblicare i loro dati. I materiali e le attrezzature sono elencati nella Tabella dei materiali e le composizioni delle soluzioni sono dettagliate nella Tabella 1.

1. Preparazione di terreni e tamponi per esperimenti

1. Preparare il mezzo di isolamento integrando RPMI-1640 con il 10% di siero fetale bovino inattivato termicamente (56 °C, 30 min) e l'1% di penicillina-streptomicina.
2. Preparare il tampone di isolamento integrando la soluzione tampone basica con una soluzione madre di albumina sierica bovina (BSA) allo 0,5% e sterilizzarla mediante filtrazione (0,22 μm).

2. Isolamento di cellule mononucleate da sangue intero

1. Trasferire 15 mL del terreno a gradiente di densità in una provetta da centrifugazione a gradiente di densità da 50 mL e centrifugare a 1.000 × g per 1 minuto a 20 °C.
   NOTA: Isolare 15 mL di sangue per provetta da centrifugazione a gradiente di densità da 50 mL. Aumentare il numero di provette quando il volume del sangue è elevato.
2. Omogeneizzare il sangue raccolto nelle provette per eparina mediante inversione e rimuovere il coperchio dalla provetta per la raccolta del sangue con una pinzetta sterilizzata a fuoco.
3. Erogare un volume uguale (10-15 mL) di sangue al mezzo del gradiente di densità nella provetta per centrifugazione a gradiente di densità.
4. Impostare il livello di decelerazione della centrifuga su 1 dei 4 livelli e centrifugare a 1.000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: A questa velocità di decelerazione, una velocità di rotazione di 180 × g (1.000 giri/min) si arresta in 3 minuti.
5. Preparare un numero di provette da centrifuga da 50 mL uguale a quello delle provette da centrifugazione a gradiente di densità da 50 mL e riempire ciascuna provetta con 10 mL di PBS (-).
6. Rimuovere lo strato superiore di plasma fino a circa 1 cm sopra il buffy coat dopo la centrifugazione.
   NOTA: Inserire una pipetta di aspirazione verticalmente nella provetta e aspirare con cautela dal centro della superficie del liquido. Non aspirare eccessivamente per evitare di disturbare il buffy coat.
7. Decantare tutto il surnatante rimanente dalla provetta per centrifugazione in gradiente di densità da 50 mL in una provetta da centrifuga contenente 10 mL di PBS (-).
8. Ripristinare il livello di decelerazione della centrifuga su 3 livelli su 4 e centrifugare a 250 × g per 10 minuti a RT. Durante questa fase, preparare una provetta da centrifuga da 50 ml e due da 15 ml e un filtro cellulare da 100 μm.
9. Dopo la centrifugazione, stabilire la temperatura della centrifuga a 4 °C. Cerca un pellet bianco con una periferia rossa sul fondo del tubo da centrifuga. Rimuovere il surnatante per aspirazione e allentare delicatamente il pellet picchiettando.
10. Posizionare un filtro cellulare da 100 μm sulla provetta conica da 50 ml utilizzando una pinzetta sterilizzata a fuoco.
11. Incorporare 13 mL di terreno isolante in una delle provette centrifugate e lavare la parete interna per raccogliere correttamente le cellule. Prelevare la sospensione cellulare e lavare le restanti provette da centrifuga in modo consecutivo. Dopo aver raccolto le cellule da tutte le provette, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare nella provetta conica da 50 mL.
    NOTA: Il mezzo di isolamento deve essere raffreddato durante tutto il processo di isolamento (passaggi 2.11-2.16).
12. Lavare nuovamente ogni provetta con 13 mL di terreno isolante come descritto al punto 2.11. Raccogliere un totale di 26 mL di sospensione cellulare.
13. Erogare quantità uguali in due provette coniche da 15 mL, enumerare le cellule e calcolare la concentrazione appropriata di tampone di isolamento (60 μl di tampone per 10⁷ cellule totali) per il passaggio 2.16.
    NOTA: È meglio lavorare con la provetta conica da 15 mL perché il volume del liquido è piccolo e il liquido bolle facilmente durante il pipettaggio al punto 2.16.
14. Centrifugare a 250 × g per 10 min a 4 °C.
15. Durante la centrifugazione, disinfettare accuratamente il supporto magnetico (soprattutto la parte a contatto con la colonna) con etanolo al 70% e posizionarlo sul banco ad asciugare all'aria. Mantenere il buffer di isolamento sul ghiaccio.
16. Rimuovere il surnatante per aspirazione (in questa fase, cercare pellet rossi di ~1 mm di spessore a causa della presenza di globuli rossi), aggiungere la quantità appropriata di tampone di isolamento e allentare delicatamente il pellet pipettando ~20x.

3. Isolamento dei monociti mediante microsfere CD11b

1. Vortex umano Reagente bloccante FcR per 10 s prima dell'applicazione. Incorporare la quantità necessaria di reagente (20 μl di reagente bloccante FcR per 10-7 cellule totali) e incubare in una camera a 4 °C per 5 minuti.
2. Agitare le microsfere CD11b per 10 s prima dell'applicazione. Incorporare la quantità necessaria di reagente (20 μl di microsfere CD11b per 10⁷ cellule totali) e incubare in una camera a 4 °C per 20 minuti, agitando a mano ogni 5 minuti.
3. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 mL di tampone di isolamento, sospendere con pipettaggio delicato e centrifugare a 300 × g per 10 minuti a 4 °C.
4. Durante la centrifugazione, posizionare la colonna magnetica sul supporto magnetico e sciacquarla con 3 mL di tampone isolante.
   NOTA: Astenersi dal toccare la parte magnetica della colonna e posizionare correttamente la colonna. Se le bolle entrano nella colonna, rimuoverle con una pipetta. Il tampone di isolamento deve essere raffreddato durante tutto il processo di isolamento (passaggi 3.4-3.9).
5. Rimuovere il surnatante post-centrifugazione mediante aspirazione, incorporare 1 mL di tampone isolante, miscelare pipettando delicatamente e applicare la sospensione sulla colonna.
6. Lavare la colonna 3 volte aggiungendo 3 mL di tampone di isolamento ogni volta che il serbatoio della colonna è vuoto.
7. Posizionare la colonna in una provetta conica da 15 mL senza toccare la parte magnetica; incorporare 5 mL di tampone di isolamento nella colonna e forzare il liquido fuori attraverso la colonna con uno stantuffo inserito nella provetta.
8. Centrifugare la sospensione cellulare raccolta nella provetta a 300 × g per 10 minuti a 4 °C.
9. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in terreno di isolamento. Poiché verrà recuperato ~5-10% del numero di cellule contate nel passaggio 2.13, regolare il volume della sospensione in base al numero di cellule.
   NOTA: Il mezzo di isolamento deve essere utilizzato a RT e non riscaldato per evitare un rapido cambiamento di temperatura da 4 °C.
10. Enumerare le cellule e aliquotare 500 μl di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di piastre da 24 pozzetti a una concentrazione di 40 × 10⁴ cellule/mL e incubare durante la notte.
    NOTA: Le sospensioni cellulari devono essere pipettate in modo appropriato in base al volume di semina regolato richiesto per le diverse piastre. Ad esempio, 1 mL per un pozzetto in una piastra a 12 pozzetti e 250 μL per un pozzetto in un vetrino a camera a 8 pozzetti.
11. Infine, smaltire o disinfettare le apparecchiature contaminate in conformità con la politica per la gestione dei rifiuti infettivi stabilita dallo stabilimento.

4. Induzione di cellule iMG da monociti

1. Preparare il terreno di induzione integrando il terreno di induzione basale con una soluzione antibiotico-antimicotica all'1%, 10 ng/mL di GM-CSF umano ricombinante e 100 ng/mL di IL-34 umano ricombinante.
2. Sostituire il terreno isolante della semina del giorno precedente con un mezzo di induzione. Inclinare la piastra in avanti e aspirare prontamente il terreno esaurito dal bordo anteriore del fondo del pozzetto con una pipetta Pasteur. Sostituire il fluido al ritmo di un massimo di 1 piastra (= 24 pozzetti) alla volta e incorporare immediatamente delicatamente 500 μl di terreno di induzione.
   NOTA: In questo passaggio è necessario selezionare i monociti aderiti.
3. Incubare le cellule per 14 giorni per completare l'induzione.
4. Sostituire nuovamente il terreno con 500 μl di terreno di induzione dopo 14 giorni. Successivamente, per il mantenimento post-induzione delle cellule, sostituire il terreno di induzione con 500 μL di terreno di induzione fresco ogni settimana.

5. Immunocitochimica

1. Estrarre il terreno dal vetrino della camera a 8 pozzetti seminato con le cellule al passaggio 3.10 mediante aspirazione e risciacquare con PBS (-).
2. Fissare le cellule per 20 minuti a RT con il 4% di paraformaldeide.
3. Rimuovere il reagente fissativo e sciacquare le cellule per 3 x 5 minuti con PBS (-).
4. Permeabilizzare le cellule con PBS (-) contenente lo 0,1% di Triton X-100 a RT.
5. Incubare le cellule permeabilizzate con una soluzione bloccante (3% BSA/PBS (-)) per 1 ora a RT.
6. Incubare le cellule per una notte con anticorpi primari (Tabella dei materiali) a 4 °C.
   NOTA: Tutti gli anticorpi sono diluiti in soluzione bloccante.
7. Sciacquare le celle per 3 x 5 minuti con PBS (−) per 5 minuti ciascuna.
8. Incubare le cellule risciacquate con gli anticorpi secondari marcati in fluorescenza appropriati per 1 ora a RT (Table of Materials).
9. Sciacquare le cellule per 3 x 5 minuti con PBS (-) per rimuovere gli anticorpi secondari.
10. Incubare le cellule con la soluzione DAPI (1:10.000) diluita con PBS (-) per 5 minuti a RT.
11. Sciacquare le celle per 3 x 5 minuti con PBS (-).
12. Montare il pozzetto utilizzando il mezzo di montaggio e visualizzare le cellule al microscopio a fluorescenza.

Risultati

È importante sottolineare che esiste una grande eterogeneità a livello di persona e di temporizzazione nei caratteri delle cellule iMG, comprese le morfologie e le espressioni geniche. Le cellule iMG in alcuni individui assumono un aspetto ramificato numeroso (Figura 1A), mentre in altri rimangono sferiche (Figura 1B). Le caratteristiche dell'iMG possono differire anche all'interno di un singolo individuo, rendendo le cellule iMG uno strumento fondamentale per...

Discussione

Le tecniche analitiche che impiegano cellule iMG possono fungere da potenti strumenti di ricerca traslazionale inversa ^5,6. Per generare quantità sufficienti di cellule iMG umane, gli sperimentatori dovrebbero progettare i loro studi prendendo in considerazione alcuni aspetti. I campioni di sangue derivati da esseri umani sono estremamente sensibili; Di conseguenza, i campioni ottenuti garantiscono una pronta elaborazione e una manipolazione meticolosa per evita...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% paraformaldehyde	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI solution	DOJINDO	28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Nacalai Tesque	14249-24	described as "PBS (−)"
Fetal Bovine Serum	biowest	S1760-500
Human FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	described as "magnetic column"
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	described as "magnetic stand"
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144	described as "mounting media"
recombinant human GM-CSF	R&D Systems	215-GM
recombinant human IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	secondary antibody, rabbit, 1:1000