用于逆向转化脑研究的人血诱导的小胶质细胞样细胞工程

摘要

本研究描述了一种建立人单核细胞衍生的小胶质细胞样 （iMG） 细胞的新方法，该方法能够间接评估脑炎症。这提出了一种细胞模型，可能有利于专注于大脑潜在炎症和相关神经精神疾病的研究。

摘要

最近采用动物模型的研究强调了小胶质细胞作为各种神经精神和物理疾病中关键免疫调节剂的重要性。死后脑分析和正电子发射断层扫描成像是评估人类患者小胶质细胞活化的代表性研究方法;研究结果揭示了患有各种神经精神疾病和慢性疼痛的患者大脑中小胶质细胞的激活。尽管如此，上述技术仅有助于评估小胶质细胞激活的有限方面。

代替脑活检和诱导多能干细胞技术，我们最初设计了一种技术，通过补充粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素 34 来从新鲜衍生的人外周血单核细胞中直接产生诱导的小胶质细胞样 （iMG） 细胞 2 周。这些 iMG 细胞可用于对细胞水平应激刺激后的吞噬能力和细胞因子释放进行动态形态学和分子水平分析。最近，全面的转录组分析已被用于验证人类 iMG 细胞和大脑原代小胶质细胞之间的相似性。

患者来源的 iMG 细胞可作为预测人脑中小胶质细胞活化的关键替代标志物，并有助于揭示 Nasu-Hakola 病、纤维肌痛、双相情感障碍和烟雾病患者以前未知的小胶质细胞动态病理生理学。因此，基于 iMG 的技术是一种有价值的逆向翻译工具，并为阐明各种精神和身体疾病中小胶质细胞的分子病理生理学提供了新的见解。

引言

近年来，脑炎症被认为在各种脑和神经精神疾病的病理生理学中起着关键作用;通过人类死后脑分析和基于正电子发射断层扫描 （PET） 的生物成像技术，小胶质细胞被强调为关键的免疫调节细胞 1,2,3,4。死后脑部和 PET 成像分析揭示了重要的发现;然而，这些方法在完整捕获大脑中人类小胶质细胞的动态分子活动方面效率低下。因此，需要新的策略来能够在分子和细胞水平上全面评估人类小胶质细胞功能和功能障碍。

2014 年，我们最初设计了一种新技术来生产直接诱导的小胶质细胞样 （iMG） 细胞 ^5,6，然后在 2016 年首次发表人诱导多能干细胞 （iPSC） 衍生的小胶质细胞样细胞⁷。在短短 2 周内，我们通过优化细胞因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 （GM-CSF） 和白细胞介素 34 （IL-34） 成功地将人外周血单核细胞转化为 iMG 细胞。当我们开发这项技术时，从 iPS 细胞或成纤维细胞诱导神经元细胞的创新重编程方法才刚刚开始在世界上流行 ^8,9,10,11。然而，当时尚未报道诱导 iPS 衍生的小胶质细胞的方法，需要生成人体细胞衍生的小胶质细胞模型。由于据报道 GM-CSF 和 IL-34（巨噬细胞集落刺激因子）等细胞因子是小胶质细胞发育和维持所必需的 12,13,14,15，我们假设这些细胞因子的组合可以直接应用于从血液单核细胞生成小胶质细胞模型。最后，我们通过结合 GM-CSF 和 IL-34 成功开发了源自单核细胞的小胶质细胞模型⁵。此外，其中一些细胞因子组合也用于诱导 iPS 细胞的小胶质细胞 ^7,16，^并被认为是获得小胶质细胞特征的重要因素。

与 iPSC 方法相比，iMG 细胞不需要任何基因改造，可以通过简单的化学诱导在很短的时间内生成，从而降低时间和财务成本。此外，iMG 细胞不需要基因重编程，因此我们认为 iMG 细胞是有效的替代细胞，不仅可以评估人类小胶质细胞的性状，还可以评估其状态。在 2014 年 iMG 技术的初始论文中，我们证实 iMG 细胞表现出人类小胶质细胞的表型，这可能与单核细胞和巨噬细胞不同。例如，iMG 细胞的 CX3C 趋化因子受体 1 （CX3CR1） 和 C-C 趋化因子受体 2 型 （CCR2） 的过表达比率高于单核细胞和典型的小胶质细胞标志物，包括跨膜蛋白 119 （TMEM 119） 和嘌呤能受体 P2RY12 ^5,17。最近，我们验证了外周血来源的 iMG 细胞在接受脑部手术的同一患者中已知小胶质细胞标志物的基因表达谱上类似于脑小胶质细胞¹⁸。可以在分子水平上分析 iMG 细胞的动态功能，例如吞噬作用和细胞因子的产生，并有望弥补死后脑研究和 PET 研究的缺点。

我们已经发现了以前未知的涉及小胶质细胞的动态病理生理机制，这些机制被诊断为 Nasu-Hakola 病⁵、纤维肌痛¹⁹、双相情感障碍^20,21 或烟雾病²²。此外，根据我们最初的方法，各种实验室都采用了 iMG 细胞（某些实验室已经指定了这些细胞的替代名称）作为重要的逆向翻译研究工具 23,24,25,26,27。Sellgren 等人根据我们的建议成功生成了 iMG 细胞，并进行了微阵列分析，结果显示这些细胞与人脑小胶质细胞²³ 非常相似。最近，我们使用 RNA 测序¹⁸ 证实了人类 iMG 细胞和大脑原代小胶质细胞之间的相似性。

本研究旨在记录从人外周血中产生 iMG 细胞的方法，以促进以神经精神疾病为重点的逆向转化研究。这项技术具有作为一种合理的分析工具的潜力，可以在短时间内毫不费力地产生小胶质细胞模型，即使在缺乏基因转移设备或熟练人员的设备不足的实验室中也是如此。

研究方案

该研究方案得到了九州大学伦理委员会的批准，并遵守了赫尔辛基宣言的所有规定。获得所有参与者（包括健康志愿者和患者）的书面知情同意书，以分析他们的血液并发布他们的数据。材料和设备在 材料表中列出，解决方案的组成在 表 1 中详细说明。

1. 制备实验用培养基和缓冲液

1. 通过用 10% 热灭活的胎牛血清（56°C，30 分钟）和 1% 青霉素 - 链霉素补充 RPMI-1640 来制备分离培养基。
2. 通过在碱性缓冲溶液中补充 0.5% 牛血清白蛋白 （BSA） 储备溶液来制备分离缓冲液，并通过过滤 （0.22 μm） 对其进行消毒。

2. 从全血中分离单核细胞

1. 将 15 mL 密度梯度培养基转移至 50 mL 密度梯度离心管中，并在 20 °C 下以 1,000 × g 离心 1 分钟。
   注:每 50 mL 密度梯度离心管分离 15 mL 血液。当血容量高时增加管子数量。
2. 通过倒置将收集在肝素管中的血液匀浆，并用火灭菌镊子从采血管中取出盖子。
3. 将等体积 （10-15 mL） 的血液分配到密度梯度离心管中的密度梯度介质中。
4. 将离心机的减速水平设置为 4 个水平中的 1 个，并在室温 （RT） 下以 1,000 × g 离心 10 分钟。
   注意:在此减速速率下，180 × g （1,000 rpm） 的转速在 3 分钟内停止。
5. 准备与 50 mL 密度梯度离心管相同数量的 50 mL 离心管，并在每个管中填充 10 mL PBS （-）。
6. 离心后，去除血沉棕黄层上方约 1 cm 的血浆顶层。
   注意:将吸液管垂直插入试管中，然后从液体表面中心小心吸出。不要过度吸液，以免打扰血沉棕黄层。
7. 将 50 mL 密度梯度离心管中所有剩余的上清液倒出到含有 10 mL PBS （−） 的离心管中。
8. 将离心机的减速水平重置为 4 个水平中的 3 个，并在 RT 下以 250 × g 离心 10 分钟。在此步骤中，准备一个 50 mL 和两个 15 mL 离心管和一个 100 μm 细胞过滤器。
9. 离心后，将离心机的温度确定为 4 °C。 搜索离心管底部带有红色外围的白色沉淀。通过抽吸去除上清液，并通过敲击轻轻松开沉淀。
10. 使用经过火灭菌的镊子将 100 μm 细胞过滤器放在 50 mL 锥形管上。
11. 将 13 mL 分离培养基加入其中一个离心管中，并清洗内壁以正确收集细胞。取细胞悬液并连续洗涤剩余的离心管。从所有试管中收集细胞后，通过细胞过滤器将细胞悬液过滤到 50 mL 锥形管中。
    注意:在整个分离过程中，隔离介质需要冷却（步骤 2.11-2.16）。
12. 如步骤 2.11 中所述，用 13 mL 分离培养基再次清洗每支试管。收集总共 26 mL 的细胞悬液。
13. 将等量分配到两个 15 mL 锥形管中，计数细胞，并计算步骤 2.16 的分离缓冲液的适当浓度（每 10⁷ 个总细胞 60 μL 缓冲液）。
    注:15 mL 锥形管更好用，因为液体体积小，并且在步骤 2.16 中移液时液体容易起泡。
14. 在 4 °C 下以 250 × g 离心 10 分钟。
15. 在离心过程中，用 70% 乙醇对磁力架（尤其是与色谱柱接触的部分）进行彻底消毒，并将其放在工作台上风干。将隔离缓冲液保存在冰上。
16. 通过抽吸去除上清液（在此阶段，由于存在红细胞，寻找 ~1 mm 厚的红色颗粒），加入适量的分离缓冲液，并通过移液 ~20 次轻轻松开沉淀。

3. 使用 CD11b 微珠分离单核细胞

1. 应用前 10 秒涡旋人 FcR 封闭试剂。掺入所需量的试剂（每 10⁷ 个总细胞 20 μL FcR 封闭试剂），并在 4 °C 的腔室中孵育 5 分钟。
2. 应用前将 CD11b 微珠涡旋 10 秒。掺入所需量的试剂（每 10⁷ 个总细胞 20 μL CD11b 微珠），并在 4 °C 腔室中孵育 20 分钟，同时每 5 分钟用手搅拌一次。
3. 孵育后，加入 10 mL 分离缓冲液，轻轻移液悬浮，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。
4. 离心过程中，将磁柱放在磁力架上，并用 3 mL 分离缓冲液冲洗。
   注意:请勿触摸色谱柱的磁性部分，并正确放置色谱柱。如果气泡进入色谱柱，请用移液器将其去除。在整个隔离过程中，隔离缓冲液必须冷藏（步骤 3.4-3.9）。
5. 通过抽吸去除离心后上清液，加入 1 mL 分离缓冲液，轻轻移液混合，然后将悬浮液涂在色谱柱上。
6. 每次柱储液槽为空时，加入 3 mL 分离缓冲液，洗涤柱 3 次。
7. 将色谱柱放入 15 mL 锥形管中，不要接触磁性部件;将 5 mL 分离缓冲液加入色谱柱中，将柱塞插入管中，将液体从色谱柱中挤出。
8. 将收集在管中的细胞悬液在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。
9. 吸出上清液并将细胞重悬于分离培养基中。由于将回收步骤 2.13 中计数的细胞数的 ~5-10%，因此请根据细胞数调整悬浮液体积。
   注:隔离介质应在室温下使用，不要加热，以避免从 4 °C 开始快速变化温度。
10. 计数细胞，将 500 μL 细胞悬液分装到 24 孔板的每个孔中，浓度为 40 ×^{10 4} 个细胞/mL，并孵育过夜。
    注意:应根据不同板所需的调整接种体积适当移液细胞悬液。例如，12 孔板中的一个孔为 1 mL，8 孔腔室载玻片中的一个孔为 250 μL。
11. 最后，根据设施制定的处理传染性废物的政策处理或消毒受污染的设备。

4. 从单核细胞诱导 iMG 细胞

1. 通过在基础诱导培养基中补充 1% 抗生素-抗真菌溶液、10 ng/mL 重组人 GM-CSF 和 100 ng/mL 重组人 IL-34 来制备诱导培养基。
2. 用诱导培养基替换前一天接种的分离培养基。将板向前倾斜，并立即用巴斯德移液管从孔底的前边缘吸出耗尽的培养基。以一次最多 1 个板（= 24 个孔）的速率更换培养基，并立即轻轻加入 500 μL 诱导培养基。
   注意:在此步骤中应选择粘附的单核细胞。
3. 将细胞孵育 14 天以完成诱导。
4. 14 天后，再次用 500 μL 诱导培养基更换培养基。随后，为了细胞的诱导后维持，每周用 500 μL 新鲜诱导培养基更换诱导培养基。

5. 免疫细胞化学

1. 通过抽吸从步骤 3.10 中接种有细胞的 8 孔室载玻片中取出培养基，并用 PBS （-） 冲洗。
2. 在 RT 和 4% 多聚甲醛中将细胞固定 20 分钟。
3. 取出固定剂，用 PBS （-） 冲洗细胞 3 x 5 分钟。
4. 在 RT 下用含有 0.1% Triton X-100 的 PBS （-） 透化细胞。
5. 将透化细胞与封闭溶液 （3% BSA/PBS （-）） 在 RT 下孵育 1 小时。
6. 将细胞与一抗（材料表）在 4 °C 下孵育过夜。
   注:所有抗体均在封闭溶液中稀释。
7. 用 PBS （-） 冲洗细胞 3 x 5 分钟，每次 5 分钟。
8. 将冲洗过的细胞与适当的荧光标记的二抗在 RT 下孵育 1 小时（材料表）。
9. 用 PBS （-） 冲洗细胞 3 x 5 分钟以去除二抗。
10. 将细胞与用 PBS （-） 稀释的 DAPI （1:10,000） 溶液在 RT 下孵育 5 分钟。
11. 用 PBS （-） 冲洗细胞 3 x 5 分钟。
12. 使用封固剂封固孔，并在荧光显微镜下观察细胞。

结果

重要的是，iMG 细胞的特征（包括形态和基因表达）存在大量的人级和时间级异质性。某些个体的 iMG 细胞呈现出许多分支外观（图 1A），而在其他个体中，它们保持球形（图 1B）。iMG 特征甚至在单个个体内也可能不同，这使得 iMG 细胞成为检测疾病状态生物标志物的关键工具。相反，对这种个体间差异的检查保证了技术错误的减少。iMG 细胞定义为用 GM...

讨论

采用 iMG 细胞的分析技术可作为有效的逆向转化研究工具 ^5,6。为了产生足够数量的人类 iMG 细胞，实验者在设计研究时应考虑某些问题。来自人类的血液样本非常敏感;因此，获得的样品需要及时处理和细致处理，以避免污染。具体来说，抽取血样后应立即分离，不要长时间无人看管。实验通常在采血后 3 小时内开始以确认其有效性;但是，可以将血液样?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% paraformaldehyde	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI solution	DOJINDO	28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Nacalai Tesque	14249-24	described as "PBS (−)"
Fetal Bovine Serum	biowest	S1760-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	described as "density gradient medium"
Human FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	described as "magnetic column"
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	described as "magnetic stand"
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144	described as "mounting media"
recombinant human GM-CSF	R&D Systems	215-GM
recombinant human IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	secondary antibody, rabbit, 1:1000