ヒト血液誘導性ミクログリア様細胞の改変による脳の逆翻訳研究

要約

この研究は、脳の炎症の間接的な評価を可能にするヒト単球由来ミクログリア様(iMG)細胞の確立のための新しいアプローチを示しています。これは、脳の潜在的な炎症と関連する神経精神障害に焦点を当てた研究に有益である可能性のある細胞モデルを示しています。

要約

動物モデルを用いた最近の研究では、ミクログリアがさまざまな神経精神疾患や身体疾患における重要な免疫調節因子として重要であることが浮き彫りになっています。死後脳分析と陽電子放出断層撮影イメージングは、ヒト患者のミクログリア活性化を評価する代表的な研究方法です。その結果、さまざまな精神神経疾患や慢性疼痛を呈する患者の脳内でミクログリアが活性化されることが明らかになりました。それにもかかわらず、前述の技術は、ミクログリア活性化の限られた側面の評価を容易にするだけです。

脳生検や人工多能性幹細胞法の代わりに、新たに由来するヒト末梢血単球に顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン34を2週間補給することで、直接誘導ミクログリア様(iMG)細胞を作製する技術を最初に考案しました。これらのiMG細胞は、細胞レベルのストレス刺激後の食作用能力とサイトカイン放出に関する動的な形態学的および分子レベルの解析に用いることができます。近年、ヒトiMG細胞と脳初代ミクログリアとの類似性を検証するために、包括的なトランスクリプトーム解析が行われています。

患者由来のiMG細胞は、ヒトの脳におけるミクログリアの活性化を予測するための主要な代理マーカーとして機能する可能性があり、那須ハコラ病、線維筋痛症、双極性障害、およびもやもや病の患者におけるミクログリアのこれまで知られていなかった動的病態の解明に役立っています。したがって、iMGベースの技術は、貴重な逆翻訳ツールとして機能し、さまざまな心身疾患におけるミクログリアの分子病態生理学を動的に解明するための新しい洞察を提供します。

概要

近年、脳の炎症は、さまざまな脳および神経精神疾患の病態生理学において極めて重要な役割を果たすことが示唆されています。ミクログリアは、ヒトの死後脳解析および陽電子放出断層撮影法(PET)ベースのバイオ^{イメージング技術}1,2,3,4によって、主要な免疫調節細胞として注目されています。死後の脳とPET画像解析により、重要な知見が明らかになりました。しかし、これらのアプローチは、ヒトミクログリアの動的な分子活性を脳内で完全に捉えるという点では非効率的です。したがって、ヒトのミクログリアの機能と機能障害を分子および細胞レベルで包括的に評価できるようにするための新しい戦略が必要です。

2014年には、直接誘導されたミクログリア様(iMG)細胞^5,6を作製する新しい技術を創製しましたが、2016年にヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来のミクログリア様細胞が初めて発表されました^7。わずか2週間で、サイトカイン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイ....

プロトコル

この学習プロトコルは、九州大学の倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言のすべての規定に準拠していました。健康なボランティアや患者を含むすべての参加者から書面によるインフォームドコンセントが得られ、血液を分析し、データを公開しました。材料および機器は 材料表に記載されており、溶液の組成は 表1に詳述されています。

1. 実験用培地・バッファーの調製

1. RPMI-1640に10%熱不活化ウシ胎児血清(56°C、30分)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加して、単離培地を調製します。
2. 塩基性緩衝液に0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)原液を添加して単離緩衝液を調製し、ろ過(0.22 μm)で滅菌します。

2. 全血からの単核細胞の単離

1. 15 mLの密度勾配培地を50 mLの密度勾配遠心チューブに移し、1,000 × g で20°Cで1分間遠心分離します。
   注:50 mL密度勾配遠心分離チューブあたり15 mLの血液を分離します。血液量が多い場合はチューブの数を増やします。
2. ヘパリンチューブに採取した血液を反転して均質化し、採血チューブから火除菌ピンセットで蓋を外します....

ディスカッション

iMG細胞を用いた分析技術は、強力な逆翻訳研究ツールとして役立つ可能性があります^5,6。十分な量のヒトiMG細胞を作製するためには、実験者は特定の問題を考慮して研究を設計する必要があります。人間に由来する血液サンプルは非常に敏感です。その結果、得られたサンプルは、迅速な処理と、汚染を避けるための細心の注意を払った取り扱い?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% paraformaldehyde	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI solution	DOJINDO	28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Nacalai Tesque	14249-24	described as "PBS (−)"
Fetal Bovine Serum	biowest	S1760-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	described as "density gradient medium"
Human FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	described as "magnetic column"
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	described as "magnetic stand"
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144	described as "mounting media"
recombinant human GM-CSF	R&D Systems	215-GM
recombinant human IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	secondary antibody, rabbit, 1:1000