Engenharia de células semelhantes à microglia induzidas por sangue humano para pesquisa cerebral de tradução reversa

Resumo

Este estudo delineia uma nova abordagem para o estabelecimento de células semelhantes à micróglia derivadas de monócitos humanos (iMG) que permitem a avaliação indireta da inflamação cerebral. Isso apresenta um modelo celular que pode ser benéfico para pesquisas com foco na inflamação potencial do cérebro e distúrbios neuropsiquiátricos associados.

Resumo

Investigações recentes empregando modelos animais destacaram a importância da microglia como moduladores imunológicos cruciais em várias doenças neuropsiquiátricas e físicas. A análise cerebral post-mortem e a tomografia por emissão de pósitrons são métodos de pesquisa representativos que avaliam a ativação microglial em pacientes humanos; Os resultados revelaram a ativação da microglia no cérebro de pacientes que apresentam vários distúrbios neuropsiquiátricos e dor crônica. No entanto, a técnica acima mencionada apenas facilita a avaliação de aspectos limitados da ativação microglial.

Em vez da biópsia cerebral e da técnica de células-tronco pluripotentes induzidas, inicialmente desenvolvemos uma técnica para gerar células semelhantes à microglia diretamente induzidas (iMG) a partir de monócitos do sangue periférico humano recém-derivados, suplementando-os com fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos e interleucina 34 por 2 semanas. Essas células iMG podem ser empregadas para realizar análises dinâmicas morfológicas e moleculares em relação à capacidade fagocítica e liberações de citocinas após estimulação de estresse em nível celular. Recentemente, a análise abrangente do transcriptoma foi usada para verificar a semelhança entre as células iMG humanas e a micróglia primária do cérebro.

As células iMG derivadas do paciente podem servir como marcadores substitutos importantes para prever a ativação microglial em cérebros humanos e ajudaram na revelação da fisiopatologia dinâmica anteriormente desconhecida da microglia em pacientes com doença de Nasu-Hakola, fibromialgia, transtorno bipolar e doença de Moyamoya. Portanto, a técnica baseada em iMG serve como uma valiosa ferramenta de tradução reversa e fornece novos insights para elucidar a fisiopatologia molecular da microglia em uma variedade de doenças mentais e físicas.

Introdução

Nos últimos anos, foi sugerido que a inflamação cerebral assume papéis fundamentais na fisiopatologia de vários distúrbios cerebrais e neuropsiquiátricos; as microglias foram destacadas como células-chave imunomoduladoras por análise cerebral post-mortem humana e técnicas de bioimagem baseadas em tomografia por emissão de pósitrons (PET) 1,2,3,4. As análises cerebrais post-mortem e de imagem PET revelam achados significativos; No entanto, no entanto, essas abordagens são ineficientes em termos de capturar as atividades moleculares dinâmicas da microglia humana no cérebro em sua totalidade. Portanto, novas estratégias são necessárias para permitir a avaliação abrangente das funções e disfunções microgliais humanas nos níveis molecular e celular.

Em 2014, originalmente projetamos uma nova técnica para produzir células semelhantes à microglia diretamente induzidas (iMG) ^5,6, antes da primeira publicação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) derivadas de células semelhantes à microglia em 2016⁷. Em apenas 2 semanas, convertemos com sucesso monócitos do sangue periférico humano em células iMG, otimizando as citocinas, o fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) e a interleucina 34 (IL-34). Quando desenvolvemos essa técnica, o método inovador de reprogramação de indução de células neuronais a partir de células iPS ou fibroblastos estava apenas começando a prevalecer no mundo 8,9,10,11. No entanto, naquela época, um método para induzir células microgliais derivadas de iPS ainda não havia sido relatado, e a geração de um modelo microglial derivado de células somáticas humanas era desejada. Uma vez que citocinas como GM-CSF e IL-34, fator estimulador de colônias de macrófagos, foram relatadas como necessárias para o desenvolvimento e manutenção da microglia 12,13,14,15, hipotetizamos que uma combinação dessas citocinas poderia ser aplicada diretamente para gerar um modelo celular microglial a partir de monócitos sanguíneos. Finalmente, conseguimos desenvolver um modelo de microglia derivada de monócitos combinando GM-CSF e IL-34⁵. Além disso, algumas dessas combinações de citocinas também são empregadas para induzir a microglia a partir de células iPS ^7,16 e são consideradas um fator importante na aquisição de características microgliais.

Ao contrário dos métodos iPSC, as células iMG não requerem nenhuma modificação genética e podem ser geradas em um tempo muito curto por simples indução química, resultando em menor tempo e custos financeiros. Além disso, as células iMG não requerem reprogramação genética, por isso acreditamos que as células iMG são células substitutas potentes para avaliar não apenas as características, mas também os estados da microglia humana. No artigo inicial sobre a técnica iMG em 2014, confirmamos que as células iMG exibem um fenótipo de micróglia humana, que pode ser distinto de monócitos e macrófagos. Por exemplo, as células iMG exibiram uma taxa de superexpressão do receptor de quimiocina CX3C 1 (CX3CR1) e do receptor de quimiocina CC tipo 2 (CCR2) do que monócitos e marcadores típicos da microglia, incluindo proteína transmembrana 119 (TMEM 119) e receptor purinérgico P2RY12 ^5,17. Recentemente, validamos que as células iMG derivadas do sangue periférico se assemelham à micróglia cerebral em seu perfil de expressão gênica de marcadores microgliais bem conhecidos no mesmo paciente submetido a cirurgias cerebrais¹⁸. As células iMG podem ser analisadas quanto a funções dinâmicas em nível molecular, como fagocitose e produção de citocinas, e espera-se que compensem as desvantagens da pesquisa cerebral post-mortem e estudos de PET.

Descobrimos mecanismos fisiopatológicos dinâmicos anteriormente desconhecidos envolvendo a micróglia em pacientes diagnosticados com doença de Nasu-Hakola⁵, fibromialgia¹⁹, transtorno bipolar^20,21 ou doença de Moyamoya²². Além disso, com base em nossa metodologia original, vários laboratórios empregaram as células iMG (alguns laboratórios designaram nomes alternativos para essas células) como uma ferramenta crucial de pesquisa de tradução reversa^{23 , 24 , 25 , 26 , 27} . Sellgren et al. geraram com sucesso células iMG em conformidade com nossas recomendações e conduziram uma análise de microarray, que revelou que essas células se assemelham muito à microglia do cérebro humano²³. Recentemente, confirmamos a semelhança entre as células iMG humanas e a micróglia primária do cérebro usando sequenciamento de RNA¹⁸.

Este estudo teve como objetivo documentar a metodologia para gerar células iMG a partir do sangue periférico humano para facilitar a pesquisa de tradução reversa focada em doenças neuropsiquiátricas. Esta técnica apresenta potencial como uma ferramenta analítica razoável que pode produzir sem esforço modelos celulares microgliais em um curto período, mesmo em laboratórios mal equipados que não possuem aparelhos de transferência de genes ou pessoal proficiente.

Protocolo

O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Kyushu e cumpriu todas as disposições da Declaração de Helsinque. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes, incluindo voluntários saudáveis e pacientes, para analisar seu sangue e publicar seus dados. Os materiais e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais e as composições das soluções são detalhadas na Tabela 1.

1. Preparação de meios e tampões para experimentos

1. Prepare o meio de isolamento suplementando RPMI-1640 com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (56 °C, 30 min) e 1% de penicilina-estreptomicina.
2. Preparar o tampão de isolamento suplementando a solução tampão de base com solução-mãe de albumina de soro bovino (BSA) a 0,5% e esterilizá-la por filtração (0,22 μm).

2. Isolamento de células mononucleares do sangue total

1. Transfira 15 mL do meio de gradiente de densidade para um tubo de centrifugação de gradiente de densidade de 50 mL e centrifugue a 1.000 × g por 1 min a 20 °C.
   NOTA: Isole 15 mL de sangue por tubo de centrifugação com gradiente de densidade de 50 mL. Aumente o número de tubos quando o volume de sangue estiver alto.
2. Homogeneizar o sangue coletado em tubos de heparina por inversão e remover a tampa do tubo de coleta de sangue com pinças esterilizadas por fogo.
3. Dispense um volume igual (10-15 mL) de sangue para o meio de gradiente de densidade no tubo de centrifugação de gradiente de densidade.
4. Defina o nível de desaceleração da centrífuga para 1 de 4 níveis e centrifugue a 1.000 × g por 10 min à temperatura ambiente (RT).
   NOTA: Nesta taxa de desaceleração, uma velocidade de rotação de 180 × g (1.000 rpm) pára em 3 min.
5. Prepare um número igual de tubos de centrífuga de 50 mL como os tubos de centrifugação de gradiente de densidade de 50 mL e encha cada tubo com 10 mL de PBS (−).
6. Remover a camada superior de plasma até cerca de 1 cm acima do revestimento leucocitário após centrifugação.
   NOTA: Insira uma pipeta de aspiração verticalmente no tubo e aspire cuidadosamente a partir do centro da superfície do líquido. Não aspire demais para evitar perturbar a pelagem amarelada.
7. Transvasar todo o sobrenadante restante do tubo de centrifugação com gradiente de densidade de 50 ml para um tubo de centrifugação contendo 10 ml de PBS (−).
8. Redefina o nível de desaceleração da centrífuga para 3 de 4 níveis e centrifugue a 250 × g por 10 min em RT. Durante esta etapa, prepare um tubo de centrífuga de 50 mL e dois de 15 mL e um filtro de células de 100 μm.
9. Após centrifugação, estabelecer a temperatura da centrífuga a 4 °C. Procure um pellet branco com uma periferia vermelha na parte inferior do tubo da centrífuga. Remover o sobrenadante por aspiração e soltar o sedimento suavemente batendo.
10. Posicione um filtro de células de 100 μm no tubo cônico de 50 mL usando uma pinça esterilizada por fogo.
11. Incorporar 13 ml de meio isolante num dos tubos centrifugados e lavar a parede interior para recolher as células de forma adequada. Pegue a suspensão celular e lave os tubos centrifugados restantes de maneira consecutiva. Depois de coletar as células de todos os tubos, filtre a suspensão celular através de um filtro de células no tubo cônico de 50 mL.
    NOTA: O meio de isolamento precisa ser resfriado durante todo o processo de isolamento (etapas 2.11-2.16).
12. Lave cada tubo novamente com 13 mL de meio de isolamento, conforme descrito na etapa 2.11. Colete um total de 26 mL de suspensão celular.
13. Dispense quantidades iguais em dois tubos cônicos de 15 mL, enumere as células e calcule a concentração apropriada de tampão de isolamento (60 μL de tampão por 10⁷ células totais) para a etapa 2.16.
    NOTA: O tubo cônico de 15 mL é melhor para trabalhar porque o volume de líquido é pequeno e o líquido borbulha facilmente ao pipetar na etapa 2.16.
14. Centrifugar a 250 × g durante 10 min a 4 °C.
15. Durante a centrifugação, desinfete completamente o suporte magnético (especialmente a parte em contato com a coluna) com etanol 70% e coloque-o na bancada para secar ao ar. Mantenha o tampão de isolamento no gelo.
16. Remova o sobrenadante por aspiração (neste estágio, procure pellets vermelhos com ~ 1 mm de espessura devido à presença de glóbulos vermelhos), adicione a quantidade apropriada de tampão de isolamento e solte o pellet suavemente pipetando ~ 20x.

3. Isolamento de monócitos usando microesferas CD11b

1. Reagente de bloqueio de FcR humano em vórtice por 10 s antes da aplicação. Incorpore a quantidade necessária de reagente (20 μL de reagente bloqueador de FcR por 10⁷ células totais) e incube em uma câmara a 4 ° C por 5 min.
2. Vortex as microesferas CD11b por 10 s antes da aplicação. Incorpore a quantidade necessária de reagente (20 μL de microesferas CD11b por 10⁷ células totais) e incube em uma câmara de 4 ° C por 20 min, agitando manualmente a cada 5 min.
3. Após a incubação, adicionar 10 ml de tampão de isolamento, suspender com pipetagem suave e centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
4. Durante a centrifugação, coloque a coluna magnética no suporte magnético e lave-a com 3 mL de tampão de isolamento.
   NOTA: Evite tocar na parte magnética da coluna e posicione a coluna corretamente. Se as bolhas entrarem na coluna, remova-as com uma pipeta. O buffer de isolamento deve ser resfriado durante todo o processo de isolamento (etapas 3.4 a 3.9).
5. Remover o sobrenadante pós-centrifugação por aspiração, incorporar 1 ml de tampão de isolamento, misturar pipetando suavemente e aplicar a suspensão na coluna.
6. Lave a coluna 3x adicionando 3 mL de tampão de isolamento cada vez que o reservatório da coluna estiver vazio.
7. Coloque a coluna em um tubo cônico de 15 mL sem tocar na parte magnética; Incorpore 5 mL de tampão de isolamento na coluna e force o líquido para fora através da coluna com um êmbolo inserido no tubo.
8. Centrifugar a suspensão celular recolhida no tubo a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
9. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de isolamento. Como ~ 5-10% do número de células contadas na etapa 2.13 será recuperado, ajuste o volume da suspensão de acordo com o número de células.
   NOTA: O meio de isolamento deve ser usado em RT e não aquecido para evitar mudanças rápidas de temperatura de 4 °C.
10. Enumerar as células e alíquota de 500 μL de suspensão celular em cada alvéolo de placas de 24 poços a uma concentração de 40 × 10⁴ células/ml e incubar durante a noite.
    NOTA: As suspensões celulares devem ser pipetadas adequadamente de acordo com o volume de semeadura ajustado necessário para diferentes placas. Por exemplo, 1 mL para um poço em uma placa de 12 poços e 250 μL para um poço em uma lâmina de câmara de 8 poços.
11. Por fim, descarte ou desinfete o equipamento contaminado de acordo com a política de manuseio de resíduos infecciosos estabelecida pela instalação.

4. Indução de células iMG a partir de monócitos

1. Prepare o meio de indução suplementando o meio de indução basal com solução antibiótica-antimicótica a 1%, 10 ng/mL de GM-CSF humano recombinante e 100 ng/mL de IL-34 humana recombinante.
2. Substituir o meio de isolamento da sementeira do dia anterior por meio de indução. Incline a placa para a frente e aspire imediatamente o meio empobrecido da borda frontal do fundo do poço com uma pipeta Pasteur. Substitua o meio na proporção de no máximo 1 placa (= 24 poços) de cada vez e incorpore imediatamente 500 μL de meio de indução suavemente.
   NOTA: Monócitos aderidos devem ser selecionados nesta etapa.
3. Incube as células por 14 dias para completar a indução.
4. Substitua o meio novamente por 500 μL de meio de indução após 14 dias. Posteriormente, para manutenção pós-indução das células, substitua o meio de indução por 500 μL de meio de indução fresco todas as semanas.

5. Imunocitoquímica

1. Remover o meio da lâmina de câmara de 8 poços semeada com células no passo 3.10 por aspiração e enxaguar com PBS (−).
2. Fixe as células por 20 min em RT com paraformaldeído a 4%.
3. Remova o reagente fixador e lave as células por 3 x 5 min com PBS (−).
4. Permeabilize as células com PBS (-) contendo 0,1% de Triton X-100 em RT.
5. Incubar as células permeabilizadas com uma solução de bloqueio (3% BSA/PBS (-)) durante 1 h a RT.
6. Incubar as células durante a noite com anticorpos primários (Tabela de Materiais) a 4 °C.
   NOTA: Todos os anticorpos são diluídos em solução de bloqueio.
7. Enxágue as células por 3 x 5 min com PBS (−) por 5 min cada.
8. Incubar as células enxaguadas com os anticorpos secundários marcados com fluorescência apropriados por 1 h em RT (Tabela de Materiais).
9. Enxágue as células por 3 x 5 min com PBS (-) para remover os anticorpos secundários.
10. Incubar as células com solução de DAPI (1:10.000) diluída com PBS (−) por 5 min em RT.
11. Enxágue as células por 3 x 5 min com PBS (-).
12. Monte o poço usando o meio de montagem e visualize as células sob um microscópio de fluorescência.

Resultados

É importante ressaltar que há uma grande heterogeneidade no nível da pessoa e no nível do tempo nos caracteres das células iMG, incluindo morfologias e expressões gênicas. As células iMG em certos indivíduos assumem uma aparência numerosa de ramificação (Figura 1A), enquanto em outros permanecem esféricas (Figura 1B). As características do iMG podem diferir mesmo dentro de um único indivíduo, tornando as células iMG uma ferramenta fundamental pa...

Discussão

Técnicas analíticas que empregam células iMG podem servir como potentes ferramentas de pesquisa de tradução reversa ^5,6. Para gerar quantidades suficientes de células iMG humanas, os experimentadores devem projetar seus estudos levando em consideração certas questões. Amostras de sangue derivadas de seres humanos são extremamente sensíveis; consequentemente, as amostras obtidas garantem um processamento imediato e um manuseio meticuloso para evitar con...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% paraformaldehyde	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI solution	DOJINDO	28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Nacalai Tesque	14249-24	described as "PBS (−)"
Fetal Bovine Serum	biowest	S1760-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	described as "density gradient medium"
Human FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	described as "magnetic column"
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	described as "magnetic stand"
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144	described as "mounting media"
recombinant human GM-CSF	R&D Systems	215-GM
recombinant human IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	secondary antibody, rabbit, 1:1000