הנדסה של תאים דמויי מיקרוגליה המושרים על ידי דם אנושי לחקר המוח בתרגום לאחור

Summary

מחקר זה מתווה גישה חדשנית להקמת תאים דמויי מיקרוגליה (iMG) שמקורם במונוציטים אנושיים המאפשרים הערכה עקיפה של דלקת במוח. זה מציג מודל תאי שעשוי להועיל למחקר המתמקד בדלקת פוטנציאלית במוח ובהפרעות נוירופסיכיאטריות נלוות.

Abstract

מחקרים אחרונים שהשתמשו במודלים של בעלי חיים הדגישו את חשיבותם של תאי מיקרוגליה כמודולטורים אימונולוגיים חיוניים במחלות נוירופסיכיאטריות ופיזיות שונות. ניתוח מוח לאחר המוות והדמיית טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים הן שיטות מחקר מייצגות המעריכות הפעלת מיקרוגליאה בחולים אנושיים; הממצאים חשפו את הפעלת תאי המיקרוגליה במוחם של חולים המציגים הפרעות נוירופסיכיאטריות שונות וכאב כרוני. עם זאת, הטכניקה הנ"ל רק מקלה על הערכה של היבטים מוגבלים של הפעלת מיקרוגליה.

במקום ביופסיית מוח וטכניקת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, פיתחנו בתחילה טכניקה ליצירת תאים דמויי מיקרוגליה המושרים ישירות (iMG) ממונוציטים אנושיים טריים בדם היקפי על ידי השלמתם עם גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים ואינטרלוקין 34 למשך שבועיים. תאי iMG אלה יכולים לשמש לביצוע ניתוחים מורפולוגיים ומולקולריים דינמיים בנוגע לקיבולת פגוציטית ושחרור ציטוקינים לאחר גירוי מתח ברמת התא. לאחרונה, ניתוח שעתוק מקיף שימש כדי לאמת את הדמיון בין תאי iMG אנושיים לבין מיקרוגליה ראשונית במוח.

תאי iMG שמקורם במטופל עשויים לשמש כסמנים חלופיים מרכזיים לחיזוי הפעלת מיקרוגליאה במוחות אנושיים וסייעו בחשיפת פתופיזיולוגיה דינמית שלא הייתה ידועה בעבר של מיקרוגליה בחולים עם מחלת Nasu-Hakola, פיברומיאלגיה, הפרעה דו קוטבית ומחלת Moyamoya. לכן, הטכניקה מבוססת iMG משמשת ככלי רב ערך לתרגום לאחור ומספקת תובנות חדשניות להבהרת הפתופיזיולוגיה המולקולרית של תאי מיקרוגליה במגוון מחלות נפשיות ופיזיות.

Introduction

בשנים האחרונות הוצע כי דלקת במוח תופסת תפקידים מרכזיים בפתופיזיולוגיה של הפרעות מוח ונוירופסיכיאטריות שונות; תאי המיקרוגליה הודגשו כתאים אימונומודולטוריים מרכזיים על ידי ניתוח מוח אנושי לאחר המוות וטומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) המבוססות על טכניקות הדמיה ביולוגית 1,2,3,4. ניתוחי הדמיה של המוח וה-PET לאחר המוות מגלים ממצאים משמעותיים; עם זאת, גישות אלה אינן יעילות במונחים של לכידת הפעילות המולקולרית הדינמית של תאי מיקרוגליה אנושיים במוח בשלמותם. לכן, נדרשות אסטרטגיות חדשניות כדי לאפשר הערכה מקיפה של תפקודי מיקרוגליאה אנושיים ותפקוד לקוי ברמה המולקולרית והתאית.

בשנת 2014, הנדסנו במקור טכניקה חדשנית לייצור תאים דמויי מיקרוגליה (iMG)^{המושרים} ישירות ^5,6, לפני הפרסום הראשון של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם (iPSC) שמקורם בתאי מיקרוגליה בשנת 2016⁷. תוך שבועיים בלבד, המרנו בהצלחה מונוציטים אנושיים היקפיים בדם לתאי iMG על ידי מיטוב הציטוקינים, גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) ואינטרלוקין 34 (IL-34). כאשר פיתחנו טכניקה זו, שיטת התכנות מחדש החדשנית של השראת תאים עצביים מתאי iPS או פיברובלסטים רק החלה לשרור בעולם 8,9,10,11. עם זאת, באותו זמן, שיטה להשראת תאי מיקרוגליאה שמקורם ב- iPS עדיין לא דווחה, ויצירת מודל מיקרוגליאה אנושי שמקורו בתאים סומטיים היה רצוי. מאחר שציטוקינים כגון GM-CSF ו-IL-34, גורם מגרה מושבת מקרופאגים, דווחו כנחוצים להתפתחות ולתחזוקה של מיקרוגליה 12,13,14,15, שיערנו כי שילוב של ציטוקינים אלה יכול להיות מיושם ישירות כדי ליצור מודל תאי מיקרוגליאה ממונוציטים בדם. לבסוף, הצלחנו לפתח מודל של מיקרוגליה שמקורו במונוציטים על ידי שילוב GM-CSF ו- IL-34⁵. בנוסף, חלק מהשילובים האלה של ציטוקינים משמשים גם כדי לגרום לתאי מיקרוגליה מתאי iPS ^7,16 ומניחים שהם גורם חשוב ברכישת תכונות מיקרוגליה.

בניגוד לשיטות iPSC, תאי iMG אינם דורשים כל שינוי גנטי וניתן ליצור אותם בזמן קצר מאוד על ידי אינדוקציה כימית פשוטה, וכתוצאה מכך זמן נמוך יותר ועלויות כספיות. יתר על כן, תאי iMG אינם דורשים תכנות מחדש גנטי, ולכן אנו מאמינים כי תאי iMG הם תאים חלופיים חזקים להעריך לא רק את התכונות אלא גם את מצבי מיקרוגליה אנושיים. במאמר הראשוני על טכניקת iMG בשנת 2014, אישרנו כי תאי iMG מציגים פנוטיפ של מיקרוגליה אנושית, אשר יכול להיות שונה מונוציטים ומקרופאגים. לדוגמה, תאי iMG הציגו יחס ביטוי יתר של קולטן כימוקין CX3C 1 (CX3CR1) וקולטן כימוקין C-C מסוג 2 (CCR2) בהשוואה למונוציטים וסמנים אופייניים למיקרוגליה, כולל חלבון טרנסממברנה 119 (TMEM 119) וקולטן פורינרגי P2RY12 ^5,17. לאחרונה, אימתנו כי תאי iMG היקפיים שמקורם בדם דומים למיקרוגליה במוח בפרופיל ביטוי הגנים שלהם של סמנים מיקרוגליאליים ידועים באותו מטופל שעבר ניתוחי מוח¹⁸. תאי iMG ניתנים לניתוח עבור תפקודים דינמיים ברמה המולקולרית, כגון פגוציטוזה וייצור ציטוקינים, והם צפויים לפצות על החסרונות של חקר המוח לאחר המוות ומחקרי PET.

גילינו מנגנונים פתופיזיולוגיים דינמיים שלא היו ידועים בעבר המערבים מיקרוגליה בחולים שאובחנו עם מחלת Nasu-Hakola⁵, פיברומיאלגיה¹⁹, הפרעה דו קוטבית^20,21, או מחלת Moyamoya²². יתר על כן, בהתבסס על המתודולוגיה המקורית שלנו, מעבדות שונות השתמשו בתאי iMG (מעבדות מסוימות ייעדו שמות חלופיים לתאים אלה) ככלי מחקר חיוני לתרגום לאחור 23,24,25,26,27. Sellgren et al. יצרו בהצלחה תאי iMG בהתאם להמלצות שלנו וערכו ניתוח microarray אשר גילה כי תאים אלה דומים מאוד מיקרוגליה המוח האנושי²³. לאחרונה אישרנו את הדמיון בין תאי iMG אנושיים לבין תאי מיקרוגליה ראשוניים במוח באמצעות ריצוף RNA¹⁸.

מחקר זה נועד לתעד את המתודולוגיה ליצירת תאי iMG מדם היקפי אנושי כדי להקל על מחקר תרגום לאחור המתמקד במחלות נוירופסיכיאטריות. טכניקה זו מציגה פוטנציאל ככלי אנליטי סביר שיכול לייצר ללא מאמץ מודלים תאיים מיקרוגליאליים בזמן קצר, אפילו במעבדות לא מצוידות שאין בהן מנגנון העברת גנים או כוח אדם מיומן.

Protocol

פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת קיושו ועמד בכל הוראות הצהרת הלסינקי. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המשתתפים, כולל מתנדבים בריאים וחולים, לנתח את דמם ולפרסם את נתונם. החומרים והציוד מפורטים בטבלת החומרים, והרכבי הפתרונות מפורטים בטבלה 1.

1. הכנת מדיה ובופרים לניסויים

1. הכינו את מדיום הבידוד על ידי תוספת RPMI-1640 עם 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (56°C, 30 דקות) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
2. הכינו את מאגר הבידוד על ידי השלמת תמיסת החיץ הבסיסית בתמיסת אלבומין בסרום בקר 0.5% (BSA) ועיקרו אותה באמצעות סינון (0.22 מיקרומטר).

2. בידוד תאים חד-גרעיניים מדם שלם

1. העבר 15 מ"ל ממדיום שיפוע הצפיפות לצינור צנטריפוגה הדרגתי בצפיפות 50 מ"ל וצנטריפוגה ב- 1,000 × גרם למשך דקה אחת ב- 20 ° C.
   הערה: בודד 15 מ"ל דם לכל צינור צנטריפוגה הדרגתי בצפיפות של 50 מ"ל. הגדל את מספר הצינורות כאשר נפח הדם גבוה.
2. הומוגניזציה של הדם שנאסף בצינורות הפרין על ידי היפוך ולהסיר את המכסה מצינור איסוף הדם עם פינצטה מעוקרת אש.
3. יש לחלק נפח שווה (10-15 מ"ל) של דם למדיום שיפוע הצפיפות בצינור הצנטריפוגה של שיפוע הצפיפות.
4. הגדר את רמת ההאטה של הצנטריפוגה ל- 1 מתוך 4 רמות ואת הצנטריפוגה ל- 1,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   הערה: בקצב האטה זה, מהירות סיבוב של 180 × גרם (1,000 סל"ד) נעצרת תוך 3 דקות.
5. הכינו מספר שווה של צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל כמו צינורות הצנטריפוגות ההדרגתיות בצפיפות 50 מ"ל ומלאו כל צינור ב-10 מ"ל PBS (−).
6. הסירו את שכבת הפלזמה העליונה עד כ-1 ס"מ מעל המעיל הנפוח לאחר הצנטריפוגה.
   הערה: יש להכניס פיפטה שואפת אנכית לתוך הצינור ולשאוף בזהירות ממרכז משטח הנוזל. אין לשאוף יתר על המידה כדי לא להפריע למעיל הבאפי.
7. דקנו את כל הסופרנאטנט שנותר מצינור הצנטריפוגה בצפיפות של 50 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגה המכיל 10 מ"ל של PBS (−).
8. אפס את רמת ההאטה של הצנטריפוגה ל-3 מתוך 4 רמות, ואת הצנטריפוגה ל-250 × גרם למשך 10 דקות ב-RT. במהלך שלב זה, הכינו צינור צנטריפוגה אחד של 50 מ"ל ושני צינורות צנטריפוגות של 15 מ"ל ומסננת תאים של 100 מיקרומטר.
9. לאחר צנטריפוגה, לקבוע את הטמפרטורה של הצנטריפוגה ב 4 °C (75 °F). חפשו גלולה לבנה עם פריפריה אדומה בתחתית צינור הצנטריפוגה. מוציאים את הסופרנאטנט בשאיפה ומשחררים את הגלולה בעדינות על ידי הקשה.
10. מקם מסננת תאים של 100 מיקרומטר על צינור חרוטי של 50 מ"ל באמצעות פינצטה מעוקרת אש.
11. שלבו 13 מ"ל של אמצעי בידוד באחד הצינורות הצנטריפוגיים ושטפו את הדופן הפנימית כדי לאסוף את התאים כראוי. קח את מתלה התא ושטוף את הצינורות הצנטריפוגות הנותרים באופן רציף. לאחר איסוף התאים מכל הצינורות, מסננים את תרחיף התא דרך מסננת תאים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
    הערה: יש לקרר את אמצעי הבידוד לאורך כל תהליך הבידוד (שלבים 2.11-2.16).
12. שטפו כל צינור שוב עם 13 מ"ל של אמצעי בידוד כמתואר בשלב 2.11. לאסוף סך של 26 מ"ל של השעיית התא.
13. יש לחלק כמויות שוות לשני צינורות חרוטיים של 15 מ"ל, לספור את התאים ולחשב את הריכוז המתאים של מאגר בידוד (60 מיקרוליטר חיץ לכל 10⁷ תאים בסך הכל) לשלב 2.16.
    הערה: עדיף לעבוד עם הצינור החרוטי של 15 מ"ל מכיוון שנפח הנוזל קטן והנוזל מבעבע בקלות בעת פיפטציה בשלב 2.16.
14. צנטריפוגה ב 250 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (75 °F).
15. במהלך הצנטריפוגה, יש לחטא היטב את המעמד המגנטי (במיוחד את החלק הבא במגע עם העמוד) באתנול 70% ולהניח אותו על הספסל לייבוש באוויר. שמור את מאגר הבידוד על קרח.
16. הסר את הסופרנאטנט על ידי שאיפה (בשלב זה, חפש כדורים אדומים ~ 1 מ"מ עובי בגלל נוכחות של כדוריות דם אדומות), להוסיף את הכמות המתאימה של חיץ בידוד, ולשחרר את הגלולה בעדינות על ידי pipetting ~ 20x.

3. בידוד מונוציטים באמצעות מיקרו-כדוריות CD11b

1. מערבולת מגיב חסימת FcR אנושי למשך 10 שניות לפני היישום. לשלב את הכמות הנדרשת של מגיב (20 μL של מגיב חוסם FcR לכל 10⁷ תאים סה"כ) ולדגור בתא ב 4 ° C במשך 5 דקות.
2. מערבול את microbeads CD11b במשך 10 שניות לפני היישום. שלבו את הכמות הנדרשת של מגיב (20 מיקרו-כדוריות CD11b לכל 10⁷ תאים בסך הכל), ודגרו בתא של 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות תוך כדי תסיסה ידנית כל 5 דקות.
3. לאחר הדגירה, להוסיף 10 מ"ל של חיץ בידוד, להשהות על ידי pipetting עדין, צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
4. במהלך הצנטריפוגה, הניחו את העמוד המגנטי על המעמד המגנטי ושטפו אותו עם 3 מ"ל של מאגר בידוד.
   הערה: הימנע מלגעת בחלק המגנטי של העמוד ומקם את העמוד כראוי. אם בועות נכנסות לעמודה, הסר אותן עם פיפטה. חיץ הבידוד מחויב להיות מצונן לאורך כל תהליך הבידוד (שלבים 3.4-3.9).
5. הסר את הסופרנאטנט שלאחר הצנטריפוגה על ידי שאיפה, שלב 1 מ"ל של חיץ בידוד, ערבב על ידי פיפטינג בעדינות, ולהחיל את המתלה על העמוד.
6. שטף את העמודה 3x על-ידי הוספת 3 מ"ל של מאגר בידוד בכל פעם שמאגר העמודות ריק.
7. מניחים את העמוד בצינור חרוטי של 15 מ"ל מבלי לגעת בחלק המגנטי; לשלב 5 מ"ל של חיץ בידוד לתוך העמוד ולאלץ את הנוזל החוצה דרך העמוד עם בוכנה מוכנס לתוך הצינור.
8. צנטריפוגה את תרחיף התא שנאסף בצינור ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
9. לשאוף את supernatant ולהשהות מחדש את התאים בתווך בידוד. מכיוון ש~5-10% ממספר התאים שנספרו בשלב 2.13 ישוחזרו, התאימו את נפח התרחיף בהתאם למספר התאים.
   הערה: יש להשתמש במדיום בידוד ב-RT ולא לחמם אותו כדי למנוע שינוי טמפרטורה מהיר מ-4°C.
10. לספור את התאים ו aliquot 500 μL של תרחיף תאים לתוך כל באר של לוחות 24 באר בריכוז של 40 × 10⁴ תאים / מ"ל ולדגור לילה.
    הערה: יש לצבוע את מתלי התאים בהתאם לנפח הזריעה המותאם הנדרש עבור לוחות שונים. לדוגמה, 1 מ"ל עבור באר אחת בצלחת 12 בארות ו 250 μL עבור באר אחת בשקופית תא 8 באר.
11. לבסוף, יש להשליך או לחטא את הציוד המזוהם בהתאם למדיניות הטיפול בפסולת זיהומית שנקבעה על ידי המתקן.

4. אינדוקציה של תאי iMG ממונוציטים

1. הכינו את מדיום האינדוקציה על ידי תוספת מדיום השראות בסיסי עם תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית 1%, 10 ננוגרם/מ"ל רקומביננטי אנושי GM-CSF ו-100 ננוגרם/מ"ל IL-34 אנושי רקומביננטי.
2. החליפו את אמצעי הבידוד מהזריעה של היום הקודם בתווך אינדוקציה. הטו את הצלחת קדימה ושאפו מיד את התווך המדולדל מהקצה הקדמי של תחתית הבאר בעזרת פיפטה של פסטר. החלף את המדיום בקצב של מקסימום 1 צלחת (= 24 בארות) בכל פעם, ומיד לשלב 500 μL של מדיום אינדוקציה בעדינות.
   הערה: יש לבחור מונוציטים מודבקים בשלב זה.
3. לדגור על התאים במשך 14 יום כדי להשלים את הזירוז.
4. החלף את המדיום שוב עם 500 μL של מדיום אינדוקציה לאחר 14 ימים. לאחר מכן, לתחזוקה שלאחר האינדוקציה של התאים, החלף את מדיום האינדוקציה ב- 500 מיקרוליטר של מדיום אינדוקציה טרי מדי שבוע.

5. אימונוציטוכימיה

1. הסר את המדיום משקופית התא בעלת 8 הקידוחים שנזרעו עם תאים בשלב 3.10 על ידי שאיפה ושטוף עם PBS (−).
2. תקן את התאים למשך 20 דקות ב- RT עם 4% paraformaldehyde.
3. הסר את מגיב הקיבוע ושטוף את התאים במשך 3 x 5 דקות עם PBS (−).
4. חדרו את התאים עם PBS (−) המכיל 0.1% Triton X-100 ב-RT.
5. דגרו על התאים החדירים, עם תמיסת חסימה (3% BSA/PBS (−)) למשך שעה אחת ב-RT.
6. לדגור את התאים לילה עם נוגדנים ראשוניים (טבלה של חומרים) ב 4 ° C.
   הערה: כל הנוגדנים מדוללים בתמיסת חסימה.
7. שטוף את התאים במשך 3 x 5 דקות עם PBS (−) במשך 5 דקות כל אחד.
8. לדגור על התאים השטופים עם הנוגדנים המשניים המתויגים באופן פלואורסצנטי המתאימים למשך שעה אחת ב- RT (טבלה של חומרים).
9. שטוף את התאים במשך 3 x 5 דקות עם PBS (−) כדי להסיר את הנוגדנים המשניים.
10. דגרו על התאים עם תמיסת DAPI (1:10,000) מדוללת ב-PBS (−) למשך 5 דקות ב-RT.
11. שטוף את התאים במשך 3 x 5 דקות עם PBS (−).
12. הרכיבו את הבאר באמצעות מדיום ההרכבה ודמיינו את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

חשוב לציין, יש הטרוגניות רבה ברמת האדם וברמת התזמון בתווים של תאי iMG כולל מורפולוגיות וביטויי גנים. תאי iMG אצל אנשים מסוימים מקבלים מראה מסתעף (איור 1A), בעוד שבאחרים הם נשארים כדוריים (איור 1B). מאפייני iMG עשויים להיות שונים אפילו בתוך אדם יחיד, מה שהופך את תאי iMG...

Discussion

טכניקות אנליטיות המשתמשות בתאי iMG עשויות לשמש ככלי מחקר רבי עוצמה לתרגום לאחור ^5,6. כדי לייצר כמויות מספיקות של תאי iMG אנושיים, הנסיינים צריכים לתכנן את מחקריהם תוך התחשבות בנושאים מסוימים. דגימות דם שמקורן בבני אדם הן רגישות ביותר; כתוצאה מכך, הדגימות המתקבל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% paraformaldehyde	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI solution	DOJINDO	28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Nacalai Tesque	14249-24	described as "PBS (−)"
Fetal Bovine Serum	biowest	S1760-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	described as "density gradient medium"
Human FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	described as "magnetic column"
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	described as "magnetic stand"
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144	described as "mounting media"
recombinant human GM-CSF	R&D Systems	215-GM
recombinant human IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	secondary antibody, rabbit, 1:1000