تحضير الجزر الجنينية المجمدة غير البشرية للرئيسيات لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى المشترك وتسلسل ATAC ، والأيض السائب

Summary

يصف هذا البروتوكول إجراءات عزل النوى عالية الجودة من جزر البنكرياس الرئيسية غير البشرية المجمدة لاستخدامها في تسلسل الحمض النووي الريبي المتزامن أحادي النواة وتسلسل ATAC مع الحفاظ على الجزء الخلوي الأكبر للتحليلات الأيضية من نفس العينات.

Abstract

يتمثل أحد التحديات في الدراسات التي تستخدم الأنسجة التي تم جمعها من مجموعات متعددة في تجنب تأثيرات الدفعات عند التحضير لتجارب متعددة الأوميك واسعة النطاق ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية المشترك والأيض. تستخدم الطريقة في الدراسة الحالية جزر البنكرياس المجمدة بسرعة من الرئيسيات الجنينية غير البشرية التي تم جمعها على مدى عامين لإدخالها في تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ومقايسات تسلسل ATAC. تم الاحتفاظ بالجزء الخلوي المتولد أثناء الاستخراج النووي لقياس الطيف الكتلي للرحلان الكهربائي الشعري في نهاية المطاف والقياس الكمي اللاحق للمستقلب. تسمح هذه الطريقة بالتحليل الجماعي للمستقلبات التي تساهم في تغيير المناظر الطبيعية النسخية وفوق الجينية في الظروف التجريبية. إنه قابل للتطبيق على العديد من أنواع الأنسجة ويزيد من كمية المعلومات التي يمكن استخراجها من العينات غير المتوفرة بسهولة. نظرا لأن مساهمة التمثيل الغذائي في إنشاء الهوية الخلوية عن طريق التعديلات اللاجينية تصبح أكثر تقديرا ، فإن التقنيات التي تسمح بتحديد مساهمة المستقلبات في أنواع معينة من الخلايا تأتي في الوقت المناسب وضرورية.

Introduction

تعتبر جزر لانجرهانز البنكرياسية ضرورية لإدارة تحمل الجلوكوز طوال العمر. الفشل في ضبط مستويات الجلوكوز في الدم بشكل صحيح عن طريق هرمون خفض الجلوكوز أو الأنسولين أو هرمون رفع الجلوكوز ، يؤدي الجلوكاجون إلى مرض السكري¹. تشمل عوامل الخطر القابلة للتعديل لتقليل مخاطر مرض السكري ممارسة الرياضة والنظام الغذائي. بالإضافة إلى ذلك ، أصبح من الواضح أن النظام الغذائي للأم أثناء الحمل له أيضا تأثير على قابلية النسل للإصابة بمرض السكري في مرحلة البلوغ ^2,3. وبالتالي ، هناك حاجة إلى طرق لتحليل آثار النظام الغذائي للأم والتعرض الآخر ، مثل الأدوية المستخدمة أثنا....

Protocol

تم إجراء استرجاع الجزر وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) التابعة لمركز أوريغون الوطني لأبحاث الرئيسيات (ONPRC) وجامعة أوريغون للصحة والعلوم وتمت الموافقة عليه من قبل ONPRC IACUC. يلتزم ONPRC بقانون ولوائح رعاية التي تفرضها وزارة الزراعة الأمريكية (USDA) وسياسة خدمة الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبرات. تم تطبيق البروتوكول هنا على الجزر الصغيرة من المكاك Rhesus الجنينية التي تم تشريحها في يوم الحمل 145 (عادة ما يكون حمل المكاك الريسوس 173-175 يوما). يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة لهذه الدراسة في جدول المواد.

1. عزل الجزيرة

النتائج

تعتمد جودة مخرجات التسلسل اعتمادا كبيرا على جودة المدخلات النووية. سيؤدي التفجير النووي وتلف الغشاء النووي الخارجي إلى تلوث الحمض النووي الريبي والحمض النووي المحيط في التحليل ، مما سيؤدي إلى حدوث ضوضاء في البيانات. سيكون للمستخلص النووي النقي دليل ضئيل على وجود نوى مغ.......

Discussion

تاريخيا ، استخدمت طرق العزل النووي لتسلسل الحمض النووي الريبي و ATAC أحادي النواة مخازن تحتوي على منظفات لا تتوافق مع قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) ، وهي تقنية شائعة تستخدم لتحديد كمية الأيض^16,17. يسمح البروتوكول الحالي بالج.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 G rat brain cannula injector	Protech International	8IC315IS5SPC	For duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15-140-122	For RT media
FBS	Millipore/Sigma	F4135-500ML	For RT media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11-875-135	For RT media
Collagenase P	Sigma Aldrich	11213865001	For digestion of pancreas
Bovine Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001	For RT media and isolation
Dextrose	Fisher	D16-1	Final concentration will be 2.8 mM
Calcium Chloride	Fisher	C4901-500G	Final concentration will be 0.5 mM
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5	Research Products International	A30075100	Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	For handpicking islets
20x Nuclei Buffer	10X Genomics	2000153/2000207
Digitonin (5%)	Thermo Fisher Scientific	BN2006	Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)	Miltenyi Biotec	130-091-376
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	i8896	Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5	Sigma Aldrich	T2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma Aldrich	S6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma Aldrich	M1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335402001
DTT	Research Products International	D11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
Tween 20	Fisher Bioreagents	BP337-500	Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free Water	Promega	PR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)	Eppendorf	30108310
Cryovials (1.5 mL)	VWR	20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)	Denville	C-2177
Trypan Blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T-10282
Dual-Chamber Cell Counting Slides	Bio-Rad	1450011
MiiliQ Ultrapure Water System	Millipore/Sigma	7003/05/10/15
5 kDa cut-off filter	HMT Metabolome Technologies
Internal Standards	HMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes	Eppendorf	2231000602
Pipette Tips, 10 µL	VWR	76322-528
Pipette Tips, 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	21-236-2A
Pipette Tips, 20 µL	Genesee Scientific	23-404
Pipette Tips, 200 µL	USA Scientific	1120-8810
Phase Contrast Microscope	Olympus	BX41-PH-B
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman-Coulter	B06315
RNase-ZAP	Sigma Aldrich	R2020