تحضير الجزر الجنينية المجمدة غير البشرية للرئيسيات لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى المشترك وتسلسل ATAC ، والأيض السائب

Summary

يصف هذا البروتوكول إجراءات عزل النوى عالية الجودة من جزر البنكرياس الرئيسية غير البشرية المجمدة لاستخدامها في تسلسل الحمض النووي الريبي المتزامن أحادي النواة وتسلسل ATAC مع الحفاظ على الجزء الخلوي الأكبر للتحليلات الأيضية من نفس العينات.

Abstract

يتمثل أحد التحديات في الدراسات التي تستخدم الأنسجة التي تم جمعها من مجموعات متعددة في تجنب تأثيرات الدفعات عند التحضير لتجارب متعددة الأوميك واسعة النطاق ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية المشترك والأيض. تستخدم الطريقة في الدراسة الحالية جزر البنكرياس المجمدة بسرعة من الرئيسيات الجنينية غير البشرية التي تم جمعها على مدى عامين لإدخالها في تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ومقايسات تسلسل ATAC. تم الاحتفاظ بالجزء الخلوي المتولد أثناء الاستخراج النووي لقياس الطيف الكتلي للرحلان الكهربائي الشعري في نهاية المطاف والقياس الكمي اللاحق للمستقلب. تسمح هذه الطريقة بالتحليل الجماعي للمستقلبات التي تساهم في تغيير المناظر الطبيعية النسخية وفوق الجينية في الظروف التجريبية. إنه قابل للتطبيق على العديد من أنواع الأنسجة ويزيد من كمية المعلومات التي يمكن استخراجها من العينات غير المتوفرة بسهولة. نظرا لأن مساهمة التمثيل الغذائي في إنشاء الهوية الخلوية عن طريق التعديلات اللاجينية تصبح أكثر تقديرا ، فإن التقنيات التي تسمح بتحديد مساهمة المستقلبات في أنواع معينة من الخلايا تأتي في الوقت المناسب وضرورية.

Introduction

تعتبر جزر لانجرهانز البنكرياسية ضرورية لإدارة تحمل الجلوكوز طوال العمر. الفشل في ضبط مستويات الجلوكوز في الدم بشكل صحيح عن طريق هرمون خفض الجلوكوز أو الأنسولين أو هرمون رفع الجلوكوز ، يؤدي الجلوكاجون إلى مرض السكري¹. تشمل عوامل الخطر القابلة للتعديل لتقليل مخاطر مرض السكري ممارسة الرياضة والنظام الغذائي. بالإضافة إلى ذلك ، أصبح من الواضح أن النظام الغذائي للأم أثناء الحمل له أيضا تأثير على قابلية النسل للإصابة بمرض السكري في مرحلة البلوغ ^2,3. وبالتالي ، هناك حاجة إلى طرق لتحليل آثار النظام الغذائي للأم والتعرض الآخر ، مثل الأدوية المستخدمة أثناء الحمل ، على خلايا بيتا المنتجة للأنسولين في الكائنات الحية النموذجية أثناء النمو. على سبيل المثال ، يمكن تقييم الجزر الصغيرة من نسل الرئيسيات الجنينية غير البشرية (NHP) لآثار التعرض التنموي. على غرار البشر ، عادة ما يكون لدى NHPs ولادات مفردة وتختلف في استجابتها الفسيولوجية لتغذية النظام الغذائي على النمط الغربي⁴. في حين أن الحمل وتطور الجنين في NHPs يشتركان في العديد من أوجه التشابه مع البشر ، مما يجعلهم من الأنواع ذات الصلة للغاية بدراسات البرمجة الأيضية ، فإن التحديات التي تواجه إجراء فحوصات المعلوماتية الحيوية المقارنة على نسل NHP تشمل موسم التزاوج المقيد وجمع العينات المتقطع. لذلك ، تعتبر الأساليب التي تسمح بالتخزين طويل الأجل قبل معالجة العينات وتحليلها مثالية. يصف هذا البروتوكول تحضير العينات لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ، وتسلسل ATAC ، والأيض السيتوبلازمي السائب.

أظهرت الدراسات التي أجراها آخرون في مجال بيولوجيا الجزر تداخلا في التوقيعات الجينية التي لوحظت في العينات المحضرة عبر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ^5,6. تسمح كلتا الطريقتين بتحديد النصوص التي تساهم في تمييز السمات بين أنواع الخلايا المختلفة داخل سكان الجزر. من خلال استخدام المنظفات اللطيفة على الأنسجة المجمدة ، يمكن استخدام النوى السليمة في وقت واحد لتسلسل ATAC ، مما يسمح بتحديد مناطق الكروماتين التي يمكن الوصول إليها. يسمح الجمع بين تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة وتسلسل ATAC بتوصيف أفضل للشبكات التنظيمية الجينية⁷.

كان إعداد العينات لعلم الأيض محدودا تقليديا بسبب الحاجة إلى إدخال حجم عينة كبير للكروماتوغرافيا السائلة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب النظر بعناية في المخازن المؤقتة المستخدمة أثناء تحضير العينة لتجنب قمم الرنين المغناطيسي النووي الخاطئة في بيانات قياس الطيف الكتلي. نظرا لانخفاض عدد العينات التي تمثل تحديا ومكلفة للحصول عليها في دراسات الرئيسيات ، فإن تخصيص الجزر من ذرية مختلفة نحو التجارب النسخية مقابل التجارب الأيضية قد يكون صعبا. وبالتالي ، يستخدم هذا البروتوكول الجزء الخلوي المهمل عادة المتولد أثناء التجزئة الخلوية لتجارب النواة الواحدة. تسمح هذه الطريقة بالتوصيف المتزامن للنصوص ومناطق الكروماتين المفتوحة التي تحدد المجموعات الفرعية الخلوية في جزر الجنين مع القياس الكمي للمستقلبات المنتجة داخل الجزر (الشكل 1). تم تكييف هذا البروتوكول من بروتوكول مثبت نشرته 10x Genomics لعزل النوى من أنسجة دماغ الفأر الجنينية المجمدة (الإصدار CG000366 Rev^{D 8})⁷.

Protocol

تم إجراء استرجاع الجزر وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) التابعة لمركز أوريغون الوطني لأبحاث الرئيسيات (ONPRC) وجامعة أوريغون للصحة والعلوم وتمت الموافقة عليه من قبل ONPRC IACUC. يلتزم ONPRC بقانون ولوائح رعاية التي تفرضها وزارة الزراعة الأمريكية (USDA) وسياسة خدمة الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبرات. تم تطبيق البروتوكول هنا على الجزر الصغيرة من المكاك Rhesus الجنينية التي تم تشريحها في يوم الحمل 145 (عادة ما يكون حمل المكاك الريسوس 173-175 يوما). يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة لهذه الدراسة في جدول المواد.

1. عزل الجزيرة

1. استئصال البنكرياس الجنيني من الأنسجة المحيطة⁹ ووضعه في محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج.
2. قم بإزالة البنكرياس من برنامج تلفزيوني ونفخه باستخدام كولاجيناز P (0.6 مجم / مل) عن طريق قنية قناة البنكرياس باستخدام حاقن قنية دماغ القوارض 33 جرام.
3. قسم البنكرياس إلى ستة أقسام بمقص جراحي معقم واهضمه لمدة 27-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في محلول كولاجيناز.
4. قم بإعداد وسائط RT من خلال الجمع بين 10٪ FBS و 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين في RPMI 1640.
5. اسكب كولاجيناز وأضف 10 مل من وسائط RT.
6. يهز بلطف لمدة 1 دقيقة لتعطيل النسيج الضام المتبقي.
7. قم بإزالة المواد غير المهضومة عن طريق الإجهاد من خلال مرشح 500 ميكرومتر.
8. اغسل الجزر مرتين باستخدام 50 مل من وسائط RT.
9. احتضان الجزر في DNase I البقري (0.8 وحدة / مل) في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
10. استزرع الجزر بين عشية وضحاها في وسط RT مع DNase I البقري (0.4 وحدة / مل) عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
11. شحن الجزر في عبوات متخصصة في درجة الحرارة المحيطة مع عبوات جل للتحكم في درجة الحرارة.

2. عينة مصرفية للتخزين طويل الأجل

1. قم بتقييم حجم الجزر الصغيرة باستخدام شبكاني متدرج ولاحظ درجة الأنسجة العنيبية والقنوية قيد التحضير.
2. اختر الجزر الصغيرة يدويا باستخدام ماصة آلية في طبق 60 مم يحتوي على 5 مل من الجلوكوز 2.8 مللي متر DMEM.
   ملاحظة: من الضروري تقليل كمية الأنسجة العنيبية والأنسجة القنوية التي سيتم تخزينها في إعداد الجزيرة النهائي. تم الإبلاغ عن تفاصيل الجزر المثالية للاستخدام في البروتوكول السابق⁹.
3. اختر الجزر الصغيرة في أنبوب سعة 1.5 مل وقم بتدويرها عند ~ 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
4. إعادة تعليق الجزر في الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من 1x PBS.
5. تدور لمدة 5 دقائق في ~ 300 × غرام في 4 °C. تخلص من المادة الطافية.
6. كرر الخطوات 2.3-2.5 مرتين أخريين.
7. قم بتجميد الجزر في أنبوب سعة 1.5 مل لمدة 10 ثوان في النيتروجين السائل.
8. قم بتخزين الحبيبات في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يوم العزل النووي.

3. التجزئة الخلوية لعزل النوى والكسر السيتوبلازمي

1. تحضير المخازن المؤقتة لاستخراج النوى (الجدول 1).
   1. تأكد من أن المقعد والماصات والكواشف خالية من RNase.
   2. قم بإعداد الغسيل ، والتحلل المركز ، وتخفيف التحلل ، ومخازن النوى المخففة وفقا للجدول 1.
   3. قم بإعداد محلول تحلل 0.1x في أنبوب سعة 5 مل باستخدام المخزن المؤقت لتخفيف التحلل لتخفيف المحلول المؤقت المركز.
2. تجانس الأنسجة
   1. أخرج العينات من الفريزر -80 درجة مئوية وضعها على الثلج على الفور.
   2. أضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل 0.1x إلى كريات الأنسجة واحتضانها لمدة 3 دقائق على الجليد.
   3. باستخدام مدقة بيليه خالية من RNase يمكن التخلص منها ، قم بتجانس الأنسجة برفق 15 مرة على الجليد.
   4. احتضان العينات على الجليد لمدة 10 دقائق.
   5. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل إلى المجانس وماصة بلطف على الثلج.
   6. قم بتجهيز مرشح ما قبل الفصل 30 ميكرومتر عن طريق إضافة 300 مل من المخزن المؤقت للغسيل إلى الفلتر فوق أنبوب سعة 5 مل.
   7. قم بتصفية التجانس الخلوي 1 مل باستخدام مرشح ما قبل الفصل 30 ميكرومتر في أنبوب 5 مل.
   8. قم بتدوير التجانس المرشح عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح عند 4 درجات مئوية.
3. جمع وتخزين المواد الطافية للأيض
   1. قم بإزالة 1 مل من المادة الطافية من الخطوة 3.2.8 باستخدام ماصة وأضفها إلى 1.5 مل كريوفيال على الجليد.
   2. قم بتجميد المادة الطافية على الفور عند -80 درجة مئوية. سيتم استخدام هذا الطافي في الأيض.
4. تحضير النوى لنواة واحدة تسلسل الحمض النووي الريبي و ATAC
   1. أعد تعليق حبيبات النوى برفق عن طريق إضافة 1 مل من محلول الغسيل إلى الحبيبات بالتنقيط. ماصة ببطء 5 مرات.
   2. قم بتدوير الحبيبات المغسولة عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح عند 4 درجات مئوية.
   3. كرر الخطوتين 3.4.1 و3.4.2 مرة أخرى.
   4. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق النوى في 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل. حافظ على التحضير النووي على الجليد.
   5. نضح 10 ميكرولتر من معلق النوى باستخدام ماصة واخلطها مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان أزرق عن طريق السحب بلطف.
   6. أضف 10 ميكرولتر من النوى وخليط Trypan الأزرق إلى شريحة عداد خلية آلية باستخدام ماصة وضعها في الجهاز.
   7. تحديد تركيز النوى في النوى/ميكرولتر.
      ملاحظة: على عكس المستحضرات الخلوية لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، ستكتشف عدادات الخلايا الآلية النوى كخلايا ميتة. لا ينبغي أن يكون أكثر من 95 ٪ من هذا التحضير على الهواء مباشرة على عدادات الخلايا الآلية. إذا كان أكثر من 5٪ من السكان النوويين على قيد الحياة ، فيمكن ترشيح معلق النوى مرة إضافية من خلال مرشح ما قبل الفصل 30 ميكرومتر وتدويره لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية. يمكن بعد ذلك إعادة حساب تركيز النوى كما هو موضح في الخطوة 3.4.6.
   8. بناء على استعادة النوى المستهدفة المطلوبة ، أعد تعليق النوى إلى التركيز اللازم باستخدام محلول نوى 1x وانتقل إلى إعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي و ATAC أحادي^{النواة 10}.

4. تحضير الكسر الخلوي لقياس الطيف الكتلي للرحلان الكهربائي الشعري (CE-MS)

1. اجمع بين 80 ميكرولتر من الكسر الخلوي الذي تم جمعه في الخطوة 3.3.1 مع 20 ميكرولتر من المياه النانو النقية التي تحتوي على معايير داخلية.
2. تابع CE-MS والتحليل كما هو موضح سابقا^11،12،13.

النتائج

تعتمد جودة مخرجات التسلسل اعتمادا كبيرا على جودة المدخلات النووية. سيؤدي التفجير النووي وتلف الغشاء النووي الخارجي إلى تلوث الحمض النووي الريبي والحمض النووي المحيط في التحليل ، مما سيؤدي إلى حدوث ضوضاء في البيانات. سيكون للمستخلص النووي النقي دليل ضئيل على وجود نوى مغ...

Discussion

تاريخيا ، استخدمت طرق العزل النووي لتسلسل الحمض النووي الريبي و ATAC أحادي النواة مخازن تحتوي على منظفات لا تتوافق مع قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) ، وهي تقنية شائعة تستخدم لتحديد كمية الأيض^16,17. يسمح البروتوكول الحالي بالج...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 G rat brain cannula injector	Protech International	8IC315IS5SPC	For duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15-140-122	For RT media
FBS	Millipore/Sigma	F4135-500ML	For RT media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11-875-135	For RT media
Collagenase P	Sigma Aldrich	11213865001	For digestion of pancreas
Bovine Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001	For RT media and isolation
Dextrose	Fisher	D16-1	Final concentration will be 2.8 mM
Calcium Chloride	Fisher	C4901-500G	Final concentration will be 0.5 mM
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5	Research Products International	A30075100	Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	For handpicking islets
20x Nuclei Buffer	10X Genomics	2000153/2000207
Digitonin (5%)	Thermo Fisher Scientific	BN2006	Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)	Miltenyi Biotec	130-091-376
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	i8896	Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5	Sigma Aldrich	T2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma Aldrich	S6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma Aldrich	M1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335402001
DTT	Research Products International	D11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
Tween 20	Fisher Bioreagents	BP337-500	Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free Water	Promega	PR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)	Eppendorf	30108310
Cryovials (1.5 mL)	VWR	20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)	Denville	C-2177
Trypan Blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T-10282
Dual-Chamber Cell Counting Slides	Bio-Rad	1450011
MiiliQ Ultrapure Water System	Millipore/Sigma	7003/05/10/15
5 kDa cut-off filter	HMT Metabolome Technologies
Internal Standards	HMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes	Eppendorf	2231000602
Pipette Tips, 10 µL	VWR	76322-528
Pipette Tips, 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	21-236-2A
Pipette Tips, 20 µL	Genesee Scientific	23-404
Pipette Tips, 200 µL	USA Scientific	1120-8810
Phase Contrast Microscope	Olympus	BX41-PH-B
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman-Coulter	B06315
RNase-ZAP	Sigma Aldrich	R2020