הכנת איים עובריים פרימטים קפואים שאינם אנושיים לריצוף RNA משולב של גרעינים בודדים וריצוף ATAC, ומטבולומיקה בתפזורת

Summary

פרוטוקול זה מתאר הליכים לבידוד גרעינים באיכות גבוהה מאיי לבלב פרימטים קפואים שאינם אנושיים לשימוש בריצוף RNA סימולטני של גרעין יחיד וריצוף ATAC תוך שמירה על החלק הציטוסולי בתפזורת לניתוחים מטבוליים מאותן דגימות.

Abstract

אחד האתגרים במחקרים המשתמשים ברקמה שנאספה מקבוצות מרובות הוא הימנעות מהשפעות אצווה בעת הכנה לניסויים רב-אומיים בקנה מידה גדול, כגון ריצוף RNA משולב של תא בודד ומטבוליקה. השיטה במחקר הנוכחי משתמשת באיי לבלב קפואים מפרימטים עובריים לא אנושיים שנאספו במשך שנתיים לקלט לריצוף RNA של גרעין יחיד ולמבחני ריצוף ATAC. החלק הציטוסולי שנוצר במהלך ההפקה הגרעינית נשמר עבור ספקטרומטריית מסה אלקטרופורזה נימית במורד הזרם וכימות מטבוליטים לאחר מכן. שיטה זו מאפשרת ניתוח בתפזורת של מטבוליטים התורמים לנופים הטרנסקריפטומיים והאפיגנומיים המשתנים בתנאי ניסוי. הוא ישים לסוגי רקמות רבים וממקסם את כמות המידע שניתן לחלץ מדגימות שאינן זמינות. ככל שתרומת חילוף החומרים להקמת זהות תאית באמצעות שינויים אפיגנטיים הופכת מוערכת יותר, טכניקות המאפשרות לזהות את תרומתם של מטבוליטים בסוגי תאים ספציפיים הן בזמן והכרחי.

Introduction

איי הלבלב של לנגרהנס הם קריטיים לניהול סבילות לגלוקוז לאורך כל החיים. כישלון לכוונן כראוי את רמות הגלוקוז בדם באמצעות הורמון להורדת גלוקוז, אינסולין, או הורמון העלאת גלוקוז, גלוקגון גורם סוכרת¹. גורמי סיכון הניתנים לשינוי כדי למזער את הסיכון לסוכרת כוללים פעילות גופנית ודיאטה. בנוסף, מתברר כי לתזונה אימהית במהלך ההריון יש השפעה גם על רגישות הצאצאים לסוכרת בבגרות ^2,3. לפיכך, יש צורך בשיטות לנתח את ההשפעות של תזונה אימהית וחשיפות אחרות, כגון תרופות המשמשות במהלך ההריון, על תאי בטא מייצרי אינסולין באורגניזמים מודל במהלך ההתפתחות. לדוגמה, ניתן להעריך איים מצאצאים של פרימטים עובריים שאינם אנושיים (NHP) עבור ההשפעות של חשיפות התפתחותיות. בדומה לבני אדם, NHPs בדרך כלל עוברים לידות סינגלטון ונבדלים זה מזה בתגובה הפיזיולוגית שלהם לתזונה בסגנון מערבי⁴. בעוד שההיריון וההתפתחות העוברית של NHPs חולקים קווי דמיון רבים עם בני אדם, מה שהופך אותם למין רלוונטי ביותר למחקרי תכנות מטבוליים, אתגרים בביצוע בדיקות ביואינפורמטיות השוואתיות על צאצאי NHP כוללים עונת הזדווגות מוגבלת ואיסוף דגימות לסירוגין. לכן, גישות המאפשרות אחסון לטווח ארוך לפני עיבוד וניתוח הדגימה הן אידיאליות. פרוטוקול זה מתאר את הכנת הדגימות לריצוף RNA של גרעין יחיד, ריצוף ATAC ומטבוליקה ציטופלזמית בתפזורת.

מחקרים שנערכו על ידי אחרים בתחום הביולוגיה של האיונים הדגימו חפיפה בחתימות הגנטיות שנצפו בדגימות שהוכנו באמצעות ריצוף RNA חד-תאי וריצוף RNA של גרעין יחיד ^5,6. שתי השיטות מאפשרות זיהוי של תעתיקים התורמים להבחנה בין סוגי תאים שונים באוכלוסיית האיונים. באמצעות שימוש בדטרגנטים עדינים על רקמות קפואות פלאש, ניתן להשתמש בו זמנית בגרעינים שלמים לריצוף ATAC, המאפשר קביעת אזורי כרומטין נגישים. שילוב ריצוף RNA של גרעין יחיד עם ריצוף ATAC מאפשר אפיון טוב יותר של רשתות בקרת גנים⁷.

הכנת דגימות למטבולומיקה הוגבלה באופן מסורתי על ידי הצורך בקלט נפח מדגם גבוה עבור כרומטוגרפיה נוזלית. בנוסף, יש לתת את הדעת בזהירות על המאגרים המשמשים במהלך הכנת הדגימה כדי למנוע שיאי NMR שגויים בנתונים ספקטרומטריים מסה. בהתחשב במספר הנמוך של דגימות מאתגרות ויקרות לרכוש במחקרי פרימטים, הקצאת איים מצאצאים שונים לניסויים טרנסקריפטומיים לעומת מטבוליים יכולה להיות קשה. לפיכך, פרוטוקול זה עושה שימוש במקטע הציטוסולי המושלך בדרך כלל שנוצר במהלך שבירה תאית לניסויים בגרעין יחיד. שיטה זו מאפשרת אפיון סימולטני של תעתיקים ואזורי כרומטין פתוחים המגדירים תת-קבוצות תאיות באיים עובריים, תוך מדידה כמותית של המטבוליטים המיוצרים בתוך איים (איור 1). פרוטוקול זה מעובד מפרוטוקול מוכח שפורסם על ידי 10x genomics לבידוד גרעינים מרקמת מוח עכבר עוברית קפואה במהירות הבזק (גרסה CG000366 Rev D⁸)⁷.

Protocol

שאיבת האיים בוצעה בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של המרכז הלאומי לחקר פרימטים באורגון (ONPRC) ואוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע ואושרה על ידי ONPRC IACUC. ONPRC מצייתת לחוק רווחת בעלי החיים ולתקנות הנאכפות על ידי משרד החקלאות של ארצות הברית (USDA) ולמדיניות שירותי בריאות הציבור בנושא טיפול אנושי ושימוש במעבדה. הפרוטוקול כאן הוחל על איים מקופי מקוק רזוס עובריים שנקרופסי ביום ההריון 145 (הריון רזוס מקוק הוא בדרך כלל 173-175 ימים). פרטי הריאגנטים והציוד ששימש למחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. בידוד האי

1. מוציאים את הלבלב העוברי מהרקמות הסובבות אותו⁹ ומניחים אותו במי מלח חוצצים פוספט קר כקרח.
2. הסר את הלבלב מ- PBS וניפח אותו עם collagenase P (0.6 מ"ג / מ"ל) באמצעות קנולציה של צינור הלבלב באמצעות מזרק צינורית מוח מכרסם 33 גרם.
3. מחלקים את הלבלב לשישה חלקים בעזרת מספריים כירורגיים סטריליים ומעכלים במשך 27-30 דקות ב-37°C בתמיסת collagenase.
4. הכן מדיה RT על ידי שילוב 10% FBS ו 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין לתוך RPMI 1640.
5. יוצקים את collagenase ולהוסיף 10 מ"ל של מדיה RT.
6. נערו בעדינות במשך דקה אחת כדי לשבש את רקמת החיבור שנותרה.
7. יש להסיר חומר לא מעוכל על-ידי מאמץ דרך מסנן של 500 מיקרומטר.
8. לשטוף את האיים פעמיים עם 50 מ"ל של מדיה RT.
9. לדגור על האיים ב- DNase I של בקר (0.8 U / mL) באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
10. תרבית את האיים לילה במדיה RT עם DNase בקר I (0.4 U / mL) ב 37 ° C עם 5% CO₂.
11. אוניית איים באריזה מיוחדת בטמפרטורת הסביבה עם חבילות ג'ל לבקרת טמפרטורה.

2. בנקאות לדוגמה לאחסון לטווח ארוך

1. להעריך איים עבור גודל באמצעות reticle בקנה מידה ולציין את מידת acinar ורקמה ductal בהכנה.
2. קטיף ידני של איים עם פיפטה אוטומטית לתוך צלחת 60 מ"מ המכילה 5 מ"ל של 2.8 mM גלוקוז DMEM.
   הערה: חובה למזער את כמות הרקמה האצינארית והרקמה הצינורית שתיאגר בהכנת האיון הסופי. פרטים על איים אידיאליים לשימוש מדווחים בפרוטוקול קודם⁹.
3. בחר איים לתוך צינור 1.5 מ"ל וסחרור ב~ 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
4. השהה מחדש את האיים ב- PBS 1x ללא סידן ומגנזיום.
5. סחרור במשך 5 דקות ב~ 300 x גרם ב- 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט.
6. חזור על שלבים 2.3-2.5 פעמיים נוספות.
7. הבזק להקפיא את האיים בצינור 1.5 מ"ל עבור 10 s בחנקן נוזלי.
8. יש לאחסן את הגלולה בטמפרטורה של -80°C עד ליום הבידוד הגרעיני.

3. שבר תאי לבידוד גרעינים ושבר ציטופלזמי

1. הכנת מאגרים למיצוי גרעינים (טבלה 1).
   1. ודא כי הספסל, פיפטות וריאגנטים הם ללא RNase.
   2. הכינו את השטיפה, הליזה המרוכזת, דילול הליזיס ומאגרי הגרעינים המדוללים לפי טבלה 1.
   3. הכן חיץ ליזה 0.1x בצינור 5 מ"ל באמצעות מאגר דילול הליזה כדי לדלל את מאגר הליזה המרוכז.
2. הומוגניזציה של רקמות
   1. הוציאו את הדגימות מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C והניחו אותן מיד על קרח.
   2. מוסיפים 500 μL של חיץ ליזיס 0.1x לכדורי הרקמה ודגורים במשך 3 דקות על קרח.
   3. באמצעות מזיק גלולה חד פעמי ללא RNase, הומוגני בעדינות את הרקמה 15 פעמים על קרח.
   4. לדגור את הדגימות על קרח במשך 10 דקות.
   5. מוסיפים 500 μL של חיץ כביסה להומוגנט ופיפטה עדינה על קרח.
   6. צרו מסנן קדם-הפרדה של 30 מיקרומטר על ידי הוספת 300 מ"ל של חיץ שטיפה למסנן מעל צינור של 5 מ"ל.
   7. סנן את ההומוגנט התאי של 1 מ"ל באמצעות מסנן קדם-הפרדה של 30 מיקרומטר לתוך הצינור של 5 מ"ל.
   8. סובב את ההומוגנט המסונן ב 500 x גרם במשך 5 דקות בצנטריפוגת דלי מתנדנד ב 4 ° C.
3. איסוף ואחסון סופרנטנט למטבולומיקה
   1. הסר 1 מ"ל של supernatant משלב 3.2.8 עם פיפטה ולהוסיף 1.5 מ"ל cryovial על קרח.
   2. מיד להקפיא את supernatant ב -80 מעלות צלזיוס. סופרנאטנט זה ישמש למטבולומיקה.
4. הכנת גרעינים לריצוף RNA ו-ATAC של גרעין בודד
   1. השהה מחדש בעדינות את גלולת הגרעינים על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ כביסה לטיפה של הכדור. פיפטה לאט 5 פעמים.
   2. סובבו את הגלולה שטופה ב 1000 x גרם במשך 5 דקות בצנטריפוגת דלי מתנדנדת ב 4 °C.
   3. חזור על שלבים 3.4.1 ו- 3.4.2 פעם נוספת.
   4. לאחר השטיפה הסופית, השהה מחדש את הגרעינים ב 1 מ"ל של חיץ שטיפה. שמור על הכנה גרעינית על קרח.
   5. יש לשאוף 10 μL של תרחיף גרעינים עם פיפטה ולערבב עם 10 μL של 0.4% Trypan blue על ידי פיפטינג עדין.
   6. הוסף 10 μL של גרעיני הגרעינים ותערובת כחול טריפאן לשקופית מונה תאים אוטומטית עם פיפטה ומניחים אותו במכשיר.
   7. קביעת ריכוז גרעינים בגרעינים/μL.
      הערה: בניגוד להכנות תאיות לריצוף רנ"א חד-תאי, מוני תאים אוטומטיים יזהו גרעינים כתאים מתים. לא יותר מ 95% של הכנה זו צריך להיות חי על מוני תאים אוטומטיים. אם יותר מ -5% מהאוכלוסייה הגרעינית חיה, ניתן לסנן את תרחיף הגרעינים זמן נוסף דרך מסנן קדם-הפרדה של 30 מיקרומטר ולסובב במשך 5 דקות ב 1000 x גרם ב 4 ° C. לאחר מכן ניתן לחשב מחדש את ריכוז הגרעינים כמתואר בשלב 3.4.6.
   8. בהתבסס על התאוששות הגרעינים הממוקדת הרצויה, יש להשעות מחדש את הגרעינים לריכוז הדרוש באמצעות מאגר גרעינים 1x ולהמשיך להכנת ספריית RNA וריצוף ATAC של גרעין יחיד¹⁰.

4. הכנת מקטע ציטוסולי לאלקטרופורזה נימית- ספקטרומטריית מסה (CE-MS)

1. שלב 80 μL של מקטע ציטוסולי שנאסף בשלב 3.3.1 עם 20 μL של מים ננו-טהורים המכילים תקנים מופנמים.
2. המשך עם CE-MS וניתוח כפי שתואר קודם לכן 11,12,13.

תוצאות

איכות תפוקות הריצוף תלויה מאוד באיכות הקלט הגרעיני. פיצוץ גרעיני ופגיעה בקרום הגרעין החיצוני יגרמו לזיהום RNA ו-DNA סביבתי בניתוח, מה שיכניס רעש לנתונים. לתמצית גרעינית טהורה תהיה עדות מינימלית לגרעינים עטופים ברכיבים ציטופלזמיים (איור 2A) או לעיכול יתר, כפי...

Discussion

מבחינה היסטורית, שיטות הבידוד הגרעיני עבור ריצוף RNA ו-ATAC של גרעין יחיד השתמשו במאגרים המכילים דטרגנטים שאינם תואמים לספקטרומטריית מסות כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS), טכניקה נפוצה המשמשת לכימות מטבוליטים^16,17. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר שילוב של טכנ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 G rat brain cannula injector	Protech International	8IC315IS5SPC	For duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15-140-122	For RT media
FBS	Millipore/Sigma	F4135-500ML	For RT media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11-875-135	For RT media
Collagenase P	Sigma Aldrich	11213865001	For digestion of pancreas
Bovine Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001	For RT media and isolation
Dextrose	Fisher	D16-1	Final concentration will be 2.8 mM
Calcium Chloride	Fisher	C4901-500G	Final concentration will be 0.5 mM
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5	Research Products International	A30075100	Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	For handpicking islets
20x Nuclei Buffer	10X Genomics	2000153/2000207
Digitonin (5%)	Thermo Fisher Scientific	BN2006	Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)	Miltenyi Biotec	130-091-376
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	i8896	Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5	Sigma Aldrich	T2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma Aldrich	S6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma Aldrich	M1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335402001
DTT	Research Products International	D11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
Tween 20	Fisher Bioreagents	BP337-500	Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free Water	Promega	PR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)	Eppendorf	30108310
Cryovials (1.5 mL)	VWR	20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)	Denville	C-2177
Trypan Blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T-10282
Dual-Chamber Cell Counting Slides	Bio-Rad	1450011
MiiliQ Ultrapure Water System	Millipore/Sigma	7003/05/10/15
5 kDa cut-off filter	HMT Metabolome Technologies
Internal Standards	HMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes	Eppendorf	2231000602
Pipette Tips, 10 µL	VWR	76322-528
Pipette Tips, 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	21-236-2A
Pipette Tips, 20 µL	Genesee Scientific	23-404
Pipette Tips, 200 µL	USA Scientific	1120-8810
Phase Contrast Microscope	Olympus	BX41-PH-B
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman-Coulter	B06315
RNase-ZAP	Sigma Aldrich	R2020