Kombine Tek Çekirdekli RNA Dizileme ve ATAC-Dizileme ve Toplu Metabolomikler için Donmuş İnsan Olmayan Primat Fetal Adacıklarının Hazırlanması

Özet

Bu protokol, aynı numunelerden metabolomik analizler için toplu sitozolik fraksiyonu korurken, tek çekirdekli eşzamanlı RNA dizilimi ve ATAC dizilemede kullanılmak üzere donmuş insan olmayan primat pankreas adacıklarından yüksek kaliteli çekirdekleri izole etme prosedürlerini açıklar.

Özet

Birden fazla kohorttan toplanan dokuları kullanan çalışmalardaki bir zorluk, kombine tek hücreli RNA dizilimi ve metabolomik gibi büyük ölçekli multi-omik deneylere hazırlanırken toplu etkilerden kaçınmaktır. Bu çalışmadaki yöntem, tek çekirdekli RNA dizilimi ve ATAC dizileme deneylerine girdi için iki yıllık bir süre boyunca toplanan fetal insan olmayan primatlardan flaşla donmuş pankreas adacıklarını kullanır. Nükleer ekstraksiyon sırasında üretilen sitozolik fraksiyon, aşağı akış kılcal elektroforez-kütle spektrometresi ve müteakip metabolit miktar tayini için tutuldu. Bu yöntem, deneysel koşullar içinde değişen transkriptomik ve epigenomik manzaralara katkıda bulunan metabolitlerin toplu analizine izin verir. Birçok doku tipine uygulanabilir ve kolayca bulunamayan örneklerden çıkarılabilecek bilgi miktarını en üst düzeye çıkarır. Metabolizmanın epigenetik modifikasyonlar yoluyla hücresel kimliğin kurulmasına katkısı daha fazla takdir edildikçe, belirli hücre tiplerinde metabolitlerin katkısını tanımlamaya izin veren teknikler zamanında ve gereklidir.

Giriş

Langerhans'ın pankreas adacıkları, yaşam boyu glukoz toleransının yönetimi için kritik öneme sahiptir. Glikoz düşürücü hormon, insülin veya glikoz yükseltici hormon olan glukagon yoluyla kan şekeri seviyelerinin uygun şekilde ayarlanmaması, Diabetes Mellitus¹ ile sonuçlanır. Diyabet riskini en aza indirmek için değiştirilebilir risk faktörleri arasında egzersiz ve diyet yer alır. Ek olarak, hamilelik sırasında anne diyetinin de yetişkinlikte yavruların diyabete duyarlılığı üzerinde bir etkisi olduğu ortaya çıkmaktadır ^2,3. Bu nedenle, anne diye....

Protokol

Adacık alımı, Oregon Ulusal Primat Araştırma Merkezi (ONPRC) ve Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve ONPRC IACUC tarafından onaylandı. ONPRC, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA) tarafından uygulanan Hayvan Refahı Yasası ve Yönetmeliklerine ve İnsani Bakım ve Laboratuvar Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmeti Politikasına uyar. Buradaki protokol, 145. gebelik gününde (Rhesus makak gebeliği tipik olarak 173-175 gündür) nekropsi yapılan fetal Rhesus makaklarından elde edilen adacıklara uygulanmıştır. Bu çalışma için kul....

Tartışmalar

Tarihsel olarak, tek çekirdekli RNA ve ATAC dizilimi için nükleer izolasyon yöntemleri, metabolit miktar tayini için kullanılan yaygın bir teknik olan sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) ile uyumlu olmayan deterjanlar içeren tamponlar kullanmıştır^16,17. Mevcut protokol, hücresel fraksiyonlama için nazik bir deterjan kullanarak ve bu fraksiyonlamayı takiben kılcal elektroforez ile aynı numune hazırl?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 G rat brain cannula injector	Protech International	8IC315IS5SPC	For duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15-140-122	For RT media
FBS	Millipore/Sigma	F4135-500ML	For RT media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11-875-135	For RT media
Collagenase P	Sigma Aldrich	11213865001	For digestion of pancreas
Bovine Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001	For RT media and isolation
Dextrose	Fisher	D16-1	Final concentration will be 2.8 mM
Calcium Chloride	Fisher	C4901-500G	Final concentration will be 0.5 mM
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5	Research Products International	A30075100	Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	For handpicking islets
20x Nuclei Buffer	10X Genomics	2000153/2000207
Digitonin (5%)	Thermo Fisher Scientific	BN2006	Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)	Miltenyi Biotec	130-091-376
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	i8896	Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5	Sigma Aldrich	T2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma Aldrich	S6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma Aldrich	M1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335402001
DTT	Research Products International	D11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
Tween 20	Fisher Bioreagents	BP337-500	Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free Water	Promega	PR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)	Eppendorf	30108310
Cryovials (1.5 mL)	VWR	20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)	Denville	C-2177
Trypan Blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T-10282
Dual-Chamber Cell Counting Slides	Bio-Rad	1450011
MiiliQ Ultrapure Water System	Millipore/Sigma	7003/05/10/15
5 kDa cut-off filter	HMT Metabolome Technologies
Internal Standards	HMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes	Eppendorf	2231000602
Pipette Tips, 10 µL	VWR	76322-528
Pipette Tips, 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	21-236-2A
Pipette Tips, 20 µL	Genesee Scientific	23-404
Pipette Tips, 200 µL	USA Scientific	1120-8810
Phase Contrast Microscope	Olympus	BX41-PH-B
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman-Coulter	B06315
RNase-ZAP	Sigma Aldrich	R2020