Kombine Tek Çekirdekli RNA Dizileme ve ATAC-Dizileme ve Toplu Metabolomikler için Donmuş İnsan Olmayan Primat Fetal Adacıklarının Hazırlanması

Özet

Bu protokol, aynı numunelerden metabolomik analizler için toplu sitozolik fraksiyonu korurken, tek çekirdekli eşzamanlı RNA dizilimi ve ATAC dizilemede kullanılmak üzere donmuş insan olmayan primat pankreas adacıklarından yüksek kaliteli çekirdekleri izole etme prosedürlerini açıklar.

Özet

Birden fazla kohorttan toplanan dokuları kullanan çalışmalardaki bir zorluk, kombine tek hücreli RNA dizilimi ve metabolomik gibi büyük ölçekli multi-omik deneylere hazırlanırken toplu etkilerden kaçınmaktır. Bu çalışmadaki yöntem, tek çekirdekli RNA dizilimi ve ATAC dizileme deneylerine girdi için iki yıllık bir süre boyunca toplanan fetal insan olmayan primatlardan flaşla donmuş pankreas adacıklarını kullanır. Nükleer ekstraksiyon sırasında üretilen sitozolik fraksiyon, aşağı akış kılcal elektroforez-kütle spektrometresi ve müteakip metabolit miktar tayini için tutuldu. Bu yöntem, deneysel koşullar içinde değişen transkriptomik ve epigenomik manzaralara katkıda bulunan metabolitlerin toplu analizine izin verir. Birçok doku tipine uygulanabilir ve kolayca bulunamayan örneklerden çıkarılabilecek bilgi miktarını en üst düzeye çıkarır. Metabolizmanın epigenetik modifikasyonlar yoluyla hücresel kimliğin kurulmasına katkısı daha fazla takdir edildikçe, belirli hücre tiplerinde metabolitlerin katkısını tanımlamaya izin veren teknikler zamanında ve gereklidir.

Giriş

Langerhans'ın pankreas adacıkları, yaşam boyu glukoz toleransının yönetimi için kritik öneme sahiptir. Glikoz düşürücü hormon, insülin veya glikoz yükseltici hormon olan glukagon yoluyla kan şekeri seviyelerinin uygun şekilde ayarlanmaması, Diabetes Mellitus¹ ile sonuçlanır. Diyabet riskini en aza indirmek için değiştirilebilir risk faktörleri arasında egzersiz ve diyet yer alır. Ek olarak, hamilelik sırasında anne diyetinin de yetişkinlikte yavruların diyabete duyarlılığı üzerinde bir etkisi olduğu ortaya çıkmaktadır ^2,3. Bu nedenle, anne diyetinin ve hamilelik sırasında kullanılan ilaçlar gibi diğer maruziyetlerin, gelişim sırasında model organizmalarda insülin üreten beta hücreleri üzerindeki etkilerini analiz etmek için yöntemlere ihtiyaç vardır. Örneğin, fetal insan olmayan primat (NHP) yavrularından elde edilen adacıklar, gelişimsel maruziyetlerin etkileri açısından değerlendirilebilir. İnsanlara benzer şekilde, NHP'ler tipik olarak tekil doğumlara sahiptir ve Batı tarzı diyetle beslenmeye fizyolojik tepkilerinde farklılık gösterir⁴. NHP'lerin gebelik ve fetal gelişimi insanlarla birçok benzerliği paylaşırken, onları metabolik programlama çalışmaları için oldukça ilgili bir tür haline getirirken, NHP yavruları üzerinde karşılaştırmalı biyoinformatik tahliller yapmanın zorlukları arasında kısıtlı bir çiftleşme mevsimi ve aralıklı numune toplama yer alır. Bu nedenle, numune işleme ve analizinden önce uzun süreli depolamaya izin veren yaklaşımlar idealdir. Bu protokol, tek çekirdekli RNA dizilimi, ATAC dizilimi ve toplu sitoplazmik metabolomikler için numunelerin hazırlanmasını açıklar.

Adacık biyolojisi alanındaki diğer kişiler tarafından yapılan çalışmalar, tek hücreli RNA Dizilimi ve tek çekirdekli RNA dizilimi yoluyla hazırlanan örneklerde gözlemlenen genetik imzalarda örtüşme olduğunu göstermiştir ^5,6. Her iki yöntem de adacık popülasyonu içindeki çeşitli hücre tipleri arasında ayırt edici özelliklere katkıda bulunan transkriptlerin tanımlanmasına izin verir. Flaşla donmuş doku üzerinde nazik deterjanların kullanılmasıyla, sağlam çekirdekler aynı anda ATAC dizilimi için kullanılabilir, bu da erişilebilir kromatin bölgelerinin belirlenmesine izin verir. Tek çekirdekli RNA diziliminin ATAC dizilimi ile birleştirilmesi, gen düzenleyici ağların daha iyi karakterizasyonuna izin verir⁷.

Metabolomikler için numunelerin hazırlanması, geleneksel olarak sıvı kromatografisi için yüksek numune hacmi girişine duyulan ihtiyaç ile sınırlandırılmıştır. Ek olarak, kütle spektrometrik verilerde yanlış NMR piklerini önlemek için numune hazırlama sırasında kullanılan tamponlara dikkatli bir şekilde dikkat edilmelidir. Primat çalışmalarında elde edilmesi zor ve maliyetli olan düşük örnek sayısı göz önüne alındığında, farklı yavrulardan adacıkların transkriptomik ve metabolomik deneylere tahsisi zor olabilir. Bu nedenle, bu protokol, tek çekirdekli deneyler için hücresel fraksiyonlama sırasında üretilen normal olarak atılan sitozolik fraksiyonu kullanır. Bu yöntem, adacıklar içinde üretilen metabolitleri kantitatif olarak ölçerken, fetal adacıklardaki hücresel alt kümeleri tanımlayan transkriptlerin ve açık kromatin bölgelerinin eşzamanlı karakterizasyonuna izin verir (Şekil 1). Bu protokol, flaş donmuş embriyonik fare beyin dokusundan çekirdeklerin izolasyonu için 10x genomics tarafından yayınlanan gösterilmiş bir protokolden uyarlanmıştır (sürüm CG000366 Rev D⁸)⁷.

Protokol

Adacık alımı, Oregon Ulusal Primat Araştırma Merkezi (ONPRC) ve Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve ONPRC IACUC tarafından onaylandı. ONPRC, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA) tarafından uygulanan Hayvan Refahı Yasası ve Yönetmeliklerine ve İnsani Bakım ve Laboratuvar Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmeti Politikasına uyar. Buradaki protokol, 145. gebelik gününde (Rhesus makak gebeliği tipik olarak 173-175 gündür) nekropsi yapılan fetal Rhesus makaklarından elde edilen adacıklara uygulanmıştır. Bu çalışma için kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Adacık izolasyonu

1. Fetal pankreamayı çevre dokulardan⁹ kesin ve buz gibi soğuk fosfat tamponlu tuzlu su içine yerleştirin.
2. Pankreası PBS'den çıkarın ve 33 G kemirgen beyin kanülü enjektörü kullanarak pankreas kanalının kanülasyonu yoluyla kollajenaz P (0.6 mg / mL) ile şişirin.
3. Pankreası steril cerrahi makasla altı bölüme ayırın ve kollajenaz solüsyonunda 37 °C'de 27-30 dakika sindirin.
4. % 10 FBS ve 100 U / mL penisilin / streptomisin'i RPMI 1640'a birleştirerek RT ortamını hazırlayın.
5. Kollajenazı dökün ve 10 mL RT ortamı ekleyin.
6. Kalan bağ dokusunu bozmak için 1 dakika hafifçe çalkalayın.
7. Sindirilmemiş materyali 500 μm'lik bir filtreden süzerek çıkarın.
8. Adacıkları 50 mL RT ortamı ile iki kez yıkayın.
9. Adacıkları sığır DNaz I'de (0.8 U/mL) 37 °C'lik bir su banyosunda 10 dakika inkübe edin.
10. Adacıkları gece boyunca RT ortamında sığır DNaz I (0.4 U/mL) ile 37 ° C'de% 5 CO₂ ile kültürleyin.
11. Adacıkları, sıcaklık kontrollü jel paketleri ile ortam sıcaklığında özel ambalajlarda gönderin.

2. Uzun süreli depolama için örnek bankacılık

1. Ölçekli bir retikül kullanarak adacıkları boyut açısından değerlendirin ve hazırlıktaki asiner ve duktal doku derecesini not edin.
2. Otomatik bir pipet ile 5 mL 2,8 mM glikoz DMEM içeren 60 mm'lik bir tabağa adacıkları elle seçin.
   NOT: Son adacık hazırlığında depolanacak asiner doku ve duktal doku miktarını en aza indirmek zorunludur. Kullanım için ideal adacıkların detayları önceki bir protokol^9'da rapor edilmiştir.
3. Adacıkları 1.5 mL'lik bir tüpe toplayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca ~ 300 x g'da döndürün.
4. Adacıkları kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1x PBS'de yeniden askıya aldı.
5. 4 ° C'de ~ 300 x g'de 5 dakika döndürün. Süpernatanı atın.
6. 2.3-2.5 adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
7. Flaş adacıkları 1.5 mL'lik bir tüpte 10 saniye boyunca sıvı nitrojen içinde dondurun.
8. Peletleri nükleer izolasyon gününe kadar -80 °C'de saklayın.

3. Çekirdek ve sitoplazmik fraksiyonun izolasyonu için hücresel fraksiyonlama

1. Çekirdek ekstraksiyonu için tamponların hazırlanması (Tablo 1).
   1. Tezgahın, pipetlerin ve reaktiflerin RNaz içermediğinden emin olun.
   2. Yıkama, konsantre lizis, lizis seyreltme ve seyreltilmiş çekirdek tamponlarını Tablo 1'e göre hazırlayın.
   3. Konsantre lizis tamponunu seyreltmek için lizis seyreltme tamponunu kullanarak 5 mL'lik bir tüpte 0.1x lizis tamponu hazırlayın.
2. Doku homojenizasyonu
   1. Numuneleri -80 °C dondurucudan çıkarın ve hemen buzun üzerine koyun.
   2. Doku peletlerine 500 μL 0.1x lizis tamponu ekleyin ve buz üzerinde 3 dakika inkübe edin.
   3. Tek kullanımlık RNaz içermeyen bir pelet tokmağı kullanarak, dokuyu buz üzerinde 15 kez nazikçe homojenize edin.
   4. Numuneleri buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
   5. Homojenata 500 μL yıkama tamponu ekleyin ve buz üzerine nazikçe pipetleyin.
   6. 5 mL'lik bir tüp üzerine filtreye 300 mL yıkama tamponu ekleyerek 30 μm'lik bir ön ayırma filtresini astarlayın.
   7. 30 μM ön ayırma filtresini kullanarak 1 mL hücresel homojenatı 5 mL'lik tüpe süzün.
   8. Filtrelenmiş homojenatı 500 x g'da 5 dakika boyunca sallanan bir kova santrifüjünde 4 °C'de döndürün.
3. Metabolomikler için süpernatantın toplanması ve depolanması
   1. Bir pipet ile adım 3.2.8'den 1 mL süpernatanı çıkarın ve buz üzerinde 1.5 mL'lik bir kriyoviyal ekleyin.
   2. Süpernatanı hemen -80 °C'de dondurun. Bu süpernatant metabolomikler için kullanılacaktır.
4. Tek çekirdekli RNA ve ATAC dizilimi için çekirdeklerin hazırlanması
   1. Peletin üzerine damla damla 1 mL yıkama tamponu ekleyerek çekirdek peletini nazikçe yeniden süspanse edin. Yavaşça 5 kez pipetleyin.
   2. Yıkanmış peleti 1000 °C'de sallanan bir kova santrifüjünde 5 dakika boyunca 4 x g'da döndürün.
   3. 3.4.1 ve 3.4.2 adımlarını bir kez daha tekrarlayın.
   4. Son yıkamadan sonra, çekirdekleri 1 mL yıkama tamponunda tekrar süspanse edin. Nükleer hazırlığı buz üzerinde tutun.
   5. 10 μL çekirdek süspansiyonunu bir pipetle aspire edin ve hafifçe pipetleyerek 10 μL %0,4 Tripan mavisi ile karıştırın.
   6. 10 μL çekirdek ve Tripan mavisi karışımını bir pipet ile otomatik bir hücre sayacına kaydırın ve cihaza yerleştirin.
   7. Çekirdek/μL'deki çekirdek konsantrasyonunu belirleyin.
      NOT: Tek hücreli RNA dizilimi için hücresel preparatların aksine, otomatik hücre sayaçları çekirdekleri ölü hücreler olarak algılayacaktır. Bu hazırlığın %95'inden fazlası otomatik hücre sayaçlarında canlı olmamalıdır. Nükleer popülasyonun %5'inden fazlası canlıysa, çekirdek süspansiyonu 30 μm ön ayırma filtresinden ek bir süre süzülebilir ve 4 °C'de 1000 x g'da 5 dakika döndürülebilir. Çekirdek konsantrasyonu daha sonra adım 3.4.6'da belirtildiği gibi yeniden hesaplanabilir.
   8. İstenen hedeflenen çekirdek geri kazanımına bağlı olarak, 1x çekirdek tamponu kullanarak çekirdekleri gerekli konsantrasyona yeniden süspanse edin ve tek çekirdekli RNA ve ATAC dizileme kitaplığı hazırlığına^{devam edin 10}.

4. Kapiler elektroforez-kütle spektrometresi (CE-MS) için sitozolik fraksiyonun hazırlanması

1. Adım 3.3.1'de toplanan 80 μL sitozolik fraksiyonu, içselleştirilmiş standartlar içeren 20 μL nano saf su ile birleştirin.
2. CE-MS ile devam edin ve daha önce açıklandığı gibi^{analiz yapın 11,12,13}.

Sonuçlar

Sıralama çıktılarının kalitesi büyük ölçüde nükleer girdinin kalitesine bağlıdır. Nükleer kanama ve dış nükleer zarın hasar görmesi, analizde ortam RNA ve DNA kontaminasyonuna neden olacak ve bu da verilerde gürültüye neden olacaktır. Saf bir nükleer ekstrakt, sitoplazmik bileşenlerle kapsüllenmiş çekirdekler (Şekil 2A) veya patlayan çekirdeklerle kanıtlanan aşırı sindirim (Şekil 2B) hakkınd...

Tartışmalar

Tarihsel olarak, tek çekirdekli RNA ve ATAC dizilimi için nükleer izolasyon yöntemleri, metabolit miktar tayini için kullanılan yaygın bir teknik olan sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) ile uyumlu olmayan deterjanlar içeren tamponlar kullanmıştır^16,17. Mevcut protokol, hücresel fraksiyonlama için nazik bir deterjan kullanarak ve bu fraksiyonlamayı takiben kılcal elektroforez ile aynı numune hazırl?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 G rat brain cannula injector	Protech International	8IC315IS5SPC	For duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15-140-122	For RT media
FBS	Millipore/Sigma	F4135-500ML	For RT media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11-875-135	For RT media
Collagenase P	Sigma Aldrich	11213865001	For digestion of pancreas
Bovine Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001	For RT media and isolation
Dextrose	Fisher	D16-1	Final concentration will be 2.8 mM
Calcium Chloride	Fisher	C4901-500G	Final concentration will be 0.5 mM
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5	Research Products International	A30075100	Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	For handpicking islets
20x Nuclei Buffer	10X Genomics	2000153/2000207
Digitonin (5%)	Thermo Fisher Scientific	BN2006	Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)	Miltenyi Biotec	130-091-376
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	i8896	Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5	Sigma Aldrich	T2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma Aldrich	S6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma Aldrich	M1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335402001
DTT	Research Products International	D11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
Tween 20	Fisher Bioreagents	BP337-500	Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free Water	Promega	PR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)	Eppendorf	30108310
Cryovials (1.5 mL)	VWR	20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)	Denville	C-2177
Trypan Blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T-10282
Dual-Chamber Cell Counting Slides	Bio-Rad	1450011
MiiliQ Ultrapure Water System	Millipore/Sigma	7003/05/10/15
5 kDa cut-off filter	HMT Metabolome Technologies
Internal Standards	HMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes	Eppendorf	2231000602
Pipette Tips, 10 µL	VWR	76322-528
Pipette Tips, 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	21-236-2A
Pipette Tips, 20 µL	Genesee Scientific	23-404
Pipette Tips, 200 µL	USA Scientific	1120-8810
Phase Contrast Microscope	Olympus	BX41-PH-B
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman-Coulter	B06315
RNase-ZAP	Sigma Aldrich	R2020