Получение замороженных островков плода плода примата для комбинированного одноядерного РНК-секвенирования и ATAC-секвенирования, а также объемной метаболомики

Резюме

В этом протоколе описаны процедуры выделения высококачественных ядер из замороженных островков поджелудочной железы приматов, не являющихся человеком, для использования в одновременном секвенировании одноядерных РНК и секвенировании ATAC с сохранением объемной цитозольной фракции для метаболомных анализов из тех же образцов.

Аннотация

Одной из проблем в исследованиях с использованием тканей, собранных из нескольких когорт, является избежание пакетных эффектов при подготовке к крупномасштабным мультиомным экспериментам, таким как комбинированное секвенирование РНК одиночных клеток и метаболомика. Метод в данном исследовании использует мгновенно замороженные островки поджелудочной железы от плода нечеловекообразных приматов, собранные в течение двух лет для ввода в секвенирование одноядерной РНК и анализы секвенирования ATAC. Цитозольная фракция, полученная в процессе экстракции ядра, сохранялась для последующей капиллярной электрофорезной масс-спектрометрии и последующего количественного определения метаболитов. Этот метод позволяет проводить объемный анализ метаболитов, которые способствуют изменению транскриптомных и эпигеномных ландшафтов в экспериментальных условиях. Он применим ко многим типам тканей и максимизирует объем информации, которую можно извлечь из образцов, которые не всегда доступны. По мере того, как вклад метаболизма в установление клеточной идентичности посредством эпигенетических модификаций становится все более ценным, методы, позволяющие определить вклад метаболитов в конкретных типах клеток, являются своевременными и необходимыми.

Введение

Островки поджелудочной железы Лангерганса имеют решающее значение для управления толерантностью к глюкозе на протяжении всей жизни. Неспособность правильно настроить уровень глюкозы в крови с помощью сахароснижающего гормона инсулина или глюкозоповышающего гормона глюкагона приводит к сахарному диабету¹. К модифицируемым факторам риска для минимизации риска развития диабета относятся физические упражнения и диета. Кроме того, становится очевидным, что питание матери во время беременности также оказывает влияние на восприимчивость потомства к сахарному диабету во взрослом^{возрасте2,3}. Таким образом, необходимы методы для анализа влияния материнской диеты и других воздействий, таких как лекарства, используемые во время беременности, на инсулин-продуцирующие бета-клетки в модельных организмах во время развития. Например, островки плода нечеловекообразного потомства приматов (NHP) могут быть оценены на предмет воздействия на процесс развития. Как и у людей, у НЧП обычно рождаются одноплодные дети, и они различаются по своей физиологической реакции^{на диетическое} питание в западном стиле. В то время как беременность и внутриутробное развитие NHP имеют много общего с людьми, что делает их очень важным видом для исследований метаболического программирования, трудности с проведением сравнительных биоинформационных анализов на потомстве NHP включают ограниченный брачный сезон и прерывистый сбор образцов. Поэтому идеально подходят подходы, которые обеспечивают долгосрочное хранение до обработки и анализа пробы. Этот протокол описывает подготовку образцов для одноядерного секвенирования РНК, секвенирования ATAC и объемной цитоплазматической метаболомики.

Исследования, проведенные другими специалистами в области биологии островков, продемонстрировали перекрытие генетических сигнатур, наблюдаемых в образцах, полученных с помощью секвенирования РНК одной клетки и секвенирования одноядерной РНК ^5,6. Оба метода позволяют идентифицировать транскрипты, которые способствуют различительным признакам среди различных типов клеток в популяции островков. Благодаря использованию щадящих детергентов на мгновенно замороженных тканях, неповрежденные ядра могут быть одновременно использованы для секвенирования ATAC, что позволяет определить доступные участки хроматина. Сочетание одноядерного секвенирования РНК с секвенированием ATAC позволяет лучше охарактеризовать генные регуляторные сети⁷.

Подготовка образцов для метаболомики традиционно была ограничена необходимостью ввода большого объема образца для жидкостной хроматографии. Кроме того, необходимо тщательно учитывать буферы, используемые во время пробоподготовки, чтобы избежать ложных пиков ЯМР в масс-спектрометрических данных. Учитывая небольшое количество образцов, которые сложно и дорого получить в исследованиях на приматах, распределение островков от разных потомков в транскриптомных и метаболомных экспериментах может быть затруднено. Таким образом, этот протокол использует обычно отбрасываемую цитозольную фракцию, полученную во время клеточного фракционирования, для экспериментов с одним ядром. Этот метод позволяет одновременно характеризовать транскрипты и открытые участки хроматина, которые определяют клеточные подмножества в островках плода, при этом количественно измеряя метаболиты, продуцируемые в островках (рис. 1). Этот протокол является адаптацией продемонстрированного протокола, опубликованного компанией 10x genomics для выделения ядер из мгновенно замороженной эмбриональной ткани мозга мыши (версия CG000366 Rev^{D 8})⁷.

протокол

Извлечение островков проводилось в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Орегонского национального исследовательского центра приматов (ONPRC) и Орегонского университета здоровья и науки и было одобрено IACUC ONPRC. ONPRC соблюдает Закон о защите животных и нормативные акты, введенные в действие Министерством сельского хозяйства США (USDA), а также Политику Службы общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных работ. Описанный здесь протокол применяли к островкам от плода макак-резус, которые были вскрыты на 145-й день беременности (беременность макак-резусов обычно составляет 173-175 дней). Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном для этого исследования, приведена в Таблице материалов.

1. Изоляция островков

1. Вырежьте поджелудочную железу плода из окружающих тканей⁹ и поместите ее в ледяной раствор, буферизованный фосфатами.
2. Удалите поджелудочную железу из PBS и надуйте ее коллагеназой P (0,6 мг/мл) путем канюляции протока поджелудочной железы с помощью инъектора канюли для мозга грызунов 33 G.
3. Стерильными хирургическими ножницами разделить поджелудочную железу на шесть отделов и выварить в течение 27-30 мин при температуре 37 °С в растворе коллагеназы.
4. Приготовьте RT-среды, объединив 10% FBS и 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина в RPMI 1640.
5. Слейте коллагеназу и добавьте 10 мл RT среды.
6. Аккуратно встряхивайте в течение 1 минуты, чтобы нарушить оставшуюся соединительную ткань.
7. Удалите непереваренный материал, процедив через фильтр 500 мкм.
8. Дважды промойте островки 50 мл RT-среды.
9. Инкубировать островки в ДНКазе крупного рогатого скота I (0,8 Ед/мл) на водяной бане при температуре 37 °C в течение 10 минут.
10. Культивировать островки в течение ночи в RT-средах с ДНКазой крупного рогатого скота I (0,4 Ед/мл) при 37 °C с 5%_CO2.
11. Отгружайте островки в специализированной упаковке при температуре окружающей среды с гелевыми пакетами с контролем температуры.

2. Выборка банков для долгосрочного хранения

1. Оцените островки по размеру с помощью шкалированной сетки и обратите внимание на степень подготовки ацинарной и протоковой ткани.
2. Вручную отбирайте островки с помощью автоматической пипетки в чашку диаметром 60 мм, содержащую 5 мл глюкозы DMEM с концентрацией 2,8 мМ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно свести к минимуму количество ацинарной ткани и ткани протоков, которые будут храниться в окончательном препарате островков. Подробная информация об идеальных островках для использования приведена в одном из предыдущих протоколов⁹.
3. Соберите островки в пробирку объемом 1,5 мл и вращайте при ~300 x g в течение 5 минут при 4 °C.
4. Ресуспендирование островков в 1x PBS, не содержащем кальция и магния.
5. Отжим в течение 5 минут при температуре ~300 x g при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
6. Повторите шаги 2,3-2,5 еще два раза.
7. Мгновенно заморозьте островки в пробирке объемом 1,5 мл на 10 с в жидком азоте.
8. Хранить гранулу при температуре -80 °C до дня ядерной изоляции.

3. Клеточное фракционирование для выделения ядер и цитоплазматической фракции

1. Приготовление буферов для экстракции ядер (табл. 1).
   1. Убедитесь, что настольная машина, пипетки и реагенты не содержат РНКазы.
   2. Приготовьте промывку, концентрированный лизис, разведение лизиса и разведенные ядра буферы в соответствии с таблицей 1.
   3. Приготовьте 0,1-кратный буфер для лизиса в пробирке объемом 5 мл, используя буфер для разведения лизиса, чтобы разбавить концентрированный буфер для лизиса.
2. Гомогенизация тканей
   1. Достаньте образцы из морозильной камеры при температуре -80 °C и сразу же положите их на лед.
   2. Добавьте 500 мкл 0,1-кратного лизисного буфера в тканевые гранулы и инкубируйте в течение 3 минут на льду.
   3. Используя одноразовый пестик для гранул без РНКазы, аккуратно гомогенизируйте ткань 15 раз на льду.
   4. Инкубируйте образцы на льду в течение 10 минут.
   5. Добавьте в гомогенат 500 μл промывочного буфера и аккуратно нанесите пипеткой на лед.
   6. Загрунтуйте фильтр предварительной сепарации длиной 30 мкм, добавив в фильтр 300 мл промывочного буфера через пробирку объемом 5 мл.
   7. Отфильтруйте клеточный гомогенат объемом 1 мл с помощью фильтра предварительной сепарации 30 мкМ в пробирку объемом 5 мл.
   8. Отвертите отфильтрованный гомогенат при давлении 500 x g в течение 5 минут в центрифуге с качающимся ведром при температуре 4 °C.
3. Сбор и хранение надосадочной жидкости для метаболомики
   1. Удалите 1 мл надосадочной жидкости с шага 3.2.8 с помощью пипетки и добавьте в 1,5 мл криоциала на льду.
   2. Немедленно заморозьте надосадочную жидкость при температуре -80 °С. Эта надосадочная жидкость будет использоваться для метаболомики.
4. Подготовка ядер для одноядерного РНК- и ATAC-секвенирования
   1. Осторожно суспендируйте гранулы ядер, добавив по каплям 1 мл промывочного буфера. Медленно пипетируйте 5 раз.
   2. Промытую гранулу отжимаем при 1000 х г в течение 5 минут в центрифуге с качающимся ведром при температуре 4 °C.
   3. Повторите шаги 3.4.1 и 3.4.2 еще раз.
   4. После окончательной промывки ресуспендируйте ядра в 1 мл промывочного буфера. Держите ядерную подготовку на льду.
   5. Отсадите 10 мкл ядра суспензии с помощью пипетки и смешайте с 10 мкл 0,4% трипанового синего путем аккуратного пипетирования.
   6. Добавьте 10 μЛ ядер и трипановую синюю смесь в автоматический счетчик клеток с помощью пипетки и поместите его в прибор.
   7. Определение концентрации ядер в ядрах/мкл.
      Примечание: В отличие от клеточных препаратов для секвенирования РНК одиночных клеток, автоматические клеточные счетчики обнаруживают ядра как мертвые клетки. Не более 95% этого препарата должно находиться в реальном времени на автоматизированных счетчиках клеток. Если более 5% ядерной популяции является живым, ядра суспензии могут быть дополнительно отфильтрованы через фильтр предварительного разделения 30 мкм и вращаться в течение 5 мин при 1000 x g при 4 °C. Затем концентрацию ядер можно пересчитать, как описано в шаге 3.4.6.
   8. Исходя из желаемого целевого восстановления ядер, ресуспендировать ядра до необходимой концентрации с использованием 1x ядерного буфера и приступить к подготовке одноядерной РНК и библиотеки секвенирования ATAC¹⁰.

4. Получение цитозольной фракции для капиллярного электрофореза - масс-спектрометрия (КЭ-МС)

1. Соедините 80 мкл цитозольной фракции, собранной на этапе 3.3.1, с 20 мкл наночистой воды, содержащей интернализованные стандарты.
2. Продолжайте работу с CE-MS и анализ, как описано ранее 11,12,13.

Результаты

Качество выходных данных секвенирования в значительной степени зависит от качества поступающих ядерных материалов. Ядерный глеббинг и повреждение внешней ядерной мембраны приведут к загрязнению окружающей среды РНК и ДНК в анализе, что приведет к появлению шума в д...

Обсуждение

Исторически сложилось так, что в методах выделения ядер для одноядерного секвенирования РНК и ATAC использовались буферы, содержащие детергенты, несовместимые с жидкостной хромато-масс-спектрометрией (LC-MS), распространенным методом, используемым для количественного о...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 G rat brain cannula injector	Protech International	8IC315IS5SPC	For duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15-140-122	For RT media
FBS	Millipore/Sigma	F4135-500ML	For RT media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11-875-135	For RT media
Collagenase P	Sigma Aldrich	11213865001	For digestion of pancreas
Bovine Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001	For RT media and isolation
Dextrose	Fisher	D16-1	Final concentration will be 2.8 mM
Calcium Chloride	Fisher	C4901-500G	Final concentration will be 0.5 mM
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5	Research Products International	A30075100	Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	For handpicking islets
20x Nuclei Buffer	10X Genomics	2000153/2000207
Digitonin (5%)	Thermo Fisher Scientific	BN2006	Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)	Miltenyi Biotec	130-091-376
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	i8896	Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5	Sigma Aldrich	T2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma Aldrich	S6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma Aldrich	M1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335402001
DTT	Research Products International	D11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
Tween 20	Fisher Bioreagents	BP337-500	Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free Water	Promega	PR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)	Eppendorf	30108310
Cryovials (1.5 mL)	VWR	20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)	Denville	C-2177
Trypan Blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T-10282
Dual-Chamber Cell Counting Slides	Bio-Rad	1450011
MiiliQ Ultrapure Water System	Millipore/Sigma	7003/05/10/15
5 kDa cut-off filter	HMT Metabolome Technologies
Internal Standards	HMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes	Eppendorf	2231000602
Pipette Tips, 10 µL	VWR	76322-528
Pipette Tips, 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	21-236-2A
Pipette Tips, 20 µL	Genesee Scientific	23-404
Pipette Tips, 200 µL	USA Scientific	1120-8810
Phase Contrast Microscope	Olympus	BX41-PH-B
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman-Coulter	B06315
RNase-ZAP	Sigma Aldrich	R2020