Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе описаны процедуры выделения высококачественных ядер из замороженных островков поджелудочной железы приматов, не являющихся человеком, для использования в одновременном секвенировании одноядерных РНК и секвенировании ATAC с сохранением объемной цитозольной фракции для метаболомных анализов из тех же образцов.

Аннотация

Одной из проблем в исследованиях с использованием тканей, собранных из нескольких когорт, является избежание пакетных эффектов при подготовке к крупномасштабным мультиомным экспериментам, таким как комбинированное секвенирование РНК одиночных клеток и метаболомика. Метод в данном исследовании использует мгновенно замороженные островки поджелудочной железы от плода нечеловекообразных приматов, собранные в течение двух лет для ввода в секвенирование одноядерной РНК и анализы секвенирования ATAC. Цитозольная фракция, полученная в процессе экстракции ядра, сохранялась для последующей капиллярной электрофорезной масс-спектрометрии и последующего количественного определения метаболитов. Этот метод позволяет проводить объемный анализ метаболитов, которые способствуют изменению транскриптомных и эпигеномных ландшафтов в экспериментальных условиях. Он применим ко многим типам тканей и максимизирует объем информации, которую можно извлечь из образцов, которые не всегда доступны. По мере того, как вклад метаболизма в установление клеточной идентичности посредством эпигенетических модификаций становится все более ценным, методы, позволяющие определить вклад метаболитов в конкретных типах клеток, являются своевременными и необходимыми.

Введение

Островки поджелудочной железы Лангерганса имеют решающее значение для управления толерантностью к глюкозе на протяжении всей жизни. Неспособность правильно настроить уровень глюкозы в крови с помощью сахароснижающего гормона инсулина или глюкозоповышающего гормона глюкагона приводит к сахарному диабету1. К модифицируемым факторам риска для минимизации риска развития диабета относятся физические упражнения и диета. Кроме того, становится очевидным, что питание матери во время беременности также оказывает влияние на восприимчивость потомства к сахарному диабету во взросломвозрасте2,3

протокол

Извлечение островков проводилось в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Орегонского национального исследовательского центра приматов (ONPRC) и Орегонского университета здоровья и науки и было одобрено IACUC ONPRC. ONPRC соблюдает Закон о защите животных и нормативные акты, введенные в действие Министерством сельского хозяйства США (USDA), а также Политику Службы общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных работ. Описанный здесь протокол применяли к островкам от плода макак-резус, которые были вскрыты на 145-й день беременности (бере....

Результаты

Качество выходных данных секвенирования в значительной степени зависит от качества поступающих ядерных материалов. Ядерный глеббинг и повреждение внешней ядерной мембраны приведут к загрязнению окружающей среды РНК и ДНК в анализе, что приведет к появлению шума в д.......

Обсуждение

Исторически сложилось так, что в методах выделения ядер для одноядерного секвенирования РНК и ATAC использовались буферы, содержащие детергенты, несовместимые с жидкостной хромато-масс-спектрометрией (LC-MS), распространенным методом, используемым для количественного о.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить всю команду из Орегонского университета медицинских наук за заботу о колонии приматов и за приобретение тканей. Кроме того, компания Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics предоставила техническую экспертизу и рекомендации по планированию экспериментов. DTC был поддержан стипендией F31 для подготовки докторантуры от NIH/NIDK (1F31DK135164). PK был поддержан NIH/NIDDK (1R01DK128187). MG была поддержана премией VA Merit Award (I01 BX005399), NIH/NIDDK (1R01DK135032, 1R01DK128187) и JDRF (2-SRA-2024-1455-S-B). Работа в Орегонском национальном центре исследования приматов (ONPRC) осуществлялась при по....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
33 G rat brain cannula injectorProtech International8IC315IS5SPCFor duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/StreptomycinFisher15-140-122For RT media
FBSMillipore/SigmaF4135-500MLFor RT media
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11-875-135For RT media
Collagenase PSigma Aldrich11213865001For digestion of pancreas
Bovine Dnase ISigma Aldrich11284932001For RT media and isolation
DextroseFisherD16-1Final concentration will be 2.8 mM
Calcium ChlorideFisherC4901-500GFinal concentration will be 0.5 mM
HEPESGibco15630-080Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5Research Products InternationalA30075100Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11966025For handpicking islets
20x Nuclei Buffer10X Genomics2000153/2000207
Digitonin (5%)Thermo Fisher ScientificBN2006Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)Miltenyi Biotec130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)Miltenyi Biotec130-091-376
IGEPAL CA-630Sigma Aldrichi8896Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5Sigma AldrichT2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 MSigma AldrichS6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 MSigma AldrichM1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitorSigma Aldrich3335402001
DTTResearch Products InternationalD11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet PestlesFisher Scientific12-141-368
Tween 20Fisher BioreagentsBP337-500Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free WaterPromegaPR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)Eppendorf30108310
Cryovials (1.5 mL)VWR20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)DenvilleC-2177
Trypan Blue (0.4%)Thermo Fisher ScientificT-10282
Dual-Chamber Cell Counting SlidesBio-Rad1450011
MiiliQ Ultrapure Water SystemMillipore/Sigma7003/05/10/15
5 kDa cut-off filterHMT Metabolome Technologies
Internal StandardsHMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 PipettesEppendorf2231000602
Pipette Tips, 10 µLVWR76322-528
Pipette Tips, 1000 µLThermo Fisher Scientific21-236-2A
Pipette Tips, 20 µLGenesee Scientific23-404
Pipette Tips, 200 µLUSA Scientific1120-8810
Phase Contrast MicroscopeOlympusBX41-PH-B
Countess II Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
DPBS (1x) Gibco14190-144
Allegra X-30R CentrifugeBeckman-CoulterB06315
RNase-ZAPSigma AldrichR2020

Ссылки

  1. Christensen, A. A., Gannon, M. The beta cell in type 2 diabetes. Curr Diab Rep. 19 (9), 81 (2019).
  2. Elsakr, J. M., Gannon, M. Developmental programming of the pancreatic islet by. Trends Dev Biol. 10, 79-95 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены