Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
В этом протоколе описаны процедуры выделения высококачественных ядер из замороженных островков поджелудочной железы приматов, не являющихся человеком, для использования в одновременном секвенировании одноядерных РНК и секвенировании ATAC с сохранением объемной цитозольной фракции для метаболомных анализов из тех же образцов.
Одной из проблем в исследованиях с использованием тканей, собранных из нескольких когорт, является избежание пакетных эффектов при подготовке к крупномасштабным мультиомным экспериментам, таким как комбинированное секвенирование РНК одиночных клеток и метаболомика. Метод в данном исследовании использует мгновенно замороженные островки поджелудочной железы от плода нечеловекообразных приматов, собранные в течение двух лет для ввода в секвенирование одноядерной РНК и анализы секвенирования ATAC. Цитозольная фракция, полученная в процессе экстракции ядра, сохранялась для последующей капиллярной электрофорезной масс-спектрометрии и последующего количественного определения метаболитов. Этот метод позволяет проводить объемный анализ метаболитов, которые способствуют изменению транскриптомных и эпигеномных ландшафтов в экспериментальных условиях. Он применим ко многим типам тканей и максимизирует объем информации, которую можно извлечь из образцов, которые не всегда доступны. По мере того, как вклад метаболизма в установление клеточной идентичности посредством эпигенетических модификаций становится все более ценным, методы, позволяющие определить вклад метаболитов в конкретных типах клеток, являются своевременными и необходимыми.
Островки поджелудочной железы Лангерганса имеют решающее значение для управления толерантностью к глюкозе на протяжении всей жизни. Неспособность правильно настроить уровень глюкозы в крови с помощью сахароснижающего гормона инсулина или глюкозоповышающего гормона глюкагона приводит к сахарному диабету1. К модифицируемым факторам риска для минимизации риска развития диабета относятся физические упражнения и диета. Кроме того, становится очевидным, что питание матери во время беременности также оказывает влияние на восприимчивость потомства к сахарному диабету во взросломвозрасте2,3
Извлечение островков проводилось в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Орегонского национального исследовательского центра приматов (ONPRC) и Орегонского университета здоровья и науки и было одобрено IACUC ONPRC. ONPRC соблюдает Закон о защите животных и нормативные акты, введенные в действие Министерством сельского хозяйства США (USDA), а также Политику Службы общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных работ. Описанный здесь протокол применяли к островкам от плода макак-резус, которые были вскрыты на 145-й день беременности (бере....
Качество выходных данных секвенирования в значительной степени зависит от качества поступающих ядерных материалов. Ядерный глеббинг и повреждение внешней ядерной мембраны приведут к загрязнению окружающей среды РНК и ДНК в анализе, что приведет к появлению шума в д.......
Исторически сложилось так, что в методах выделения ядер для одноядерного секвенирования РНК и ATAC использовались буферы, содержащие детергенты, несовместимые с жидкостной хромато-масс-спектрометрией (LC-MS), распространенным методом, используемым для количественного о.......
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Авторы хотели бы поблагодарить всю команду из Орегонского университета медицинских наук за заботу о колонии приматов и за приобретение тканей. Кроме того, компания Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics предоставила техническую экспертизу и рекомендации по планированию экспериментов. DTC был поддержан стипендией F31 для подготовки докторантуры от NIH/NIDK (1F31DK135164). PK был поддержан NIH/NIDDK (1R01DK128187). MG была поддержана премией VA Merit Award (I01 BX005399), NIH/NIDDK (1R01DK135032, 1R01DK128187) и JDRF (2-SRA-2024-1455-S-B). Работа в Орегонском национальном центре исследования приматов (ONPRC) осуществлялась при по....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
33 G rat brain cannula injector | Protech International | 8IC315IS5SPC | For duct cannulation and pancreas inflation |
Penicillin/Streptomycin | Fisher | 15-140-122 | For RT media |
FBS | Millipore/Sigma | F4135-500ML | For RT media |
RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11-875-135 | For RT media |
Collagenase P | Sigma Aldrich | 11213865001 | For digestion of pancreas |
Bovine Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | For RT media and isolation |
Dextrose | Fisher | D16-1 | Final concentration will be 2.8 mM |
Calcium Chloride | Fisher | C4901-500G | Final concentration will be 0.5 mM |
HEPES | Gibco | 15630-080 | Final concentration will be 10 mM |
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5 | Research Products International | A30075100 | Final concentration will be 0.5 mg/mL |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | For handpicking islets |
20x Nuclei Buffer | 10X Genomics | 2000153/2000207 | |
Digitonin (5%) | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate |
MACS SmartStrainers (30 µM) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
MACS BSA Stock Solution (10%) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | i8896 | Prepare a 10% stock using MilliQ water |
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5 | Sigma Aldrich | T2319-1L | |
Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma Aldrich | S6546-1L | |
Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma Aldrich | M1028-100mL | |
Sigma Protector Rnase inhibitor | Sigma Aldrich | 3335402001 | |
DTT | Research Products International | D11000-5.0 | |
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
Tween 20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | Prepare a 20% stock using MilliQ water |
Nuclease-Free Water | Promega | PR-P1193 | |
DNA LoBind Tubes (5 mL) | Eppendorf | 30108310 | |
Cryovials (1.5 mL) | VWR | 20170-225 | |
Posi-Click Tubes (0.6 mL) | Denville | C-2177 | |
Trypan Blue (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T-10282 | |
Dual-Chamber Cell Counting Slides | Bio-Rad | 1450011 | |
MiiliQ Ultrapure Water System | Millipore/Sigma | 7003/05/10/15 | |
5 kDa cut-off filter | HMT Metabolome Technologies | ||
Internal Standards | HMT Metabolome Technologies | ||
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
Pipette Tips, 10 µL | VWR | 76322-528 | |
Pipette Tips, 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 21-236-2A | |
Pipette Tips, 20 µL | Genesee Scientific | 23-404 | |
Pipette Tips, 200 µL | USA Scientific | 1120-8810 | |
Phase Contrast Microscope | Olympus | BX41-PH-B | |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
Allegra X-30R Centrifuge | Beckman-Coulter | B06315 | |
RNase-ZAP | Sigma Aldrich | R2020 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены