Получение замороженных островков плода плода примата для комбинированного одноядерного РНК-секвенирования и ATAC-секвенирования, а также объемной метаболомики

Резюме

В этом протоколе описаны процедуры выделения высококачественных ядер из замороженных островков поджелудочной железы приматов, не являющихся человеком, для использования в одновременном секвенировании одноядерных РНК и секвенировании ATAC с сохранением объемной цитозольной фракции для метаболомных анализов из тех же образцов.

Аннотация

Одной из проблем в исследованиях с использованием тканей, собранных из нескольких когорт, является избежание пакетных эффектов при подготовке к крупномасштабным мультиомным экспериментам, таким как комбинированное секвенирование РНК одиночных клеток и метаболомика. Метод в данном исследовании использует мгновенно замороженные островки поджелудочной железы от плода нечеловекообразных приматов, собранные в течение двух лет для ввода в секвенирование одноядерной РНК и анализы секвенирования ATAC. Цитозольная фракция, полученная в процессе экстракции ядра, сохранялась для последующей капиллярной электрофорезной масс-спектрометрии и последующего количественного определения метаболитов. Этот метод позволяет проводить объемный анализ метаболитов, которые способствуют изменению транскриптомных и эпигеномных ландшафтов в экспериментальных условиях. Он применим ко многим типам тканей и максимизирует объем информации, которую можно извлечь из образцов, которые не всегда доступны. По мере того, как вклад метаболизма в установление клеточной идентичности посредством эпигенетических модификаций становится все более ценным, методы, позволяющие определить вклад метаболитов в конкретных типах клеток, являются своевременными и необходимыми.

Введение

Островки поджелудочной железы Лангерганса имеют решающее значение для управления толерантностью к глюкозе на протяжении всей жизни. Неспособность правильно настроить уровень глюкозы в крови с помощью сахароснижающего гормона инсулина или глюкозоповышающего гормона глюкагона приводит к сахарному диабету¹. К модифицируемым факторам риска для минимизации риска развития диабета относятся физические упражнения и диета. Кроме того, становится очевидным, что питание матери во время беременности также оказывает влияние на восприимчивость потомства к сахарному диабету во взрослом^{возрасте2,3}

протокол

Извлечение островков проводилось в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Орегонского национального исследовательского центра приматов (ONPRC) и Орегонского университета здоровья и науки и было одобрено IACUC ONPRC. ONPRC соблюдает Закон о защите животных и нормативные акты, введенные в действие Министерством сельского хозяйства США (USDA), а также Политику Службы общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных работ. Описанный здесь протокол применяли к островкам от плода макак-резус, которые были вскрыты на 145-й день беременности (бере....

Результаты

Качество выходных данных секвенирования в значительной степени зависит от качества поступающих ядерных материалов. Ядерный глеббинг и повреждение внешней ядерной мембраны приведут к загрязнению окружающей среды РНК и ДНК в анализе, что приведет к появлению шума в д.......

Обсуждение

Исторически сложилось так, что в методах выделения ядер для одноядерного секвенирования РНК и ATAC использовались буферы, содержащие детергенты, несовместимые с жидкостной хромато-масс-спектрометрией (LC-MS), распространенным методом, используемым для количественного о.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 G rat brain cannula injector	Protech International	8IC315IS5SPC	For duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15-140-122	For RT media
FBS	Millipore/Sigma	F4135-500ML	For RT media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11-875-135	For RT media
Collagenase P	Sigma Aldrich	11213865001	For digestion of pancreas
Bovine Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001	For RT media and isolation
Dextrose	Fisher	D16-1	Final concentration will be 2.8 mM
Calcium Chloride	Fisher	C4901-500G	Final concentration will be 0.5 mM
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5	Research Products International	A30075100	Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	For handpicking islets
20x Nuclei Buffer	10X Genomics	2000153/2000207
Digitonin (5%)	Thermo Fisher Scientific	BN2006	Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)	Miltenyi Biotec	130-091-376
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	i8896	Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5	Sigma Aldrich	T2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma Aldrich	S6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma Aldrich	M1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335402001
DTT	Research Products International	D11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
Tween 20	Fisher Bioreagents	BP337-500	Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free Water	Promega	PR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)	Eppendorf	30108310
Cryovials (1.5 mL)	VWR	20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)	Denville	C-2177
Trypan Blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T-10282
Dual-Chamber Cell Counting Slides	Bio-Rad	1450011
MiiliQ Ultrapure Water System	Millipore/Sigma	7003/05/10/15
5 kDa cut-off filter	HMT Metabolome Technologies
Internal Standards	HMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes	Eppendorf	2231000602
Pipette Tips, 10 µL	VWR	76322-528
Pipette Tips, 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	21-236-2A
Pipette Tips, 20 µL	Genesee Scientific	23-404
Pipette Tips, 200 µL	USA Scientific	1120-8810
Phase Contrast Microscope	Olympus	BX41-PH-B
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman-Coulter	B06315
RNase-ZAP	Sigma Aldrich	R2020