Preparación de islotes fetales congelados de primates no humanos para la secuenciación combinada de ARN de un solo núcleo y la secuenciación ATAC, y la metabolómica a granel

Resumen

Este protocolo describe los procedimientos para aislar núcleos de alta calidad de islotes pancreáticos congelados de primates no humanos para su uso en la secuenciación simultánea de ARN de un solo núcleo y la secuenciación ATAC, preservando la fracción citosólica a granel para análisis metabolómicos de las mismas muestras.

Resumen

Un reto en los estudios con tejido recogido de múltiples cohortes es evitar los efectos de lote cuando se preparan para experimentos multiómicos a gran escala, como la secuenciación combinada de ARN de una sola célula y la metabolómica. El método del estudio actual utiliza islotes pancreáticos congelados rápidamente de primates fetales no humanos recolectados durante un lapso de dos años para su entrada en la secuenciación de ARN de un solo núcleo y los ensayos de secuenciación ATAC. La fracción citosólica generada durante la extracción nuclear se retuvo para la electroforesis capilar posterior-espectrometría de masas y la posterior cuantificación de metabolitos. Este método permite el análisis masivo de metabolitos que contribuyen a los cambios en los paisajes transcriptómicos y epigenómicos dentro de las condiciones experimentales. Es aplicable a muchos tipos de tejidos y maximiza la cantidad de información que se puede extraer de muestras que no están fácilmente disponibles. A medida que se aprecia cada vez más la contribución del metabolismo al establecimiento de la identidad celular a través de modificaciones epigenéticas, son oportunas y necesarias técnicas que permitan identificar la contribución de metabolitos en tipos celulares específicos.

Introducción

Los islotes pancreáticos de Langerhans son fundamentales para el tratamiento de la tolerancia a la glucosa a lo largo de la vida. La falta de ajuste adecuado de los niveles de glucosa en sangre a través de la hormona reductora de la glucosa, la insulina, o la hormona que aumenta la glucosa, el glucagón, da lugar a la diabetes mellitus¹. Los factores de riesgo modificables para minimizar el riesgo de diabetes incluyen el ejercicio y la dieta. Además, cada vez está más claro que la dieta materna durante el embarazo también tiene un efecto sobre la susceptibilidad de la descendencia a la diabetes en la edad adulta ^2,3. Por lo tanto, se necesitan métodos para analizar los efectos de la dieta materna y otras exposiciones, como los medicamentos utilizados durante el embarazo, sobre las células beta productoras de insulina en organismos modelo durante el desarrollo. Por ejemplo, los islotes de crías fetales de primates no humanos (NHP, por sus siglas en inglés) pueden evaluarse para determinar los efectos de las exposiciones al desarrollo. Al igual que los humanos, los NHP suelen tener partos únicos y varían en su respuesta fisiológica a^{la alimentación con} dieta de estilo occidental. Si bien la gestación y el desarrollo fetal de los NHP comparten muchas similitudes con los humanos, lo que los convierte en una especie muy relevante para los estudios de programación metabólica, los desafíos para realizar ensayos bioinformáticos comparativos en la descendencia de NHP incluyen una temporada de apareamiento restringida y una recolección intermitente de muestras. Por lo tanto, los enfoques que permiten el almacenamiento a largo plazo antes del procesamiento y análisis de la muestra son ideales. Este protocolo describe la preparación de muestras para la secuenciación de ARN de un solo núcleo, la secuenciación ATAC y la metabolómica citoplasmática a granel.

Los estudios realizados por otros en el campo de la biología de los islotes han demostrado la superposición en las firmas genéticas observadas en muestras preparadas mediante secuenciación de ARN de una sola célula y secuenciación de ARN de un solo núcleo ^5,6. Ambos métodos permiten la identificación de transcripciones que contribuyen a distinguir las características entre varios tipos de células dentro de la población de islotes. Mediante el uso de detergentes suaves en tejido ultracongelado, los núcleos intactos se pueden utilizar simultáneamente para la secuenciación de ATAC, lo que permite la determinación de regiones de cromatina accesibles. La combinación de la secuenciación de ARN de un solo núcleo con la secuenciación de ATAC permite una mejor caracterización de las redes reguladoras de genes⁷.

La preparación de muestras para la metabolómica se ha visto tradicionalmente limitada por la necesidad de una entrada de alto volumen de muestra para la cromatografía líquida. Además, se deben tener muy en cuenta los tampones utilizados durante la preparación de la muestra para evitar falsos picos de RMN en los datos de espectrometría de masas. Dado el bajo número de muestras que son difíciles y costosas de adquirir en los estudios con primates, la asignación de islotes de diferentes descendientes hacia experimentos transcriptómicos versus metabolómicos puede ser difícil. Por lo tanto, este protocolo hace uso de la fracción citosólica normalmente descartada generada durante el fraccionamiento celular para experimentos de un solo núcleo. Este método permite la caracterización simultánea de transcripciones y regiones abiertas de cromatina que definen subconjuntos celulares en los islotes fetales, al tiempo que mide cuantitativamente los metabolitos producidos dentro de los islotes (Figura 1). Este protocolo es una adaptación de un protocolo demostrado publicado por 10x genomics para el aislamiento de núcleos de tejido cerebral de ratón embrionario congelado rápidamente (versión CG000366 Rev^{D 8})⁷.

Protocolo

La recuperación de islotes se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Nacional de Investigación de Primates de Oregón (ONPRC) y la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón y fue aprobada por la ONPRC IACUC. La ONPRC se rige por la Ley de Bienestar Animal y las Regulaciones aplicadas por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y la Política del Servicio de Salud Pública sobre el Cuidado y el Uso Humanitario del Laboratorio. El protocolo aquí se aplicó a los islotes de macacos Rhesus fetales que se necropsiaron en el día de gestación 145 (la gestación del macaco Rhesus suele ser de 173 a 175 días). Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado para este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento de islotes

1. Extirpe el páncreas fetal de los tejidos circundantes⁹ y colóquelo en solución salina tamponada con fosfato helada.
2. Extraer el páncreas del PBS e inflarlo con colagenasa P (0,6 mg/mL) mediante la canulación del conducto pancreático con un inyector de cánula cerebral de roedores de 33 G.
3. Divida el páncreas en seis secciones con tijeras quirúrgicas estériles y digiera durante 27-30 min a 37 °C en solución de colagenasa.
4. Prepare los medios RT combinando 10% de FBS y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina en RPMI 1640.
5. Vierta la colagenasa y agregue 10 mL de medio RT.
6. Agite suavemente durante 1 minuto para interrumpir el tejido conectivo restante.
7. Elimine el material no digerido colándolo a través de un filtro de 500 μm.
8. Lave los islotes dos veces con 50 mL de medio RT.
9. Incubar los islotes en DNasa I bovina (0,8 U/mL) en un baño de agua a 37 °C durante 10 min.
10. Cultivar los islotes durante la noche en medio RT con DNasa I bovina (0.4 U/mL) a 37 °C con 5% de CO₂.
11. Envíe islotes en empaques especializados a temperatura ambiente con paquetes de gel de control de temperatura.

2. Banco de muestras para almacenamiento a largo plazo

1. Evalúe el tamaño de los islotes utilizando una retícula escalada y observe el grado de tejido acinar y ductal en preparación.
2. Seleccione los islotes a mano con una pipeta automática en una placa de 60 mm que contenga 5 mL de DMEM de glucosa de 2,8 mM.
   NOTA: Es imperativo minimizar la cantidad de tejido acinar y tejido ductal que se almacenará en la preparación final de los islotes. Los detalles de los islotes ideales para su uso se informan en un protocolo anterior⁹.
3. Recoja los islotes en un tubo de 1,5 ml y gírelos a ~300 x g durante 5 minutos a 4 °C.
4. Resuspendió los islotes en 1x PBS libre de calcio y magnesio.
5. Centrifugar durante 5 min a ~300 x g a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
6. Repita los pasos 2.3-2.5 dos veces más.
7. Congele rápidamente los islotes en un tubo de 1,5 ml durante 10 s en nitrógeno líquido.
8. Almacene el pellet a -80 °C hasta el día del aislamiento nuclear.

3. Fraccionamiento celular para el aislamiento de núcleos y fracción citoplasmática

1. Preparación de tampones para la extracción de núcleos (Tabla 1).
   1. Asegúrese de que el banco, las pipetas y los reactivos estén libres de ARNasa.
   2. Prepare los tampones de lavado, lisis concentrada, dilución de lisis y núcleos diluidos de acuerdo con la Tabla 1.
   3. Prepare un tampón de lisis 0,1x en un tubo de 5 ml utilizando el tampón de dilución de lisis para diluir el tampón de lisis concentrado.
2. Homogeneización de tejidos
   1. Retire las muestras del congelador a -80 °C y colóquelas inmediatamente en hielo.
   2. Añadir 500 μL de tampón de lisis 0,1x a los gránulos de tejido e incubar durante 3 min en hielo.
   3. Con un mortero de pellets desechable sin RNasa, homogeneice suavemente el tejido 15 veces en hielo.
   4. Incubar las muestras en hielo durante 10 min.
   5. Añadir 500 μL de tampón de lavado al homogeneizado y pipetear suavemente con hielo.
   6. Prepare un filtro de preseparación de 30 μm agregando 300 mL de tampón de lavado al filtro sobre un tubo de 5 mL.
   7. Filtre el homogeneizado celular de 1 mL utilizando el filtro de preseparación de 30 μM en el tubo de 5 mL.
   8. Centrifugar el homogeneizado filtrado a 500 x g durante 5 min en una centrífuga de cubo oscilante a 4 °C.
3. Recolección y almacenamiento de sobrenadante para metabolómica
   1. Retire 1 mL del sobrenadante del paso 3.2.8 con una pipeta y agréguelo a un criovial de 1,5 mL sobre hielo.
   2. Congelar inmediatamente el sobrenadante a -80 °C. Este sobrenadante se utilizará para la metabolómica.
4. Preparación de núcleos para la secuenciación de ARN y ATAC de un solo núcleo
   1. Vuelva a suspender suavemente el pellet de núcleos añadiendo 1 mL de tampón de lavado al pellet gota a gota. Pipetear lentamente 5 veces.
   2. Centrifugar el pellet lavado a 1000 x g durante 5 min en una centrífuga de cubo oscilante a 4 °C.
   3. Repita los pasos 3.4.1 y 3.4.2 una vez más.
   4. Después del lavado final, vuelva a suspender los núcleos en 1 mL de tampón de lavado. Mantener la preparación nuclear en hielo.
   5. Aspirar 10 μL de suspensión de núcleos con una pipeta y mezclar con 10 μL de azul de tripano al 0,4% pipeteando suavemente.
   6. Añada 10 μL de los núcleos y la mezcla de azul de tripano a un portaobjetos de contador de células automatizado con una pipeta y colóquelo en el instrumento.
   7. Determine la concentración de núcleos en núcleos/μL.
      NOTA: A diferencia de las preparaciones celulares para la secuenciación de ARN de una sola célula, los contadores de células automatizados detectarán los núcleos como células muertas. No más del 95% de esta preparación debe estar viva en contadores de células automatizados. Si más del 5% de la población nuclear está viva, la suspensión de los núcleos puede filtrarse una vez más a través del filtro de preseparación de 30 μm y centrifugar durante 5 minutos a 1000 x g a 4 °C. A continuación, la concentración de núcleos se puede recalcular como se indica en el paso 3.4.6.
   8. En función de la recuperación deseada de los núcleos objetivo, vuelva a suspender los núcleos a la concentración necesaria utilizando un tampón de 1x núcleos y proceda a la preparación de la biblioteca de secuenciación de ARN de un solo núcleo y ATAC¹⁰.

4. Preparación de fracción citosólica para electroforesis capilar-espectrometría de masas (CE-MS)

1. Combine 80 μL de fracción citosólica recogida en el paso 3.3.1 con 20 μL de agua nanopura que contenga patrones internalizados.
2. Proceda con la CE-MS y el análisis como se describió anteriormente 11,12,13.

Resultados

La calidad de los resultados de la secuenciación depende en gran medida de la calidad de los insumos nucleares. La formación de burbujas nucleares y el daño a la membrana nuclear externa darán lugar a la contaminación ambiental del ARN y el ADN en el análisis, lo que introducirá ruido en los datos. Un extracto nuclear puro tendrá evidencia mínima de núcleos encapsulados con componentes citoplasmáticos (Figura 2A) o sobredigestión, evidenciada por...

Discusión

Históricamente, los métodos de aislamiento nuclear para la secuenciación de ARN de un solo núcleo y ATAC han utilizado tampones que contienen detergentes que son incompatibles con la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), una técnica común utilizada para la cuantificación de metabolitos^16,17. El protocolo actual permite la combinación de técnicas transcriptómicas y metabolómicas a partir de la misma ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 G rat brain cannula injector	Protech International	8IC315IS5SPC	For duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15-140-122	For RT media
FBS	Millipore/Sigma	F4135-500ML	For RT media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11-875-135	For RT media
Collagenase P	Sigma Aldrich	11213865001	For digestion of pancreas
Bovine Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001	For RT media and isolation
Dextrose	Fisher	D16-1	Final concentration will be 2.8 mM
Calcium Chloride	Fisher	C4901-500G	Final concentration will be 0.5 mM
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5	Research Products International	A30075100	Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	For handpicking islets
20x Nuclei Buffer	10X Genomics	2000153/2000207
Digitonin (5%)	Thermo Fisher Scientific	BN2006	Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)	Miltenyi Biotec	130-091-376
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	i8896	Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5	Sigma Aldrich	T2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma Aldrich	S6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma Aldrich	M1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335402001
DTT	Research Products International	D11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
Tween 20	Fisher Bioreagents	BP337-500	Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free Water	Promega	PR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)	Eppendorf	30108310
Cryovials (1.5 mL)	VWR	20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)	Denville	C-2177
Trypan Blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T-10282
Dual-Chamber Cell Counting Slides	Bio-Rad	1450011
MiiliQ Ultrapure Water System	Millipore/Sigma	7003/05/10/15
5 kDa cut-off filter	HMT Metabolome Technologies
Internal Standards	HMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes	Eppendorf	2231000602
Pipette Tips, 10 µL	VWR	76322-528
Pipette Tips, 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	21-236-2A
Pipette Tips, 20 µL	Genesee Scientific	23-404
Pipette Tips, 200 µL	USA Scientific	1120-8810
Phase Contrast Microscope	Olympus	BX41-PH-B
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman-Coulter	B06315
RNase-ZAP	Sigma Aldrich	R2020