Preparação de ilhotas fetais de primatas não humanos congelados para sequenciamento combinado de RNA de núcleo único e sequenciamento ATAC e metabolômica em massa

Resumo

Este protocolo descreve procedimentos para isolar núcleos de alta qualidade de ilhotas pancreáticas de primatas não humanos congelados para uso em sequenciamento simultâneo de RNA de núcleo único e sequenciamento ATAC, preservando a fração citosólica em massa para análises metabolômicas das mesmas amostras.

Resumo

Um desafio em estudos que usam tecido coletado de várias coortes é evitar efeitos de lote ao se preparar para experimentos multiômicos em larga escala, como sequenciamento combinado de RNA de célula única e metabolômica. O método no estudo atual utiliza ilhotas pancreáticas congeladas de primatas fetais não humanos coletados ao longo de um período de dois anos para entrada em ensaios de sequenciamento de RNA de núcleo único e sequenciamento ATAC. A fração citosólica gerada durante a extração nuclear foi retida para eletroforese capilar a jusante e subsequente quantificação de metabólitos. Este método permite a análise em massa de metabólitos que contribuem para a mudança das paisagens transcriptômicas e epigenômicas em condições experimentais. É aplicável a muitos tipos de tecidos e maximiza a quantidade de informações que podem ser extraídas de amostras que não estão prontamente disponíveis. À medida que a contribuição do metabolismo para o estabelecimento da identidade celular por meio de modificações epigenéticas se torna mais apreciada, técnicas que permitem identificar a contribuição de metabólitos em tipos celulares específicos são oportunas e necessárias.

Introdução

As ilhotas pancreáticas de Langerhans são críticas para o gerenciamento da tolerância à glicose ao longo da vida. A falha em ajustar adequadamente os níveis de glicose no sangue por meio do hormônio redutor de glicose, insulina, ou do hormônio de aumento da glicose, glucagon, resulta em Diabetes Mellitus¹. Fatores de risco modificáveis para minimizar o risco de diabetes incluem exercícios e dieta. Além disso, está ficando claro que a dieta materna durante a gravidez também tem efeito sobre a suscetibilidade da prole ao diabetes na idade adulta ^2,3

Protocolo

A recuperação das ilhotas foi conduzida de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro Nacional de Pesquisa de Primatas do Oregon (ONPRC) e da Oregon Health and Science University e foi aprovada pelo ONPRC IACUC. O ONPRC cumpre a Lei de Bem-Estar Animal e os Regulamentos aplicados pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) e a Política do Serviço de Saúde Pública sobre Cuidados Humanos e Uso de Laboratório. O protocolo aqui foi aplicado a ilhotas de macacos Rhesus fetais que foram necropsiados no dia gestacional 145 (a gestação do macaco Rhesus é tipicamente de 173-17....

Discussão

Historicamente, os métodos de isolamento nuclear para sequenciamento de RNA e ATAC de núcleo único utilizaram tampões contendo detergentes incompatíveis com cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS), uma técnica comum usada para quantificação de metabólitos^16,17. O protocolo atual permite a combinação de técnicas transcriptômicas e metabolômicas a partir do mesmo preparo de amostra usando um detergente .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 G rat brain cannula injector	Protech International	8IC315IS5SPC	For duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15-140-122	For RT media
FBS	Millipore/Sigma	F4135-500ML	For RT media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11-875-135	For RT media
Collagenase P	Sigma Aldrich	11213865001	For digestion of pancreas
Bovine Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001	For RT media and isolation
Dextrose	Fisher	D16-1	Final concentration will be 2.8 mM
Calcium Chloride	Fisher	C4901-500G	Final concentration will be 0.5 mM
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5	Research Products International	A30075100	Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	For handpicking islets
20x Nuclei Buffer	10X Genomics	2000153/2000207
Digitonin (5%)	Thermo Fisher Scientific	BN2006	Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)	Miltenyi Biotec	130-091-376
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	i8896	Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5	Sigma Aldrich	T2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma Aldrich	S6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma Aldrich	M1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335402001
DTT	Research Products International	D11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
Tween 20	Fisher Bioreagents	BP337-500	Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free Water	Promega	PR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)	Eppendorf	30108310
Cryovials (1.5 mL)	VWR	20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)	Denville	C-2177
Trypan Blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T-10282
Dual-Chamber Cell Counting Slides	Bio-Rad	1450011
MiiliQ Ultrapure Water System	Millipore/Sigma	7003/05/10/15
5 kDa cut-off filter	HMT Metabolome Technologies
Internal Standards	HMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes	Eppendorf	2231000602
Pipette Tips, 10 µL	VWR	76322-528
Pipette Tips, 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	21-236-2A
Pipette Tips, 20 µL	Genesee Scientific	23-404
Pipette Tips, 200 µL	USA Scientific	1120-8810
Phase Contrast Microscope	Olympus	BX41-PH-B
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman-Coulter	B06315
RNase-ZAP	Sigma Aldrich	R2020