Preparação de ilhotas fetais de primatas não humanos congelados para sequenciamento combinado de RNA de núcleo único e sequenciamento ATAC e metabolômica em massa

Resumo

Este protocolo descreve procedimentos para isolar núcleos de alta qualidade de ilhotas pancreáticas de primatas não humanos congelados para uso em sequenciamento simultâneo de RNA de núcleo único e sequenciamento ATAC, preservando a fração citosólica em massa para análises metabolômicas das mesmas amostras.

Resumo

Um desafio em estudos que usam tecido coletado de várias coortes é evitar efeitos de lote ao se preparar para experimentos multiômicos em larga escala, como sequenciamento combinado de RNA de célula única e metabolômica. O método no estudo atual utiliza ilhotas pancreáticas congeladas de primatas fetais não humanos coletados ao longo de um período de dois anos para entrada em ensaios de sequenciamento de RNA de núcleo único e sequenciamento ATAC. A fração citosólica gerada durante a extração nuclear foi retida para eletroforese capilar a jusante e subsequente quantificação de metabólitos. Este método permite a análise em massa de metabólitos que contribuem para a mudança das paisagens transcriptômicas e epigenômicas em condições experimentais. É aplicável a muitos tipos de tecidos e maximiza a quantidade de informações que podem ser extraídas de amostras que não estão prontamente disponíveis. À medida que a contribuição do metabolismo para o estabelecimento da identidade celular por meio de modificações epigenéticas se torna mais apreciada, técnicas que permitem identificar a contribuição de metabólitos em tipos celulares específicos são oportunas e necessárias.

Introdução

As ilhotas pancreáticas de Langerhans são críticas para o gerenciamento da tolerância à glicose ao longo da vida. A falha em ajustar adequadamente os níveis de glicose no sangue por meio do hormônio redutor de glicose, insulina, ou do hormônio de aumento da glicose, glucagon, resulta em Diabetes Mellitus¹. Fatores de risco modificáveis para minimizar o risco de diabetes incluem exercícios e dieta. Além disso, está ficando claro que a dieta materna durante a gravidez também tem efeito sobre a suscetibilidade da prole ao diabetes na idade adulta ^2,3. Assim, são necessários métodos para analisar os efeitos da dieta materna e outras exposições, como medicamentos usados durante a gravidez, nas células beta produtoras de insulina em organismos modelo durante o desenvolvimento. Por exemplo, ilhotas de descendentes fetais de primatas não humanos (NHP) podem ser avaliadas quanto aos efeitos das exposições ao desenvolvimento. Semelhante aos humanos, os PNHs geralmente têm nascimentos únicos e variam em sua resposta fisiológica à alimentação com dieta de estilo ocidental⁴. Embora a gestação e o desenvolvimento fetal dos NHPs compartilhem muitas semelhanças com os humanos, tornando-os uma espécie altamente relevante para estudos de programação metabólica, os desafios para a realização de ensaios bioinformáticos comparativos na prole de NHP incluem uma estação de acasalamento restrita e coleta intermitente de amostras. Portanto, abordagens que permitem o armazenamento de longo prazo antes do processamento e análise da amostra são ideais. Este protocolo descreve a preparação de amostras para sequenciamento de RNA de núcleo único, sequenciamento ATAC e metabolômica citoplasmática em massa.

Estudos realizados por outros no campo da biologia das ilhotas demonstraram sobreposição nas assinaturas genéticas observadas em amostras preparadas por meio de sequenciamento de RNA de célula única e sequenciamento de RNA de núcleo único ^5,6. Ambos os métodos permitem a identificação de transcritos que contribuem para distinguir características entre vários tipos de células dentro da população de ilhotas. Através do uso de detergentes suaves em tecidos congelados rapidamente, núcleos intactos podem ser usados simultaneamente para sequenciamento ATAC, o que permite a determinação de regiões de cromatina acessíveis. A combinação do sequenciamento de RNA de núcleo único com o sequenciamento ATAC permite uma melhor caracterização das redes reguladoras de genes⁷.

A preparação de amostras para metabolômica tem sido tradicionalmente limitada pela necessidade de um alto volume de entrada de amostra para cromatografia líquida. Além disso, deve-se considerar cuidadosamente os tampões usados durante a preparação da amostra para evitar falsos picos de RMN em dados de espectrometria de massa. Dado o baixo número de amostras que são desafiadoras e caras para adquirir em estudos com primatas, a alocação de ilhotas de diferentes descendentes para experimentos transcriptômicos versus metabolômicos pode ser difícil. Assim, este protocolo faz uso da fração citosólica normalmente descartada gerada durante o fracionamento celular para experimentos de núcleo único. Este método permite a caracterização simultânea de transcritos e regiões de cromatina aberta que definem subconjuntos celulares em ilhotas fetais, enquanto mede quantitativamente os metabólitos produzidos dentro das ilhotas (Figura 1). Este protocolo é adaptado de um protocolo demonstrado publicado pela 10x genomics para o isolamento de núcleos de tecido cerebral embrionário de camundongo congelado (versão CG000366 Rev D⁸)⁷.

Protocolo

A recuperação das ilhotas foi conduzida de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro Nacional de Pesquisa de Primatas do Oregon (ONPRC) e da Oregon Health and Science University e foi aprovada pelo ONPRC IACUC. O ONPRC cumpre a Lei de Bem-Estar Animal e os Regulamentos aplicados pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) e a Política do Serviço de Saúde Pública sobre Cuidados Humanos e Uso de Laboratório. O protocolo aqui foi aplicado a ilhotas de macacos Rhesus fetais que foram necropsiados no dia gestacional 145 (a gestação do macaco Rhesus é tipicamente de 173-175 dias). Os detalhes dos reagentes e do equipamento usado para este estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento de ilhotas

1. Extirpar o pâncreas fetal dos tecidos circundantes⁹ e colocá-lo em solução salina tamponada com fosfato gelado.
2. Remova o pâncreas do PBS e infle-o com colagenase P (0,6 mg / mL) por meio de canulação do ducto pancreático usando um injetor de cânula cerebral de roedor 33 G.
3. Divida o pâncreas em seis seções com tesoura cirúrgica estéril e digerir por 27-30 min a 37 ° C em solução de colagenase.
4. Prepare o meio RT combinando 10% de FBS e 100 U / mL de penicilina / estreptomicina em RPMI 1640.
5. Despeje a colagenase e adicione 10 mL de meio RT.
6. Agite suavemente por 1 min para romper o tecido conjuntivo restante.
7. Remova o material não digerido coando através de um filtro de 500 μm.
8. Lave as ilhotas duas vezes com 50 mL de meio RT.
9. Incubar os ilhéus em DNase I bovina (0,8 U/ml) em banho-maria a 37 °C durante 10 min.
10. Cultivar as ilhotas durante a noite em meio RT com DNase I bovina (0,4 U/mL) a 37 °C com 5% de CO₂.
11. Ilhotas de navio em embalagens especializadas à temperatura ambiente com pacotes de gel de controle de temperatura.

2. Banco de amostras para armazenamento de longo prazo

1. Avalie o tamanho das ilhotas usando um retículo em escala e observe o grau de tecido acinar e ductal em preparação.
2. Escolha manualmente ilhotas com uma pipeta automatizada em um prato de 60 mm contendo 5 mL de DMEM de glicose a 2,8 mM.
   NOTA: É imperativo minimizar a quantidade de tecido acinar e tecido ductal que será armazenado na preparação final das ilhotas. Detalhes das ilhotas ideais para uso são relatados em um protocolo anterior⁹.
3. Escolha ilhotas em um tubo de 1,5 mL e gire a ~ 300 x g por 5 min a 4 ° C.
4. Ressuspendeu as ilhotas em 1x PBS livre de cálcio e magnésio.
5. Gire por 5 min a ~300 x g a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
6. Repita as etapas 2.3-2.5 mais duas vezes.
7. Congele rapidamente as ilhotas em um tubo de 1,5 mL por 10 s em nitrogênio líquido.
8. Conservar o sedimento a -80 °C até ao dia do isolamento nuclear.

3. Fracionamento celular para isolamento de núcleos e fração citoplasmática

1. Preparação de tampões para extração de núcleos (Tabela 1).
   1. Certifique-se de que a bancada, as pipetas e os reagentes estejam livres de RNase.
   2. Preparar a lavagem, a lise concentrada, a diluição da lise e os tampões de núcleos diluídos de acordo com o quadro 1.
   3. Prepare o tampão de lise 0,1x em um tubo de 5 mL usando o tampão de diluição de lise para diluir o tampão de lise concentrado.
2. Homogeneização de tecidos
   1. Retire as amostras do congelador a -80 °C e coloque-as imediatamente no gelo.
   2. Adicione 500 μL de tampão de lise 0,1x aos pellets de tecido e incube por 3 min em gelo.
   3. Usando um pilão de pellets descartável sem RNase, homogeneizar suavemente o tecido 15 vezes no gelo.
   4. Incube as amostras no gelo por 10 min.
   5. Adicione 500 μL de tampão de lavagem ao homogeneizado e pipete suavemente sobre gelo.
   6. Prepare um filtro de pré-separação de 30 μm adicionando 300 mL de tampão de lavagem ao filtro sobre um tubo de 5 mL.
   7. Filtrar o homogeneizado celular de 1 ml utilizando o filtro de pré-separação de 30 μM para o tubo de 5 ml.
   8. Girar o homogenato filtrado a 500 x g durante 5 min numa centrífuga de balde oscilante a 4 °C.
3. Coleta e armazenamento de sobrenadante para metabolômica
   1. Remova 1 mL do sobrenadante da etapa 3.2.8 com uma pipeta e adicione a um criovial de 1,5 mL no gelo.
   2. Congelar imediatamente o sobrenadante a -80 °C. Este sobrenadante será usado para metabolômica.
4. Preparação de núcleos para sequenciamento de RNA e ATAC de núcleo único
   1. Ressuspenda suavemente o pellet de núcleos adicionando 1 mL de tampão de lavagem ao pellet gota a gota. Pipete lentamente 5 vezes.
   2. Girar o pellet lavado a 1000 x g durante 5 min numa centrifugadora de balde oscilante a 4 °C.
   3. Repita as etapas 3.4.1 e 3.4.2 mais uma vez.
   4. Após a lavagem final, ressuspenda os núcleos em 1 mL de tampão de lavagem. Mantenha a preparação nuclear no gelo.
   5. Aspire 10 μL de suspensão de núcleos com uma pipeta e misture com 10 μL de azul de tripano a 0,4% pipetando suavemente.
   6. Adicione 10 μL dos núcleos e da mistura de azul de tripano a uma lâmina de contador de células automatizada com uma pipeta e coloque-a no instrumento.
   7. Determine a concentração de núcleos em núcleos/μL.
      NOTA: Ao contrário das preparações celulares para sequenciamento de RNA de célula única, os contadores de células automatizados detectarão núcleos como células mortas. Não mais do que 95% dessa preparação deve estar ativa em contadores de células automatizados. Se mais de 5% da população nuclear estiver viva, a suspensão de núcleos pode ser filtrada mais uma vez através do filtro de pré-separação de 30 μm e girada por 5 min a 1000 x g a 4 °C. A concentração de núcleos pode então ser recalculada conforme descrito na etapa 3.4.6.
   8. Com base na recuperação de núcleos alvo desejada, ressuspenda os núcleos para a concentração necessária usando 1x tampão de núcleos e prossiga para a preparação da biblioteca de sequenciamento de RNA de núcleo único e ATAC¹⁰.

4. Preparação da fração citosólica para eletroforese capilar - espectrometria de massas (CE-MS)

1. Combine 80 μL de fração citosólica coletada na etapa 3.3.1 com 20 μL de água nanopura contendo padrões internalizados.
2. Prossiga com CE-MS e análise conforme descrito anteriormente 11,12,13.

Resultados

A qualidade das saídas de sequenciamento é altamente dependente da qualidade da entrada nuclear. O blebbing nuclear e os danos à membrana nuclear externa resultarão em contaminação ambiental de RNA e DNA na análise, o que introduzirá ruído nos dados. Um extrato nuclear puro terá evidência mínima de núcleos encapsulados com componentes citoplasmáticos (Figura 2A) ou superdigestão, evidenciada por núcleos estourados (Figura...

Discussão

Historicamente, os métodos de isolamento nuclear para sequenciamento de RNA e ATAC de núcleo único utilizaram tampões contendo detergentes incompatíveis com cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS), uma técnica comum usada para quantificação de metabólitos^16,17. O protocolo atual permite a combinação de técnicas transcriptômicas e metabolômicas a partir do mesmo preparo de amostra usando um detergente ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 G rat brain cannula injector	Protech International	8IC315IS5SPC	For duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15-140-122	For RT media
FBS	Millipore/Sigma	F4135-500ML	For RT media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11-875-135	For RT media
Collagenase P	Sigma Aldrich	11213865001	For digestion of pancreas
Bovine Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001	For RT media and isolation
Dextrose	Fisher	D16-1	Final concentration will be 2.8 mM
Calcium Chloride	Fisher	C4901-500G	Final concentration will be 0.5 mM
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5	Research Products International	A30075100	Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	For handpicking islets
20x Nuclei Buffer	10X Genomics	2000153/2000207
Digitonin (5%)	Thermo Fisher Scientific	BN2006	Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)	Miltenyi Biotec	130-091-376
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	i8896	Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5	Sigma Aldrich	T2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma Aldrich	S6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma Aldrich	M1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335402001
DTT	Research Products International	D11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
Tween 20	Fisher Bioreagents	BP337-500	Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free Water	Promega	PR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)	Eppendorf	30108310
Cryovials (1.5 mL)	VWR	20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)	Denville	C-2177
Trypan Blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T-10282
Dual-Chamber Cell Counting Slides	Bio-Rad	1450011
MiiliQ Ultrapure Water System	Millipore/Sigma	7003/05/10/15
5 kDa cut-off filter	HMT Metabolome Technologies
Internal Standards	HMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes	Eppendorf	2231000602
Pipette Tips, 10 µL	VWR	76322-528
Pipette Tips, 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	21-236-2A
Pipette Tips, 20 µL	Genesee Scientific	23-404
Pipette Tips, 200 µL	USA Scientific	1120-8810
Phase Contrast Microscope	Olympus	BX41-PH-B
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman-Coulter	B06315
RNase-ZAP	Sigma Aldrich	R2020