単一核RNAシーケンシングとATACシーケンシングの組み合わせ、およびバルクメタボロミクスのための凍結非ヒト霊長類胎児膵島の調製

要約

このプロトコルは、凍結した非ヒト霊長類膵島から高品質の核を単離し、単一核同時RNAシーケンシングおよびATACシーケンシングで使用すると同時に、同じサンプルからのメタボローム分析のためのバルク細胞質画分を保持する手順を説明しています。

要約

複数のコホートから採取した組織を用いた研究における課題の1つは、シングルセルRNAシーケンシングやメタボロミクスを組み合わせた大規模なマルチオミクス実験の準備において、バッチ効果を回避することです。現在の研究では、2年間にわたって収集された胎児の非ヒト霊長類からの瞬間凍結膵島を利用して、単一核RNAシーケンシングおよびATACシーケンシングアッセイにインプットします。核抽出中に生成された細胞質画分は、下流のキャピラリー電気泳動-質量分析およびその後の代謝物定量のために保持されました。この方法により、実験条件内のトランスクリプトームおよびエピゲノムのランドスケープの変化に寄与する代謝物のバルク分析が可能になります。多くの組織タイプに適用でき、容易に入手できないサンプルから抽出できる情報量を最大化します。エピジェネティックな修飾 による 細胞同一性の確立に対する代謝の寄与がますます評価されるようになるにつれて、特定の細胞タイプにおける代謝産物の寄与を同定することを可能にする技術はタイムリーかつ必要とされています。

概要

ランゲルハンスの膵島は、生涯を通じて耐糖能の管理に重要です。グルコース低下ホルモン、インスリン、またはグルコース上昇ホルモンであるグルカゴンを介して血糖値を適切に調整しないと、1型糖尿病^{が発生します。}糖尿病のリスクを最小限に抑えるための修正可能な危険因子には、運動と食事が含まれます。また、妊娠中の母親の食事も、成人期の子孫の糖尿病に対する感受性に影響を与えることが明らかになりつつあります^2,3。したがって、母親の食事や妊娠中に使用される薬などの他の曝露が、発生中のモデル生物のインスリン産生ベータ細胞に及ぼす影響を分析する方法が必要です。例えば、胎児の非ヒト霊長類(NHP)の子孫の膵島は、発生曝露の影響について評価することができる。人間と同様に、NHPは通常、シングルトン出産をしており、西洋式の食事摂食に対する生理学的反応が異なります⁴。NHPの妊娠と胎児の発育はヒトと多くの類似点を共有しており、代謝プログラミング研究に非常に関連性の高い種となっていますが、NHPの子孫に対して比較バイオインフォマティクスアッセイを実施する際の課題には、交配期間の制限と断続的なサンプル収集が含まれます。したがって、サンプルの処理と分析の前に長期保存できるアプローチが理想的です。このプロトコルでは、単一核RNAシーケンシング、ATACシーケンシング、およびバルク細胞質メタボロミクスのためのサンプル調製について説明します。

膵島生物学分野の他の研究者による研究では、単一細胞RNAシーケンシングと単一核RNAシーケンシングによって調製されたサンプルで観察された遺伝的シグネチャーに重複があることが実証されています^5,6。どちらの方法も、膵島集団内のさまざまな細胞タイプ間の特徴を区別するのに役立つ転写産物の同定を可能にします。瞬間凍結組織に中性洗剤を使用することで、無傷の核を同時にATACシーケンシングに使用できるため、アクセス可能なクロマチン領域を決定できます。単一核RNAシーケンシングとATACシーケンシングを組み合わせることで、遺伝子制御ネットワークの特性評価を向上させることができます⁷。

メタボロミクス用のサンプル調製は、従来、液体クロマトグラフィーのための大容量サンプルインプットの必要性によって制限されてきました。さらに、質量分析データに誤ったNMRピークが生じないように、サンプル調製中に使用するバッファーを慎重に検討する必要があります。霊長類の研究で取得するのが困難で費用がかかるサンプルの数が少ないことを考えると、トランスクリプトーム実験とメタボローム実験に対する異なる子孫の膵島の割り当ては困難になる可能性があります。したがって、このプロトコルは、細胞分画中に生成される通常は廃棄される細胞質分画を単一核実験に利用します。この方法により、膵島内で産生される代謝産物を定量的に測定しながら、胎児膵島の細胞サブセットを定義する転写産物とオープンクロマチン領域の同時特性評価が可能になります(図1)。このプロトコルは、10x genomicsによって発表された、瞬間凍結胚性マウス脳組織からの核の単離に関する実証済みのプロトコル(バージョンCG000366 Rev D⁸)⁷から適応されています。

プロトコル

膵島の回収は、オレゴン国立霊長類研究センター(ONPRC)およびオレゴン健康科学大学の動物管理および使用委員会(IACUC)のガイドラインに従って実施され、ONPRC IACUCによって承認されました。ONPRCは、動物福祉法および米国農務省(USDA)が施行する規制、および人道的なケアと実験室の使用に関する公衆衛生サービスポリシーを遵守しています。本明細書のプロトコルは、妊娠145日目(アカゲザルの妊娠期間は典型的には173〜175日)に剖検された胎児のアカゲザルからの膵島に適用した。本試験に使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1.膵島の分離

1. 周囲の組織⁹ から胎児の膵臓を切除し、氷冷リン酸塩緩衝生理食塩水に入れる。
2. PBSから膵臓を取り出し、33Gのげっ歯類脳カニューレ注射器を使用して膵管のカニューレ挿入 を介して コラゲナーゼP(0.6 mg / mL)で膨らませます。.
3. 滅菌手術用ハサミで膵臓を6つのセクションに分け、コラゲナーゼ溶液中で37°Cで27〜30分間消化します。
4. 10% FBS と 100 U/mL のペニシリン/ストレプトマイシンを RPMI 1640 に組み合わせて RT 培地を調製します。
5. コラゲナーゼを流し込み、10 mLのRT培地を加えます。
6. 1分間静かに振とうして、残りの結合組織を破壊します。
7. 未消化の物質は、500 μmのフィルターで濾して除去します。
8. 膵島を50mLのRT培地で2回洗浄します。
9. ウシDNase I(0.8 U/mL)の膵島を37°Cの水浴で10分間インキュベートします。
10. 膵島をRT培地で一晩、ウシDNase I(0.4 U/mL)を37°C、5%_CO2で培養します。
11. 膵島を周囲温度で専用包装し、温度制御ゲルパックで出荷します。

2.長期保管用のサンプルバンキング

1. スケーリングされたレチクルを使用して膵島のサイズを評価し、準備中の腺房組織と管組織の程度に注意してください。.
2. 自動ピペットで膵島を5 mLの2.8 mMグルコースDMEMが入った60 mmディッシュにハンドピックします。
   注:最終的な膵島の準備に貯蔵される腺房組織と乳管組織の量を最小限に抑えることが不可欠です。理想的な使用島の詳細は、以前のプロトコル⁹で報告されている。
3. 膵島を1.5 mLチューブにピッキングし、~300 x g で4°Cで5分間遠心します。
4. カルシウムおよびマグネシウムを含まない1x PBSで膵島を再懸濁しました。
5. 4°Cで~300 x g で5分間遠心します。 上清を捨てます。
6. 手順2.3〜2.5をさらに2回繰り返します。
7. 膵島を1.5mLチューブに入れ、液体窒素中で10秒間急速凍結します。
8. ペレットは、核分離の日まで-80°Cで保管してください。

3. 核および細胞質画分を単離するための細胞分画

1. 核抽出用バッファーの調製(表1)。
   1. ベンチ、ピペット、および試薬がRNaseフリーであることを確認してください。
   2. 表1に従って、洗浄液、濃縮溶解液、溶解希釈液、および希釈した核緩衝液を調製します。
   3. 5 mLチューブに0.1x溶解バッファーを調製し、溶解希釈バッファーを使用して濃縮溶解バッファーを希釈します。
2. 組織の均質化
   1. サンプルを-80°Cの冷凍庫から取り出し、すぐに氷の上に置きます。
   2. 500 μLの0.1x溶解バッファーを組織ペレットに加え、氷上で3分間インキュベートします。
   3. 使い捨てのRNaseフリーペレット乳棒を使用して、氷上で組織を15回穏やかに均質化します。
   4. サンプルを氷上で10分間インキュベートします。
   5. ホモジネートに500 μLの洗浄バッファーを加え、氷上で静かにピペットで泳ぎます。
   6. 30 μmのプレセパレーションフィルターをプライミングするには、5 mLチューブ上に300 mLの洗浄バッファーをフィルターに加えます。
   7. 30 μMのプレセパレーションフィルターを使用して、1 mLの細胞ホモジネートを5 mLチューブにろ過します。
   8. ろ過したホモジネートを500 x g で5分間、スイングバケット遠心分離機で4°Cで遠心します。
3. メタボロミクスのための上清の収集と保管
   1. ステップ3.2.8の上清1 mLをピペットで取り除き、氷上の1.5 mLのクライオバイアルに加えます。
   2. 上清を直ちに-80°Cで凍結します。 この上清はメタボロミクスに使用されます。
4. 単一核RNAおよびATACシーケンシングのための核の調製
   1. 1 mLの洗浄バッファーをペレットに滴下して、核ペレットを穏やかに再懸濁します。ゆっくりと5回ピペットで挟みます。
   2. 洗浄したペレットを1000 x g で5分間、スイングバケット遠心分離機で4°Cで回転させます。
   3. 手順 3.4.1 と 3.4.2 をもう一度繰り返します。
   4. 最終洗浄後、核を1 mLの洗浄バッファーに再懸濁します。核の準備は氷の上に置いてください。
   5. 10 μLの核懸濁液をピペットで吸引し、10 μLの0.4% Trypan blueと穏やかにピペッティングして混合します。
   6. 核とトリパンブルーの混合物10μLをピペットで自動セルカウンタースライドに加え、装置に入れます。
   7. 核濃度を核/μLで測定します。
      注:シングルセルRNAシーケンシング用の細胞調製物とは異なり、自動セルカウンターは核を死細胞として検出します。この調製物の95%以下が自動セルカウンターでライブ化されるべきです。核集団の5%以上が生きている場合、核懸濁液を30μmのプレセパレーションフィルターでさらに時間をろ過し、1000 x g 、4°Cで5分間遠心することができます。 その後、ステップ3.4.6で概説したように核濃度を再計算できます。
   8. 所望の標的核回収率に基づいて、1x nuclei bufferを用いて核を必要な濃度に再懸濁し、単一核RNAおよびATACシーケンシングライブラリー調製¹⁰に進む。

4. キャピラリー電気泳動-質量分析(CE-MS)のための細胞質画分の調製

1. ステップ 3.3.1 で収集した 80 μL の細胞質画分と、内部化された標準物質を含む 20 μL のナノ純水とを組み合わせます。
2. CE-MSと分析は、前述の11,12,13に従って進めます。

結果

シーケンシング出力の品質は、核入力の品質に大きく依存します。核のブレブや外側の核膜の損傷により、分析中に周囲のRNAとDNAが汚染され、データにノイズが入ります。純粋な核抽出物は、細胞質成分でカプセル化された核の証拠が最小限であること(図2A)または核の破裂によって証明される過剰消化(図2B)の証拠が少な?...

ディスカッション

歴史的に、単一核のRNAおよびATACシーケンシングのための核単離の方法は、代謝物定量に使用される一般的な技術である液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)と互換性のない界面活性剤を含むバッファーを利用してきた^16,17。現在のプロトコルでは、細胞分画に穏やかな界面活性剤を使用し、この分画に続いてキャピラリー...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 G rat brain cannula injector	Protech International	8IC315IS5SPC	For duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15-140-122	For RT media
FBS	Millipore/Sigma	F4135-500ML	For RT media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11-875-135	For RT media
Collagenase P	Sigma Aldrich	11213865001	For digestion of pancreas
Bovine Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001	For RT media and isolation
Dextrose	Fisher	D16-1	Final concentration will be 2.8 mM
Calcium Chloride	Fisher	C4901-500G	Final concentration will be 0.5 mM
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5	Research Products International	A30075100	Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	For handpicking islets
20x Nuclei Buffer	10X Genomics	2000153/2000207
Digitonin (5%)	Thermo Fisher Scientific	BN2006	Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)	Miltenyi Biotec	130-091-376
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	i8896	Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5	Sigma Aldrich	T2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma Aldrich	S6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma Aldrich	M1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335402001
DTT	Research Products International	D11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
Tween 20	Fisher Bioreagents	BP337-500	Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free Water	Promega	PR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)	Eppendorf	30108310
Cryovials (1.5 mL)	VWR	20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)	Denville	C-2177
Trypan Blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T-10282
Dual-Chamber Cell Counting Slides	Bio-Rad	1450011
MiiliQ Ultrapure Water System	Millipore/Sigma	7003/05/10/15
5 kDa cut-off filter	HMT Metabolome Technologies
Internal Standards	HMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes	Eppendorf	2231000602
Pipette Tips, 10 µL	VWR	76322-528
Pipette Tips, 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	21-236-2A
Pipette Tips, 20 µL	Genesee Scientific	23-404
Pipette Tips, 200 µL	USA Scientific	1120-8810
Phase Contrast Microscope	Olympus	BX41-PH-B
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman-Coulter	B06315
RNase-ZAP	Sigma Aldrich	R2020