単一核RNAシーケンシングとATACシーケンシングの組み合わせ、およびバルクメタボロミクスのための凍結非ヒト霊長類胎児膵島の調製

要約

このプロトコルは、凍結した非ヒト霊長類膵島から高品質の核を単離し、単一核同時RNAシーケンシングおよびATACシーケンシングで使用すると同時に、同じサンプルからのメタボローム分析のためのバルク細胞質画分を保持する手順を説明しています。

要約

複数のコホートから採取した組織を用いた研究における課題の1つは、シングルセルRNAシーケンシングやメタボロミクスを組み合わせた大規模なマルチオミクス実験の準備において、バッチ効果を回避することです。現在の研究では、2年間にわたって収集された胎児の非ヒト霊長類からの瞬間凍結膵島を利用して、単一核RNAシーケンシングおよびATACシーケンシングアッセイにインプットします。核抽出中に生成された細胞質画分は、下流のキャピラリー電気泳動-質量分析およびその後の代謝物定量のために保持されました。この方法により、実験条件内のトランスクリプトームおよびエピゲノムのランドスケープの変化に寄与する代謝物のバルク分析が可能になります。多くの組織タイプに適用でき、容易に入手できないサンプルから抽出できる情報量を最大化します。エピジェネティックな修飾 による 細胞同一性の確立に対する代謝の寄与がますます評価されるようになるにつれて、特定の細胞タイプにおける代謝産物の寄与を同定することを可能にする技術はタイムリーかつ必要とされています。

概要

ランゲルハンスの膵島は、生涯を通じて耐糖能の管理に重要です。グルコース低下ホルモン、インスリン、またはグルコース上昇ホルモンであるグルカゴンを介して血糖値を適切に調整しないと、1型糖尿病^{が発生します。}糖尿病のリスクを最小限に抑えるための修正可能な危険因子には、運動と食事が含まれます。また、妊娠中の母親の食事も、成人期の子孫の糖尿病に対する感受性に影響を与えることが明らかになりつつあります^2,3。したがって、母親の食事や妊娠中に使用される薬などの他の曝露が、発生中のモデル生物のインスリン産生ベータ細胞に及ぼす影響を分析する方法が必要です。例えば、胎児の非ヒト霊長類(NHP)の子孫の膵島は、発生曝露の影響について評価することができる。人間と同様に、NHPは通常、シングルトン出産をしており、西洋式の食事摂食に対する生理学的反応が異なります⁴。NHPの妊娠と胎児の発育はヒトと多くの類似点を共有しており、代謝プログラミング研究に非常に関連性の高い種となっていますが、NHPの子孫に対して比較バイオインフォマティクスアッセイを実施する際の課題には、交配期間の制限と断続的なサンプル収集が含まれます。したがって、サンプルの処理と分析の前に長期保存できるア....

プロトコル

膵島の回収は、オレゴン国立霊長類研究センター(ONPRC)およびオレゴン健康科学大学の動物管理および使用委員会(IACUC)のガイドラインに従って実施され、ONPRC IACUCによって承認されました。ONPRCは、動物福祉法および米国農務省(USDA)が施行する規制、および人道的なケアと実験室の使用に関する公衆衛生サービスポリシーを遵守しています。本明細書のプロトコルは、妊娠145日目(アカゲザルの妊娠期間は典型的には173〜175日)に剖検された胎児のアカゲザルからの膵島に適用した。本試験に使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1.膵島の分離

1. 周囲の組織⁹ から胎児の膵臓を切除し、氷冷リン酸塩緩衝生理食塩水に入れる。
2. PBSから膵臓を取り出し、33Gのげっ歯類脳カニューレ注射器を使用して膵管のカニューレ挿入 を介して コラゲナーゼP(0.6 mg / mL)で膨らませます。.
3. 滅菌手術用ハサミで膵臓を6つのセクションに分け、コラゲナーゼ溶液中で37°Cで27〜30分間消化します。
4. 10% FBS と 100 U/mL のペニシリン/ストレプトマイシンを RPMI 1640....

ディスカッション

歴史的に、単一核のRNAおよびATACシーケンシングのための核単離の方法は、代謝物定量に使用される一般的な技術である液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)と互換性のない界面活性剤を含むバッファーを利用してきた^16,17。現在のプロトコルでは、細胞分画に穏やかな界面活性剤を使用し、この分画に続いてキャピラリー.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 G rat brain cannula injector	Protech International	8IC315IS5SPC	For duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15-140-122	For RT media
FBS	Millipore/Sigma	F4135-500ML	For RT media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11-875-135	For RT media
Collagenase P	Sigma Aldrich	11213865001	For digestion of pancreas
Bovine Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001	For RT media and isolation
Dextrose	Fisher	D16-1	Final concentration will be 2.8 mM
Calcium Chloride	Fisher	C4901-500G	Final concentration will be 0.5 mM
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5	Research Products International	A30075100	Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	For handpicking islets
20x Nuclei Buffer	10X Genomics	2000153/2000207
Digitonin (5%)	Thermo Fisher Scientific	BN2006	Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)	Miltenyi Biotec	130-091-376
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	i8896	Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5	Sigma Aldrich	T2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma Aldrich	S6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma Aldrich	M1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335402001
DTT	Research Products International	D11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
Tween 20	Fisher Bioreagents	BP337-500	Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free Water	Promega	PR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)	Eppendorf	30108310
Cryovials (1.5 mL)	VWR	20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)	Denville	C-2177
Trypan Blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T-10282
Dual-Chamber Cell Counting Slides	Bio-Rad	1450011
MiiliQ Ultrapure Water System	Millipore/Sigma	7003/05/10/15
5 kDa cut-off filter	HMT Metabolome Technologies
Internal Standards	HMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes	Eppendorf	2231000602
Pipette Tips, 10 µL	VWR	76322-528
Pipette Tips, 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	21-236-2A
Pipette Tips, 20 µL	Genesee Scientific	23-404
Pipette Tips, 200 µL	USA Scientific	1120-8810
Phase Contrast Microscope	Olympus	BX41-PH-B
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman-Coulter	B06315
RNase-ZAP	Sigma Aldrich	R2020