冷冻非人灵长类动物胎胰岛的制备，用于联合单核 RNA 测序和 ATAC 测序以及大量代谢组学

摘要

该方案描述了从冷冻的非人灵长类胰岛中分离高质量细胞核以用于单核同时 RNA 测序和 ATAC 测序的程序，同时保留大量胞质部分用于相同样品的代谢组学分析。

摘要

使用从多个队列收集的组织进行研究的一个挑战是在准备大规模多组学实验（例如联合单细胞 RNA 测序和代谢组学）时避免批次效应。当前研究中的方法利用两年内收集的胎儿非人灵长类动物的快速冷冻胰岛，用于输入单核 RNA 测序和 ATAC 测序分析。保留细胞核提取过程中产生的胞质组分，用于下游毛细管电泳-质谱和随后的代谢物定量。该方法允许在实验条件下对导致转录组学和表观基因组景观变化的代谢物进行批量分析。它适用于许多组织类型，并最大限度地提高了可从不易获得的样品中提取的信息量。随着代谢 通过 表观遗传修饰对建立细胞身份的贡献越来越受到重视，允许识别特定细胞类型中代谢物贡献的技术是及时和必要的。

引言

朗格汉斯的胰岛对于整个生命周期的葡萄糖耐量管理至关重要。未能通过降糖激素、胰岛素或升糖激素胰高血糖素正确调节血糖水平会导致糖尿病¹。降低糖尿病风险的可改变风险因素包括运动和饮食。此外，越来越明显的是，怀孕期间的母体饮食也会影响后代成年后对糖尿病的易感性 ^2,3。因此，需要方法来分析母体饮食和其他暴露（例如怀孕期间使用的药物）对发育过程中模式生物中产生胰岛素的 β 细胞的影响。例如，可以评估胎儿非人灵长类动物 （NHP） 后代的胰岛的发育暴露影响。与人类类似，非人灵长类通常为单胎出生，并且它们对西式饮食喂养的生理反应各不相同⁴。虽然 NHP 的妊娠和胎儿发育与人类有许多相似之处，使其成为与代谢编程研究高度相关的物种，但对 NHP 后代进行比较生物信息学分析的挑战包括交配季节受限和样本收集间歇性。因此，在样品处理和分析之前允许长期储存的方法是理想的。该方案描述了用于单核 RNA 测序、ATAC 测序和大量细胞质代谢组学的样品制备。

胰岛生物学领域其他人的研究表明，在通过单细胞 RNA 测序和单核 RNA 测序制备的样品中观察到的遗传特征存在重叠 ^5,6。这两种方法都允许鉴定有助于区分胰岛群内各种细胞类型特征的转录本。通过在快速冷冻组织上使用温和的去污剂，完整的细胞核可以同时用于 ATAC 测序，从而可以确定可接近的染色质区域。将单核 RNA 测序与 ATAC 测序相结合，可以更好地表征基因调控网络⁷。

传统上，代谢组学样品的制备受到液相色谱需要高样品量输入的限制。此外，必须仔细考虑样品制备过程中使用的缓冲液，以避免质谱数据中出现错误的 NMR 峰。鉴于在灵长类动物研究中难以获取且成本高昂的样本数量较少，因此将不同后代的胰岛分配给转录组学与代谢组学实验可能很困难。因此，该方案利用细胞分级分离过程中产生的通常丢弃的胞质部分进行单核实验。该方法允许同时表征定义胎胰岛中细胞亚群的转录本和开放染色质区域，同时定量测量胰岛内产生的代谢物（图 1）。该方案改编自 10x genomics 发表的用于从快速冷冻胚胎小鼠脑组织中分离细胞核的演示方案（版本 CG000366 Rev D⁸）⁷。

研究方案

胰岛取回是根据俄勒冈州国家灵长类动物研究中心 （ONPRC） 和俄勒冈健康与科学大学的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的指导方针进行的，并获得了 ONPRC IACUC 的批准。ONPRC 遵守美国农业部 （USDA） 实施的《动物福利法》和法规，以及关于人道护理和使用实验室的公共卫生服务政策。此处的方案适用于在妊娠第 145 天进行尸检的胎儿恒河猴的胰岛（恒河猴妊娠通常为 173-175 天）。用于本研究的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 胰岛隔离

1. 从周围组织⁹ 中切除胎儿胰腺，并将其置于冰冷的磷酸盐缓冲盐水中。
2. 从 PBS 中取出胰腺，并使用 33 G 啮齿动物脑套管注射器 通过 胰管插管用胶原酶 P （0.6 mg/mL） 充气。
3. 用无菌手术剪刀将胰腺分成六个部分，并在 37 °C 的胶原酶溶液中消化 27-30 分钟。
4. 通过将 10% FBS 和 100 U/mL 青霉素/链霉素混合到 RPMI 1640 中来制备 RT 培养基。
5. 倒出胶原酶并加入 10 mL RT 培养基。
6. 轻轻摇晃 1 分钟以破坏剩余的结缔组织。
7. 通过 500 μm 过滤器过滤以去除未消化的材料。
8. 用 50 mL RT 培养基洗涤胰岛两次。
9. 将胰岛在牛 DNase I （0.8 U/mL） 中在 37 °C 水浴中孵育 10 分钟。
10. 在 37 °C 和 5% CO₂ 下，在含有牛 DNase I （0.4 U/mL） 的 RT 培养基中将胰岛培养过夜。
11. 在环境温度下使用温度控制凝胶包以专用包装运输胰岛。

2. 长期存储的样本库

1. 使用缩放的标线评估胰岛的大小，并注意准备中腺泡和导管组织的程度。
2. 用自动移液器将胰岛手动挑取到含有 5 mL 2.8 mM 葡萄糖 DMEM 的 60 mm 培养皿中。
   注意：必须尽量减少将储存在最终胰岛制备中的腺泡组织和导管组织的数量。使用的理想胰岛的详细信息在以前的方案⁹ 中报告。
3. 将胰岛挑取到 1.5 mL 试管中，并在 4 °C 下以 ~300 x g 旋转 5 分钟。
4. 将胰岛重悬于不含钙和镁的 1x PBS 中。
5. 在 4 °C 下以 ~300 x g 旋转 5 分钟。 丢弃上清液。
6. 再重复步骤 2.3-2.5 两次。
7. 将胰岛在 1.5 mL 管中在液氮中快速冷冻 10 秒。
8. 将沉淀储存在 -80 °C 直至核分离之日。

3. 用于分离细胞核和细胞质组分的细胞分级分离

1. 制备用于细胞核提取的缓冲液（表 1）。
   1. 确保工作台、移液器和试剂不含 RNase。
   2. 根据 表 1 准备洗涤液、浓缩裂解液、裂解稀释液和稀释的细胞核缓冲液。
   3. 使用裂解稀释缓冲液在 5 mL 试管中制备 0.1x 裂解缓冲液，以稀释浓缩的裂解缓冲液。
2. 组织匀浆
   1. 从 -80 °C 冰箱中取出样品，并立即将其置于冰上。
   2. 向组织沉淀中加入 500 μL 0.1x 裂解缓冲液，并在冰上孵育 3 分钟。
   3. 使用一次性无 RNase 的沉淀杵，在冰上轻轻匀浆组织 15 次。
   4. 将样品在冰上孵育 10 分钟。
   5. 向匀浆中加入 500 μL 洗涤缓冲液，并在冰上轻轻移液。
   6. 通过在 5 mL 试管上向过滤器中添加 300 mL 洗涤缓冲液来灌注 30 μm 预分离过滤器。
   7. 使用 30 μM 预分离过滤器将 1 mL 细胞匀浆过滤到 5 mL 试管中。
   8. 将过滤后的匀浆在 4 °C 的摆动桶离心机中以 500 x g 旋转 5 分钟。
3. 用于代谢组学的上清液的收集和储存
   1. 用移液管从步骤 3.2.8 中取出 1 mL 上清液，并加入冰上的 1.5 mL 冻存管中。
   2. 立即将上清液在 -80 °C 下冷冻。 该上清液将用于代谢组学。
4. 用于单核 RNA 和 ATAC 测序的细胞核制备
   1. 向沉淀中滴加 1 mL 洗涤缓冲液，轻轻重悬细胞核沉淀。缓慢移液 5 次。
   2. 将洗涤后的沉淀在 4 °C 的摆动桶离心机中以 1000 x g 旋转 5 分钟。
   3. 再次重复步骤 3.4.1 和 3.4.2。
   4. 最后一次洗涤后，将细胞核重悬于 1 mL 洗涤缓冲液中。将细胞核制剂放在冰上。
   5. 用移液管吸出 10 μL 细胞核悬液，轻轻移液与 10 μL 0.4% 台盼蓝混合。
   6. 用移液管将 10 μL 细胞核和台盼蓝混合物添加到自动细胞计数玻片中，然后将其放入仪器中。
   7. 以细胞核/μL 为单位测定细胞核浓度。
      注：与用于单细胞 RNA 测序的细胞制备不同，自动细胞计数仪会将细胞核检测为死细胞。在自动细胞计数仪上的活度不应超过 95%。如果超过 5% 的核群是活的，则可以通过 30 μm 预分离过滤器额外过滤细胞核悬浮液，并在 4 °C 下以 1000 x g 旋转 5 分钟。 然后可以按照步骤 3.4.6 中的概述重新计算细胞核浓度。
   8. 根据所需的靶向细胞核回收率，使用 1x 细胞核缓冲液将细胞核重悬至所需浓度，然后进行单细胞核 RNA 和 ATAC 测序文库制备¹⁰。

4. 用于毛细管电泳-质谱 （CE-MS） 的胞质组分的制备

1. 将步骤 3.3.1 中收集的 80 μL 胞质级分与 20 μL 含有内化标准品的纳米纯水混合。
2. 如前所述 11,12,13 进行 CE-MS 和分析。

结果

测序输出的质量在很大程度上取决于核输入的质量。核起泡和核外膜损伤将导致分析中的环境 RNA 和 DNA 污染，从而在数据中引入噪音。纯核提取物几乎没有证据表明细胞核被细胞质成分包裹（图 2A）或过度消化，以细胞核破裂（图 2B）为证据。理想的核输入将包含完整的核（图 2C）。

讨论

从历史上看，用于单核 RNA 和 ATAC 测序的核分离方法使用的缓冲液含有与液相色谱-质谱 （LC-MS） 不兼容的去污剂，液相色谱-质谱法 （LC-MS） 是代谢物定量的常用技术^16,17。目前的方案允许使用温和的去污剂进行细胞分级分离，并在该分级分离之后进行毛细管电泳，该技术相对于液相色谱需要更小的样品起始量来分离代谢物

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 G rat brain cannula injector	Protech International	8IC315IS5SPC	For duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15-140-122	For RT media
FBS	Millipore/Sigma	F4135-500ML	For RT media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11-875-135	For RT media
Collagenase P	Sigma Aldrich	11213865001	For digestion of pancreas
Bovine Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001	For RT media and isolation
Dextrose	Fisher	D16-1	Final concentration will be 2.8 mM
Calcium Chloride	Fisher	C4901-500G	Final concentration will be 0.5 mM
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5	Research Products International	A30075100	Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	For handpicking islets
20x Nuclei Buffer	10X Genomics	2000153/2000207
Digitonin (5%)	Thermo Fisher Scientific	BN2006	Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)	Miltenyi Biotec	130-091-376
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	i8896	Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5	Sigma Aldrich	T2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma Aldrich	S6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma Aldrich	M1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335402001
DTT	Research Products International	D11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
Tween 20	Fisher Bioreagents	BP337-500	Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free Water	Promega	PR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)	Eppendorf	30108310
Cryovials (1.5 mL)	VWR	20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)	Denville	C-2177
Trypan Blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T-10282
Dual-Chamber Cell Counting Slides	Bio-Rad	1450011
MiiliQ Ultrapure Water System	Millipore/Sigma	7003/05/10/15
5 kDa cut-off filter	HMT Metabolome Technologies
Internal Standards	HMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes	Eppendorf	2231000602
Pipette Tips, 10 µL	VWR	76322-528
Pipette Tips, 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	21-236-2A
Pipette Tips, 20 µL	Genesee Scientific	23-404
Pipette Tips, 200 µL	USA Scientific	1120-8810
Phase Contrast Microscope	Olympus	BX41-PH-B
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman-Coulter	B06315
RNase-ZAP	Sigma Aldrich	R2020