冷冻非人灵长类动物胎胰岛的制备，用于联合单核 RNA 测序和 ATAC 测序以及大量代谢组学

摘要

该方案描述了从冷冻的非人灵长类胰岛中分离高质量细胞核以用于单核同时 RNA 测序和 ATAC 测序的程序，同时保留大量胞质部分用于相同样品的代谢组学分析。

摘要

使用从多个队列收集的组织进行研究的一个挑战是在准备大规模多组学实验（例如联合单细胞 RNA 测序和代谢组学）时避免批次效应。当前研究中的方法利用两年内收集的胎儿非人灵长类动物的快速冷冻胰岛，用于输入单核 RNA 测序和 ATAC 测序分析。保留细胞核提取过程中产生的胞质组分，用于下游毛细管电泳-质谱和随后的代谢物定量。该方法允许在实验条件下对导致转录组学和表观基因组景观变化的代谢物进行批量分析。它适用于许多组织类型，并最大限度地提高了可从不易获得的样品中提取的信息量。随着代谢 通过 表观遗传修饰对建立细胞身份的贡献越来越受到重视，允许识别特定细胞类型中代谢物贡献的技术是及时和必要的。

引言

朗格汉斯的胰岛对于整个生命周期的葡萄糖耐量管理至关重要。未能通过降糖激素、胰岛素或升糖激素胰高血糖素正确调节血糖水平会导致糖尿病¹。降低糖尿病风险的可改变风险因素包括运动和饮食。此外，越来越明显的是，怀孕期间的母体饮食也会影响后代成年后对糖尿病的易感性 ^2,3。因此，需要方法来分析母体饮食和其他暴露（例如怀孕期间使用的药物）对发育过程中模式生物中产生胰岛素的 β 细胞的影响。例如，可以评估胎儿非人灵长类动物 （NHP） 后代的胰岛的发育暴露影响。与人类类似，非人灵长类通常为单胎出生，并且它们对西式饮食喂养的生理反应各不相同⁴。虽然 NHP 的妊娠和胎儿发育与人类有许多相似之处，使其成为与代谢编程研究高度相关的物种，但对 NHP 后代进行比较生物信息学分析的挑战包括交配季节受限和样本收集间歇性。因此，在样品处理和分析之前允许长期储存的方法是理想的。该方案描述了用于单核 RNA 测序、ATAC 测序和大量细胞质代谢组学的样品制备。

胰岛生物学领域其他人的研究表明，在通过单细胞 RNA 测序和单核 RNA 测序制备的样品中观察到的遗传特征存在重叠

研究方案

胰岛取回是根据俄勒冈州国家灵长类动物研究中心 （ONPRC） 和俄勒冈健康与科学大学的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的指导方针进行的，并获得了 ONPRC IACUC 的批准。ONPRC 遵守美国农业部 （USDA） 实施的《动物福利法》和法规，以及关于人道护理和使用实验室的公共卫生服务政策。此处的方案适用于在妊娠第 145 天进行尸检的胎儿恒河猴的胰岛（恒河猴妊娠通常为 173-175 天）。用于本研究的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 胰岛隔离

1. 从周围组织⁹ 中切除胎儿胰腺，并将其置于冰冷的磷酸盐缓冲盐水中。
2. 从 PBS 中取出胰腺，并使用 33 G 啮齿动物脑套管注射器 通过 胰管插管用胶原酶 P （0.6 mg/mL） 充气。
3. 用无菌手术剪刀将胰腺分成六个部分，并在 37 °C 的胶原酶溶液中消化 27-30 分钟。
4. 通过将 10% FBS 和 100 U/mL 青霉素/链霉素混合到 RPMI 1640 中来制备 RT 培养基。
5. 倒出胶原酶并加入 10 mL RT 培养基。
6. 轻轻摇晃 1 分钟以破坏剩余的结缔组织。
<....

讨论

从历史上看，用于单核 RNA 和 ATAC 测序的核分离方法使用的缓冲液含有与液相色谱-质谱 （LC-MS） 不兼容的去污剂，液相色谱-质谱法 （LC-MS） 是代谢物定量的常用技术^16,17。目前的方案允许使用温和的去污剂进行细胞分级分离，并在该分级分离之后进行毛细管电泳，该技术相对于液相色谱需要更小的样品起始量来分离代谢物

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 G rat brain cannula injector	Protech International	8IC315IS5SPC	For duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15-140-122	For RT media
FBS	Millipore/Sigma	F4135-500ML	For RT media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11-875-135	For RT media
Collagenase P	Sigma Aldrich	11213865001	For digestion of pancreas
Bovine Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001	For RT media and isolation
Dextrose	Fisher	D16-1	Final concentration will be 2.8 mM
Calcium Chloride	Fisher	C4901-500G	Final concentration will be 0.5 mM
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5	Research Products International	A30075100	Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	For handpicking islets
20x Nuclei Buffer	10X Genomics	2000153/2000207
Digitonin (5%)	Thermo Fisher Scientific	BN2006	Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)	Miltenyi Biotec	130-091-376
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	i8896	Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5	Sigma Aldrich	T2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma Aldrich	S6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma Aldrich	M1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335402001
DTT	Research Products International	D11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
Tween 20	Fisher Bioreagents	BP337-500	Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free Water	Promega	PR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)	Eppendorf	30108310
Cryovials (1.5 mL)	VWR	20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)	Denville	C-2177
Trypan Blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T-10282
Dual-Chamber Cell Counting Slides	Bio-Rad	1450011
MiiliQ Ultrapure Water System	Millipore/Sigma	7003/05/10/15
5 kDa cut-off filter	HMT Metabolome Technologies
Internal Standards	HMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes	Eppendorf	2231000602
Pipette Tips, 10 µL	VWR	76322-528
Pipette Tips, 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	21-236-2A
Pipette Tips, 20 µL	Genesee Scientific	23-404
Pipette Tips, 200 µL	USA Scientific	1120-8810
Phase Contrast Microscope	Olympus	BX41-PH-B
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman-Coulter	B06315
RNase-ZAP	Sigma Aldrich	R2020