حصاد وتضمين وزراعة العقد الجذرية الظهرية في أجهزة متعددة الأجزاء لدراسة السمات العصبية الطرفية

Summary

يوفر هذا البروتوكول تقنية لحصاد وزراعة العقدة الجذرية الظهرية المزروعة (DRG) من فئران Sprague Dawley البالغة في جهاز متعدد الأجزاء (MC).

Abstract

الميزة العصبية الطرفية الأكثر شيوعا للألم هي انخفاض عتبة التحفيز أو فرط الحساسية للأعصاب الطرفية من العقد الجذرية الظهرية (DRG). يرتبط أحد الأسباب المقترحة لفرط الحساسية هذا بالتفاعل بين الخلايا المناعية في الأنسجة المحيطية والخلايا العصبية. قدمت النماذج في المختبر المعرفة الأساسية في فهم كيف تؤدي هذه الآليات إلى فرط الحساسية لمستقبلات الألم. ومع ذلك ، تواجه النماذج في المختبر التحدي المتمثل في ترجمة الفعالية إلى البشر. لمواجهة هذا التحدي ، تم تطوير نموذج ذي صلة من الناحية الفسيولوجية والتشريحية في المختبر لثقافة العقد الجذرية الظهرية السليمة (DRGs) في ثلاث حجرات معزولة في صفيحة 48 بئرا. يتم حصاد DRGs الأولية من فئران Sprague Dawley البالغة بعد القتل الرحيم الإنساني. يتم قطع جذور الأعصاب الزائدة ، ويتم تقطيع DRG إلى أحجام مناسبة للثقافة. ثم تزرع DRGs في الهلاميات المائية الطبيعية ، مما يتيح نموا قويا في جميع المقصورات. يوفر هذا النظام متعدد الأجزاء عزلا تشريحيا لأجسام خلايا DRG من الخلايا العصبية ، وأنواع الخلايا ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ، والخصائص الميكانيكية لدراسة التفاعلات بين الخلايا العصبية والمناعية. وبالتالي ، توفر منصة الثقافة هذه أداة قيمة للتحقيق في استراتيجيات عزل العلاج ، مما يؤدي في النهاية إلى تحسين نهج الفحص للتنبؤ بالألم.

Introduction

الألم المزمن هو السبب الرئيسي للإعاقة وفقدان العمل على مستوى العالم¹. يؤثر الألم المزمن على حوالي 20٪ من البالغين على مستوى العالم ويفرض عبئا اجتماعيا واقتصاديا كبيرا² ، حيث تقدر التكاليف الإجمالية بين 560 و 635 مليار دولار كل عام في الولايات المتحدة³.

الميزة الطرفية الرئيسية التي يظهرها مرضى الألم المزمن هي انخفاض عتبة تحفيز الأعصاب ، مما يؤدي إلى أن يكون الجهاز العصبي أكثر استجابة للمنبهات ^4,5. يمكن أن تؤدي عتبة التحفيز المنخفضة إلى استجابة مؤلمة لمحفز غير مؤلم سابقا (ألم خيفي) أو استجابة عالية لمحفز مؤلم (فرط....

Protocol

تم إجراء حصاد DRG وفقا للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في جامعة نبراسكا لينكولن. تم استخدام إناث فئران Sprague Dawley التي تتراوح أعمارها بين 12 أسبوعا (~ 250 جم) للدراسة. يتم سرد تفاصيل والكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. تصنيع وتجميع جهاز متعدد الأجزاء

1. تصميم بمساعدة الكمبيوتر وطباعة 3D للجهاز متعدد الأجزاء
   ملاحظة: يتكون جهاز MC من ثلاث حجرات لعزل أجسام خلايا DRG والخلايا العصبية (الشكل 2A). جهاز MC غير متوفر تجاريا ؛ ومع ذلك ، يتم توفير ملف STL هنا (ملف الترميز التكميلي 1) لتمكين الطباعة ثلاثية الأبعاد. تستغرق طباعة M....

النتائج

وصف البروتوكول الحالي تقنية لحصاد وتربية DRG من فئران Sprague Dawley البالغة في جهاز متعدد الأجزاء (MC). كما هو موضح في الشكل 1 ، تم قطع DRG التي تم حصادها من الفئران البالغة وتقطيعها إلى ~ 0.5 مم. ثم تم تضمين DRGs المشذبة والمقطوعة في هيدروجيل في منطقة سوما لجهاز MC (الشك.......

Discussion

يحدد هذا البروتوكول طريقة لحصاد Sprague Dawley DRGs البالغة واستزراعها في الهلاميات المائية الطبيعية 3D. على عكس هذه الطريقة ، تتضمن الأساليب الأخرى لحصاد DRGs من الفئران والجرذان عزل العمود الفقري. يتم خفض العمود الفقري المستأصل إلى النصف ، ويتم إزالة الحبل الشوكي لفضح DRGs^23،

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Fine Science Tools	11252-00	For trimming and cutting DRG
10x DMEM	MilliporeSigma	D2429
1x PBS (autoclaved)	Prepared in lab		7.3 - 7.5 pH
24 well plates	VWR	82050-892	To temporarily store harvested and cut DRGs
3 mL Syringe sterile, single use	BD	309657
48 well plates	Greiner Bio-One	677180
60 mm Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713A	To hold media for trimming and cutting
Aluminium foil	Fisherbrand	01-213-104
B27 Plus 50x	ThermoFisher	17504044	For DRG media
Collagen type I	Ibidi	50205
Curved cup Friedman Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16221-14	For dissection
Dumont #3 forceps	Fine Science Tools	11293-00	For dissection
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	16000044	For DRG media
Form cure	Form Labs		curing agent
Form wash	Form Labs		To wash excess resins off MC
Glass bead sterilizer	Fisher Scientific	NC9531961
Glass vials (8 mL)	DWK Life Sciences (Wheaton)	224724
GlutaMax	ThermoFisher	35050-061	For DRG media
HEPES (1M)	Millipore Sigma	H0887
High temp V2 resin	FormLabs	FLHTAM02
Hyaluronic Acid Sodium Salt	MilliporeSigma	53747	Used to make MAHA
Irgacure	MilliporeSigma	410896
Laminin	R&D Systems	344600501
Large blunt-nose scissors	Militex	EG5-26	For dissection
Large forceps (serrated tips)	Militex	9538797	For dissection
Large sharp-nosed scissors	Fine Science Tools	14010-15	For dissection
Low Retention pipette tips	Fisher Scientific	02-707-017	For pipetting collagen and MAHA
Methacrylated hyaluronic acid (MAHA)	Prepared in lab	N/A	85 - 115 % methacrylation
Nerve Growth Factor (NGF)	R&D Systems	556-NG-100	For DRG media
Neurobasal A Media	ThermoFisher	10888022	For DRG media
Parafilm	Bemis	PM996
Parafilm	Bemis	PM996
Penicillin/Streptomycin (PS)	EMD Millipore	516106	For DRG media
pH test strips	VWR International	BDH35309.606
Pipette tips (1000 µL)	USA Scientific	1111-2021
Preform 3.23.1 software	Formslab		To upload STL file
Rat	Charles River
Resin 3D printer	Form Labs	Form 3L	3D printing MC device
Small sharp-nosed scissors	Fine Science Tools	14094-11	For dissection
Sodium bicarbonate	MilliporeSigma	S6014
Straight cup rongeur	Fine Science Tools	16004-16	For dissection
Straight edge spring scissors	Fine Science Tools	15024-10	For dissection
Surgical Scaplel blade (No. 10)	Fisher Scientific	22-079-690
Syring filters, PES (0.22 µm)	Celltreat	229747
Tiny spring scissors	World Precision Instruments	14003	For trimming and cutting DRG
UV lamp	Analytik Jena US		To photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2)