Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوفر هذا البروتوكول تقنية لحصاد وزراعة العقدة الجذرية الظهرية المزروعة (DRG) من فئران Sprague Dawley البالغة في جهاز متعدد الأجزاء (MC).

Abstract

الميزة العصبية الطرفية الأكثر شيوعا للألم هي انخفاض عتبة التحفيز أو فرط الحساسية للأعصاب الطرفية من العقد الجذرية الظهرية (DRG). يرتبط أحد الأسباب المقترحة لفرط الحساسية هذا بالتفاعل بين الخلايا المناعية في الأنسجة المحيطية والخلايا العصبية. قدمت النماذج في المختبر المعرفة الأساسية في فهم كيف تؤدي هذه الآليات إلى فرط الحساسية لمستقبلات الألم. ومع ذلك ، تواجه النماذج في المختبر التحدي المتمثل في ترجمة الفعالية إلى البشر. لمواجهة هذا التحدي ، تم تطوير نموذج ذي صلة من الناحية الفسيولوجية والتشريحية في المختبر لثقافة العقد الجذرية الظهرية السليمة (DRGs) في ثلاث حجرات معزولة في صفيحة 48 بئرا. يتم حصاد DRGs الأولية من فئران Sprague Dawley البالغة بعد القتل الرحيم الإنساني. يتم قطع جذور الأعصاب الزائدة ، ويتم تقطيع DRG إلى أحجام مناسبة للثقافة. ثم تزرع DRGs في الهلاميات المائية الطبيعية ، مما يتيح نموا قويا في جميع المقصورات. يوفر هذا النظام متعدد الأجزاء عزلا تشريحيا لأجسام خلايا DRG من الخلايا العصبية ، وأنواع الخلايا ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ، والخصائص الميكانيكية لدراسة التفاعلات بين الخلايا العصبية والمناعية. وبالتالي ، توفر منصة الثقافة هذه أداة قيمة للتحقيق في استراتيجيات عزل العلاج ، مما يؤدي في النهاية إلى تحسين نهج الفحص للتنبؤ بالألم.

Introduction

الألم المزمن هو السبب الرئيسي للإعاقة وفقدان العمل على مستوى العالم1. يؤثر الألم المزمن على حوالي 20٪ من البالغين على مستوى العالم ويفرض عبئا اجتماعيا واقتصاديا كبيرا2 ، حيث تقدر التكاليف الإجمالية بين 560 و 635 مليار دولار كل عام في الولايات المتحدة3.

الميزة الطرفية الرئيسية التي يظهرها مرضى الألم المزمن هي انخفاض عتبة تحفيز الأعصاب ، مما يؤدي إلى أن يكون الجهاز العصبي أكثر استجابة للمنبهات 4,5. يمكن أن تؤدي عتبة التحفيز المنخفضة إلى استجابة مؤلمة لمحفز غير مؤلم سابقا (ألم خيفي) أو استجابة عالية لمحفز مؤلم (فرط التألم)6. علاجات الألم المزمن الحالية لها فعالية محدودة ، وغالبا ما تفشل العلاجات التي تنجح في النماذج الحيوانية في التجارب البشرية بسبب الاختلافات الميكانيكية في مظاهر الألم7. النماذج في المختبر التي يمكن أن تحاكي بدقة أكبر آليات التحسس المحيطي لديها القدرة على زيادة ترجمة العلاجات الجديدة 8,9. علاوة على ذلك ، من خلال نمذجة الجوانب الرئيسية للأعصاب الحساسة في نظام الثقافة ، يمكن للباحثين تطوير فهم أعمق للآليات التي تدفع العتبات المنخفضة وتحديد أهداف علاجية جديدة تعكسها10.

ستتضمن المنصات المثالية في المختبر أو الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة الفصل المادي للخلايا العصبية البعيدة وجسم خلية الجذر الظهري (DRG) ، وبيئة خلوية ثلاثية الأبعاد (3D) ، ووجود خلايا دعم أصلية لتقليدها عن كثب في ظروف الجسم الحي . ومع ذلك ، تظهر ورقة حديثة من قبل Caparaso et al.11 أن منصات ثقافة DRG الحالية تفتقر إلى واحدة أو أكثر من هذه الميزات الرئيسية ، مما يجعلها غير كافية في التكرار في ظروف الجسم الحي . على الرغم من سهولة إعداد هذه المنصات ، إلا أنها لا تحاكي الأساس البيولوجي للتوعية المحيطية وبالتالي قد لا تترجم إلى فعالية في الجسم الحي . لمعالجة هذا القيد ، تم تطوير نموذج ذي صلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر لثقافة العقد الجذرية الظهرية (DRG) داخل مصفوفة هيدروجيل مع ثلاث حجرات معزولة للسماح بعزل السائل الصدغي للأعصاب وأجسام خلايا DRG11. يقدم هذا النموذج أهمية فسيولوجية وتشريحية ، والتي لديها القدرة على دراسة التحسس المحيطي للخلايا العصبية في المختبر.

يرجع الاهتمام المتزايد باستخدام نباتات DRG في ثقافة 3D إلى قدرتها على تسهيل نمو الخلايا العصبية القوي ، والذي يعمل كمؤشر غير مباشر على جدوى DRG12. في حين أن نباتات DRG الأولية لحديثي الولادة أو الجنينية تستخدم في الغالب في منصات الثقافة المختبرية الحالية13,14 ، فإن استخدام النباتات من القوارض البالغة يوفر نموذجا أفضل لعلم وظائف الأعضاء العصبية الناضجة ، والذي يحاكي عن كثب فسيولوجيا DRG البشرية مقارنة بالنباتات من القوارض الوليدية أو الجنينية15. تشير Explant DRGs إلى الحفاظ على الأنسجة الخلوية والجزيئية لأنسجة DRG الأصلية ، في المقام الأول عن طريق الحفاظ على خلايا الدعم غير العصبية الأصلية. هنا ، يصف هذا البروتوكول منهجية حصاد وزراعة نباتات DRG من فئران Sprague Dawley البالغة في جهاز متعدد الأجزاء (MC) (الشكل 1).

وقد أظهرت فعالية في زراعة DRGs من العمود الفقري العنقي والصدري والقطني مع عدم وجود اختلافات ملحوظة في نمو الخلايا العصبية. بالنسبة لهذا التطبيق ، كان الهدف هو استنباط نمو الخلايا العصبية في الأجزاء الخارجية للجهاز. لذلك ، لم تميز هذه المقالة بين مستويات DRG. ومع ذلك ، إذا لزم الأمر لتجربة معينة ، يمكن تخصيص مستوى DRG لتلبية احتياجات المجربين. يوجد حاليا نماذج ثقافة مجزأة أخرى للثقافة ثلاثية الأبعاد ل DRGs16 ، ومع ذلك ، لا تحتوي هذه الأجهزة على خلايا دعم أصلية غير عصبية محفوظة ، والتي يمكن أن تحد من الترجمة. يعد الحفاظ على البنية الأصلية ل DRGs المحصودة أمرا مهما لأنه يضمن الاحتفاظ بخلايا الدعم غير العصبية ، والتي تعد تفاعلاتها مع الخلايا العصبية DRG ضرورية للحفاظ على الخصائص الوظيفية لهذه الخلايا العصبية. شاركت العديد من الدراسات في فصل DRGs مع الخلايا العصبية غير الأصلية مثل خلايا Schwann لتعزيز الميالين للخلايا العصبية17،18،19.

Protocol

تم إجراء حصاد DRG وفقا للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في جامعة نبراسكا لينكولن. تم استخدام إناث فئران Sprague Dawley التي تتراوح أعمارها بين 12 أسبوعا (~ 250 جم) للدراسة. يتم سرد تفاصيل والكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. تصنيع وتجميع جهاز متعدد الأجزاء

  1. تصميم بمساعدة الكمبيوتر وطباعة 3D للجهاز متعدد الأجزاء
    ملاحظة: يتكون جهاز MC من ثلاث حجرات لعزل أجسام خلايا DRG والخلايا العصبية (الشكل 2A). جهاز MC غير متوفر تجاريا ؛ ومع ذلك ، يتم توفير ملف STL هنا (ملف الترميز التكميلي 1) لتمكين الطباعة ثلاثية الأبعاد. تستغرق طباعة MC يوما واحدا (1) حتى تكتمل.
  2. قم بتحميل ملف STL الخاص ب MC إلى طابعة Resin 3D باستخدام برنامج متوافق.
    ملاحظة: المادة المثالية للطباعة هي راتنج عالي الحرارة. الميزة الرئيسية لاستخدام الراتنج عالي الحرارة هو أنه متوافق حيويا ويمكن تعقيمه وإعادة استخدامه. يمكن أيضا استخدام طابعة ثلاثية الأبعاد لمعالجة الضوء الرقمي (DLP) أو طابعات ثلاثية الأبعاد أخرى لطباعة الجهاز.
  3. انقل الأجهزة المطبوعة إلى محلول غسيل لمدة 30 دقيقة في الأيزوبروبانول (>96٪) لإزالة الراتنج المتبقي من سطح جهاز MC المطبوع.
  4. بعد معالجة الأجهزة على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة باستخدام عامل معالجة متاح تجاريا (انظر جدول المواد). يعزز عامل المعالجة الخواص الميكانيكية لجهاز MC المطبوع عن طريق تعريضه لدرجة الحرارة والأشعة فوق البنفسجية.
  5. عالج أجهزة MC حراريا في فرن على حرارة 160 درجة مئوية لمدة 180 دقيقة.
  6. تعقيم الأجهزة باستخدام الأوتوكلاف لمدة 45 دقيقة في دورة الجاذبية.

2. إعداد هيدروجيل

  1. توليف حمض الهيالورونيك ميثاكريلات (MAHA ، 85٪ -115٪ ميثاكريلاسيون) والتوصيف باستخدام بروتوكول وصفه Seidlits et al.20.
    ملاحظة: لدعم نمو DRGs ، يشيع استخدام الهلاميات المائية الثلاثية المكونة من حمض الهيالورونيك من النوع الأول والكولاجين من النوع الأول واللامينين. تشير النتائج إلى أن DRGs تنمو عادة في MAHA ، تتراوح من 1.25-2.5 مجم / مل والكولاجين من 2.0-4.5 مجم / مل. بالنسبة للامينين ، وجد أن 0.75 مجم / مل يكفي لضمان نمو قوي ل DRGs. هنا ، طرق إنشاء هلام ثلاثي مع 1.25 مجم / مل MAHA و 4.5 مجم / مل كولاجين و 0.75 مجم / مل لامينين. يجب أن يتم تحضير هيدروجيل في خزانة تدفق رقائقي لتوفير مساحة عمل معقمة.

3. إعداد حل البادئ الضوئي

ملاحظة: من الضروري وجود بادئ ضوئي لربط MAHA تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. يستخدم بشكل شائع في النسب المئوية من 0.3٪ إلى 0.6٪.

  1. تحضير محلول البادئ الضوئي قبل 3 أيام من حصاد DRG.
  2. قم بتسخين حمام الماء الصوتنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل تحضير محلول البادئ الضوئي.
  3. من خلال العمل باستخدام تقنية التعقيم في غطاء التدفق ، قم بإعداد محلول بيكربونات الصوديوم 23.125 مجم / مل (NaHCO3) عن طريق إذابة محلول NaHCO3 في 5x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) -HEPES.
  4. في قنينة زجاجية ، امزج 0.6٪ وزن / حجم (وزن / حجم) بادئ ضوئي في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) بنسبة 20٪ حجم / حجم 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) و 80٪ حجم / حجم 5X محلول DMEM / HEPES.
  5. للحماية من الضوء ، لف القارورة الزجاجية بورق الألمنيوم. ومع ذلك ، تأكد من إزالة رقائق الألومنيوم قبل نقل القارورة إلى حمام مائي صوتنة ساخنة إلى 37 °C مع صوتنة بين 30-40 دقيقة.
    ملاحظة: يجب حماية محلول البادئ الضوئي من الضوء لأنه يمكن أن يتحلل إلى جذور ويبدأ عملية البلمرة عند تعرضه للضوء21.
  6. مرشح معقم للمحلول باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر في قنينة زجاجية معقمة جديدة.

4. انحلال حمض الهيالورونيك الميثاكريلات

  1. قم بإذابة حمض الهيالورونيك الميثاكريلاتي (المحضر في الخطوة 2) في نفس اليوم الذي يتم فيه تحضير محلول البادئ الضوئي (الخطوة 3).
  2. ضع MAHA المجمد المجفف بالتجميد في مجفف لمدة 15 دقيقة للوصول إلى درجة حرارة الغرفة.
  3. العمل في غطاء التدفق الصفحي واستخدام تقنية الوزن المعقم ، قم بوزن MAHA المجفف بالتجميد في قنينة زجاجية.
  4. أضف الحجم اللازم من محلول البادئ الضوئي المصفى إلى MAHA للوصول إلى تركيز MAHA المطلوب. تركيز الجل النهائي الشائع هو 1.25 مجم / مل MAHA و 4.5 مجم / مل كولاجين.
  5. أغلق الغطاء بغشاء مانع للتسرب في المختبر ، ولف القارورة الزجاجية بورق الألمنيوم ، وضعها على لوحة شاكر مدارية في درجة حرارة الغرفة حتى تذوب تماما (عادة 3 أيام). في بعض الأحيان ، دوامة الحل لتفكيك كتل كبيرة من MAHA لضمان حل موحد من MAHA.

5. تجميع الجهاز

  1. ضع جهاز MC في طبق من 48 بئرا قبل يوم من حصاد DRG.
  2. ضع خطا رفيعا من هلام السيليكون في الأخدود أسفل جهاز MC (الشكل 2 ب) باستخدام حقنة سعة 3 مل. سيساعد ذلك الجهاز على التعلق بإحكام بلوحة البئر.
  3. بمساعدة ملقط # 3 ، ضع جهاز MC برفق في بئر لوحة 48 بئرا ، كما هو موضح في الشكل 2C.
    ملاحظة: يمكن تعديل حجم الجهاز ليناسب التطبيق المقصود ، ويمكن استخدام لوحة بحجم مختلف إذا رغبت في ذلك. يمكن إعادة استخدام الأجهزة. لإعادة الاستخدام ، يجب غسل الهيدروجيل برفق من جميع الأنفاق ، ويجب استخدام أخدود التحميل الموجود أسفل الجهاز مع 70٪ من الإيثانول مع تحريض لطيف. بعد اكتمال ذلك ، يمكن إعادة تعقيم الأجهزة للتعقيم قبل الاستخدام.

6. إعداد

  1. الأوتوكلاف جميع أدوات التشريح اللازمة قبل بدء الحصاد.
  2. الحصول على ذكر أو أنثى بالغ Sprague Dawley الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 12-20 أسبوعا. جنس الفئران لا يؤثر على نمو DRG.
  3. القتل الرحيم للفأر وفقا لبروتوكول IACUC المعتمد باستخدام جرعة زائدة من CO2 كطريقة أساسية للقتل الرحيم وثقب استرواح الصدر الثنائي كطريقة ثانوية للقتل الرحيم وفقا لإرشادات الجمعية الطبية البيطريةالأمريكية 22.
  4. ضع الجرذ على وسادة سفلية معقمة على طاولة تشريح مع الجانب البطني لأسفل. رش الفراء مع 70 ٪ من الإيثانول.

7. حصاد العقد الجذرية الظهرية (DRG)

  1. تحضير وسائط التشذيب التي تحتوي على 86٪ وسائط عصبية قاعدية A ، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 1٪ بنسلين ستربتومايسين (PS) ، و 1٪ جلوتامين ، و 2٪ B27 بالإضافة إلى 50x ونقلها إلى صفيحة 24 بئرا. سيتم استخدام هذه الوسائط ولوحة البئر للتخزين المؤقت ل DRGs المحصودة قبل تضمينها في الهيدروجيل.
  2. ارتد معطف المختبر والقناع الجراحي وغطاء المحرك ونظارات السلامة والقفازات.
  3. باستخدام مقص كبير للأنف الحاد ، قم بقطع الجلد عند قاعدة العمود الفقري العنقي ثم أسفل طول العمود الفقري.
  4. لمزيد من تصريف الدم بعيدا عن القناة الشوكية ، قم بقطع أسفل لوحي الكتف ونزولا عبر العضلات لقطع الأوعية الدموية الرئيسية.
  5. استخدم مقصا كبيرا حاد الأنف لقطع العضلات بعيدا عن العمود الفقري. مسح أكبر قدر ممكن من العضلات لتصور العمود الفقري.
  6. إزالة الأجزاء الظهرية والجانبية من الفقرات. استخدم مقص Rongeur المستقيم ومقص الأنف الحاد لإزالة العمليات الشائكة والعرضية للفقرات ، بدءا من نهاية عنق الرحم والتحرك نحو النهاية القطنية.
  7. إزالة الحبل الشوكي. استخدم مقص الأنف الحاد الصغير لقطع جذور الأعصاب المتصلة ب DRGs بعناية على طول جانبي الحبل الشوكي. قطع الطرف العنقي للحبل الشوكي وارفعه بعناية من القناة الشوكية تدريجيا ، مع قطع أي جذور عصبية متبقية متصلة ب DRGs.
    ملاحظة: المهارات الحركية الدقيقة ضرورية لضمان عدم قطع جسم DRG في هذه العملية.
  8. لفضح DRGs ، استخدم Rongeur المنحني لإزالة المزيد من الأجزاء الجانبية من الفقرات. اسحب للخارج من خط الوسط ، بالتناوب مع الجانبين. احرص على عدم اختراق جسم DRG لأنه قد يتسبب في تلف أجسام الخلايا والمحاور.
  9. باستخدام ملقط #3 ومقص زنبركي مستقيم الحافة ، قم بإزالة DRGs بين كل مستوى من الفقرات. أمسك جذور الأعصاب الشوكية من DRG ، واسحبها بعناية من الجيب ، وقطع الطرف الآخر من العصب الشوكي. احرص على عدم الإمساك بجسم DRG مباشرة.
  10. ضع DRGs في آبار صفيحة 24 بئرا (تحتوي على وسائط التشذيب ، الخطوة 7.1) على الجليد.
  11. بعد جمع جميع DRGs ، قم بتنظيف مساحة العمل ، ووضع الذبيحة في كيس الأوتوكلاف ، وتخزينها / التخلص منها بشكل مناسب وفقا لبروتوكول IACUC.

8. DRG التشذيب والقطع

  1. املأ طبق بتري 60 مم على مقعد نظيف بوسائط التشذيب (الخطوة 7.1). قم بإعداد نطاق التشريح ومعقم الخرزة الزجاجية وضع صندوق أدوات معقم بأدوات التشذيب (# 3 ملقط ومقص زنبركي مستقيم الحافة) بجانب المنظار.
  2. تحت نطاق التشريح ، قم بإزالة الأنسجة الزائدة حول DRG وتقليم جذور الأعصاب بالقرب من جسم DRG (عادة ما تكون أغمق قليلا من الأعصاب المحيطة).
  3. املأ طبق بتري ثان 60 مم بوسائط طازجة. تحت نطاق التشريح ، قم بقطع DRGs المشذبة إلى حوالي 0.5 مم (أو بين 0.5 مم و 0.8 مم). يتم وضع المسطرة تحت طبق بتري أثناء القطع للحصول على الحجم المقدر الصحيح لقطع DRGs.
  4. نقل قطع DRGs إلى طبق جديد من 24 بئرا مع الوسائط على الجليد.
    ملاحظة: يجب أن يتم تقليم DRG وقطعه وتضمينه في خزانة تدفق رقائقي لتوفير مساحة عمل معقمة. في حالة عدم وجود خزانة تدفق رقائقي ، يجب مراعاة تقنيات التعقيم ، مع الحد الأدنى من معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) الموصى بها (معطف المختبر ، والأقنعة ، والنظارات الواقية ، والقفازات) وتعقيم جميع الأدوات طوال العملية للتخفيف من التلوث المحتمل.

9. تحييد الكولاجين

  1. تحييد الكولاجين في نفس يوم حصاد DRG بعد تقليم وقطع DRGs.
  2. العمل على الجليد ، ماصة ~ 8.16٪ ماء فائق النقاء ، ~ 1.84٪ 1 م هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) ، ~ 10٪ 10x PBS ، و ~ 80٪ من الكولاجين من الحجم الكلي للمحلول في قارورة زجاجية.
  3. امزج ببطء باستخدام طرف ماصة معقم منخفض الاحتفاظ بكولاجين الماصة (عادة ما يضاف أخيرا) في الخليط. تأكد من إبقاء طرف الماصة في المحلول أثناء الخلط لتجنب تكوين فقاعات. تحقق من درجة الحموضة للكولاجين المحايد باستخدام شرائط الأس الهيدروجيني للتأكد من أنها ~ 7.
    ملاحظة: يمكن حفظ الكولاجين المحايد على الثلج لمدة 2-3 ساعات دون التبلور. لذلك ، يجب إجراء تصنيع الهيدروجيل على وجه السرعة بمجرد تحييد الكولاجين.

10. تصنيع هيدروجيل

  1. العمل على الثلج ، ماصة لامينين (إلى تركيز نهائي من 0.75 ملغ / مل) و 1x PBS في قارورة زجاجية.
  2. باستخدام أطراف ماصة معقمة منخفضة الاحتفاظ ، قامت الماصة بتحييد الكولاجين ومحلول MAHA في الخليط للوصول إلى التركيز المطلوب.
  3. تخلط ببطء وتحقق من درجة الحموضة في هيدروجيل الناتج (يجب أن يكون ~ 7).

11. تضمين DRG

  1. قم بإجراء تضمين متعدد المقصورات.
    1. ماصة 65.1 ميكرولتر و 52.8 ميكرولتر من هيدروجيل مختلط مسبقا في مقصورات سوما ونيوريت ، على التوالي.
      ملاحظة: يفترض هذا استخدام أجهزة MC في لوحة 48 بئرا. يمكن تغيير وحدات التخزين هذه بناء على حجم جهاز MC المستخدم.
    2. قم بتضمين DRGs المقطوعة برفق في حجرة سوما (الشكل 2 أ) ، مع التأكد من أنها لا تخدش الجزء السفلي من لوحة البئر. ضع DRG في المنتصف حتى تنمو الخلايا العصبية في المقصورات المجاورة عبر الأنفاق.
    3. قم بربط الهيدروجيل الحراري في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أثناء حدوث ذلك ، قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية للإحماء.
    4. بعد التشابك الحراري ، تربط الأشعة فوق البنفسجية هيدروجيل لمدة 90 ثانية.
    5. أضف وسائط نمو DRG إلى الهيدروجيل و DRG وقم بإجراء تغيير كامل للوسائط بعد ساعة للتخلص من الآثار غير المتفاعلة أو المتبقية للبادئ الضوئي التي تستمر في الوسائط.
    6. قم بإجراء نصف تغيير للوسائط كل 3 أيام وراقب نمو DRGs من خلال المشاهدة تحت المجهر.
    7. بعد ~ 4 أسابيع ، عندما تبدأ الخلايا العصبية DRG في النمو (الشكل 3A) ، التقط الصور باستخدام جهاز تصوير لوحة الفلورسنت وحدد طول الخلايا العصبية باستخدام FIJI (ImageJ).

12. التحكم في تضمين DRG

  1. ماصة 250 ميكرولتر من هيدروجيل في لوحة 48 بئر (بدون MC).
  2. ضع DRG المقطوع برفق في منتصف البئر وفي منتصف الطريق لأسفل في الهيدروجيل ، مع التأكد من أنه لا يخدش قاع لوحة البئر.
  3. قم بربط الهيدروجيل الحراري في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. ربط الأشعة فوق البنفسجية هيدروجيل لمدة 90 ثانية.
  5. أضف وسائط نمو DRG إلى الهيدروجيل و DRG وقم بإجراء تغيير كامل للوسائط بعد ساعة.
  6. قم بإجراء نصف تغيير الوسائط كل 3 أيام ومراقبة نمو DRG من خلال مشاهدته تحت المجهر.
  7. بعد ~ 4 أسابيع ، عندما تبدأ الخلايا العصبية DRG في النمو (الشكل 3 ب) ، التقط الصور باستخدام جهاز تصوير لوحة الفلورسنت.
    ملاحظة: أي مجهر برايت فيلد سيعمل للتصوير. المجهر الآلي القائم على اللوحة يجعل هذه العملية أسرع. يتم التحكم في التضمين في المواد الهلامية العادية بدون الجهاز لمقارنة نمو الخلايا العصبية DRG في الأجزاء المتعددة. بمجرد أن يتحقق المستخدمون من أن DRGs تنمو بشكل مشابه في MC والمواد الهلامية للتحكم ، فقد لا يحتاجون إلى تكرار المواد الهلامية للتحكم في كل مرة.

13. تصوير DRG

  1. التقط صورا ساطعة بتكبير 4x باستخدام جهاز تصوير لوحة الفلورسنت على نطاق من المسافات البؤرية لتصور جهاز DRG و MC بالكامل.
  2. اضبط سطوع الصورة وتباينها لتسهيل عرض الخلايا العصبية.
  3. احفظ الصورة كملف .tiff.

14. القياس الكمي العصبي DRG

  1. قم بتنزيل وتثبيت فيجي (ImageJ).
  2. افتح ImageJ. افتح ملف الصورة وتأكد من أن الملف أحادي اللون.
  3. تعزيز التباين بحيث تكون أصغر الخلايا العصبية مرئية. قم بذلك عن طريق فتح خيار السطوع والتباين باستخدام الاختصار Ctrl + Shift + C.
  4. اضبط منزلقات وحدة التحكم حسب الحاجة لتصور الخلايا العصبية ، وانقر فوق تطبيق للحصول على السطوع والتباين المطلوبين.
  5. افتح أداة تتبع الخلايا العصبية عن طريق فتح قائمة المكونات الإضافية ، وتحديد التجزئة ، والنقر فوق Simple Neurite Tracer.
  6. ابدأ تتبعا جديدا بالنقر فوق أحد طرفي الجهاز العصبي مباشرة مقابل جسم DRG.
  7. انقر فوق نقطة أخرى على طول العصبون لإضافة تتبع حتى يتم تتبع الخلايا العصبية من طرف إلى طرف. انقر فوق إنهاء المسار بعد تتبع العصب.
  8. قم بتحويل الطول المتتبع إلى وحدات حقيقية واحفظ النتائج عن طريق نسخها ولصقها في Excel.
  9. استخدم أداة الخط المستقيم في فيجي لرسم خط بنفس طول شريط المقياس (عدم ترك نهاية الخط) وانظر إلى قيمة الطول المرئية أسفل شريط الأدوات. يتم استخدام قيمة الطول للتحويل.
  10. قم بقياس طول ستة خلايا عصبية طويلة تمتد من جانبي DRG (الشكل 3C ، D) واحسب متوسط طول هذه الخلايا العصبية لإعطاء متوسط طول تمثيلي ل DRG ، كما هو موضح في الشكل 4.
    ملاحظة: تم اختبار التلوين المناعي على نباتات DRG في المواد الهلامية العادية لإظهار وجود خلايا دعم غير عصبية7. يتم تثبيت DRGs في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في درجة حرارة الغرفة ، ويتم غسلها ثلاث مرات باستخدام 1x PBS لمدة 15 دقيقة ، وتخزينها في 1x PBS عند 4 درجات مئوية حتى تلطيخ المناعة.
  11. بالنسبة للنباتات في أجهزة MC ، قم بإزالة جهاز MC واتبع نفس العملية الموضحة أعلاه7.

النتائج

وصف البروتوكول الحالي تقنية لحصاد وتربية DRG من فئران Sprague Dawley البالغة في جهاز متعدد الأجزاء (MC). كما هو موضح في الشكل 1 ، تم قطع DRG التي تم حصادها من الفئران البالغة وتقطيعها إلى ~ 0.5 مم. ثم تم تضمين DRGs المشذبة والمقطوعة في هيدروجيل في منطقة سوما لجهاز MC (الشك...

Discussion

يحدد هذا البروتوكول طريقة لحصاد Sprague Dawley DRGs البالغة واستزراعها في الهلاميات المائية الطبيعية 3D. على عكس هذه الطريقة ، تتضمن الأساليب الأخرى لحصاد DRGs من الفئران والجرذان عزل العمود الفقري. يتم خفض العمود الفقري المستأصل إلى النصف ، ويتم إزالة الحبل الشوكي لفضح DRGs23،

Disclosures

يعلن مؤلفو هذه الدراسة أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منحة NSF (2152065) وجائزة NSF CAREER (1846857). يود المؤلفون أن يشكروا جميع الأعضاء الحاليين والسابقين في Wachs Lab على المساهمة في هذا البروتوكول. تم عمل الرسوم البيانية في الشكل 1 في Biorender.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
#5 forcepsFine Science Tools11252-00For trimming and cutting DRG
10x DMEMMilliporeSigmaD2429
1x PBS (autoclaved)Prepared in lab7.3 - 7.5 pH
24 well platesVWR82050-892To temporarily store harvested and cut DRGs
3 mL Syringe sterile, single useBD309657
48 well platesGreiner Bio-One677180
60 mm Petri dishFisher ScientificFB0875713ATo hold media for trimming and cutting
Aluminium foilFisherbrand01-213-104
B27 Plus 50xThermoFisher17504044For DRG media
Collagen type IIbidi50205
Curved cup Friedman Pearson RongeurFine Science Tools16221-14For dissection
Dumont #3 forcepsFine Science Tools11293-00For dissection
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher16000044For DRG media
Form cureForm Labscuring agent
Form washForm LabsTo wash excess resins off MC
Glass bead sterilizerFisher ScientificNC9531961
Glass vials (8 mL)DWK Life Sciences (Wheaton)224724
GlutaMaxThermoFisher35050-061For DRG media
HEPES (1M)Millipore SigmaH0887
High temp V2 resinFormLabsFLHTAM02
Hyaluronic Acid Sodium SaltMilliporeSigma53747Used to make MAHA
IrgacureMilliporeSigma410896
LamininR&D Systems344600501
Large blunt-nose scissorsMilitexEG5-26For dissection
Large forceps (serrated tips)Militex9538797For dissection
Large sharp-nosed scissorsFine Science Tools14010-15For dissection
Low Retention pipette tipsFisher Scientific02-707-017For pipetting collagen and MAHA
Methacrylated hyaluronic acid (MAHA)Prepared in labN/A85 - 115 % methacrylation
Nerve Growth Factor (NGF)R&D Systems556-NG-100For DRG media
Neurobasal A MediaThermoFisher10888022For DRG media
ParafilmBemisPM996
ParafilmBemisPM996
Penicillin/Streptomycin (PS)EMD Millipore516106For DRG media
pH test stripsVWR InternationalBDH35309.606
Pipette tips (1000 µL)USA Scientific1111-2021
Preform 3.23.1 softwareFormslabTo upload STL file
RatCharles River
Resin 3D printerForm LabsForm 3L3D printing MC device
Small sharp-nosed scissorsFine Science Tools14094-11For dissection
Sodium bicarbonateMilliporeSigmaS6014
Straight cup rongeurFine Science Tools16004-16For dissection
Straight edge spring scissorsFine Science Tools15024-10For dissection
Surgical Scaplel blade (No. 10)Fisher Scientific22-079-690
Syring filters, PES (0.22 µm)Celltreat229747
Tiny spring scissorsWorld Precision Instruments14003For trimming and cutting DRG
UV lampAnalytik Jena USTo photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2)

References

  1. Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: A systematic analysis for the global burden of disease study 2015. Lancet. 388 (10053), 1545-1602 (2016).
  2. Goldberg, D. S., Mcgee, S. J. Pain as a global public health priority. BMC Public Health. 11 (1), 770 (2011).
  3. Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
  4. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  5. Im, H. J., et al. Alteration of sensory neurons and spinal response to an experimental osteoarthritis pain model. Arthritis Rheum. 62 (10), 2995-3005 (2010).
  6. Jensen, T. S., Finnerup, N. B. Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: Clinical manifestations and mechanisms. Lancet Neurol. 13 (9), 924-935 (2014).
  7. Berge, O. G. Predictive validity of behavioral animal models for chronic pain. Br J Pharmacol. 164 (4), 1195-1206 (2011).
  8. Anderson, W. A., Willenberg, A. R., Bosak, A. J., Willenberg, B. J., Lambert, S. Use of a capillary alginate gel (capgel™) to study the three-dimensional development of sensory nerves reveals the formation of a rudimentary perineurium. J Neurosci Methods. 305, 46-53 (2018).
  9. Mohammed Izham, N. A., et al. Exploring the possibilities of using in vitro model for neuropathic pain studies. Neurosci Res Notes. 5, 144 (2022).
  10. Park, S. E., et al. A three-dimensional in vitro model of the peripheral nervous system. NPG Asia Mater. 13 (1), 2 (2021).
  11. Caparaso, S. M., Redwine, A. L., Wachs, R. A. Engineering a multi-compartment in vitro model for dorsal root ganglia phenotypic assessment. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 111 (11), 1903-1920 (2023).
  12. Krug, A. K., et al. Evaluation of a human neurite growth assay as specific screen for developmental neurotoxicants. Arch Toxicol. 87 (12), 2215-2231 (2013).
  13. F, M., et al. Extracellular matrix stiffness negatively affects axon elongation, growth cone area and F-actin levels in a collagen type I 3D culture. J Tissue Eng Regen Med. 16 (2), 151-162 (2021).
  14. Spearman, B. S., et al. Tunable methacrylated hyaluronic acid-based hydrogels as scaffolds for soft tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. 108 (2), 279-291 (2020).
  15. Zhu, W., Oxford, G. S. Differential gene expression of neonatal and adult DRG neurons correlates with the differential sensitization of TRPV1 responses to nerve growth factor. Neurosci Lett. 500 (3), 192-196 (2011).
  16. Van De Wijdeven, R., et al. Structuring a multi-nodal neural network in vitro within a novel design microfluidic chip. Biomed Microdevices. 20, 1-8 (2018).
  17. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  18. Ng, B. K., Chen, L., Mandemakers, W., Cosgaya, J. M., Chan, J. R. Anterograde transport and secretion of brain-derived neurotrophic factor along sensory axons promote Schwann cell myelination. J Neurosci. 27 (28), 7597-7603 (2007).
  19. Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent drg neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
  20. Seidlits, S. K., et al. The effects of hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties on neural progenitor cell differentiation. Biomaterials. 31 (14), 3930-3940 (2010).
  21. Tomal, W., Ortyl, J. Water-soluble photoinitiators in biomedical applications. Polymers. 12 (5), 1073 (2020).
  22. Leary, S., et al. Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. Veterinary Medical Association. , (2013).
  23. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Res Notes. 9 (1), 82 (2016).
  24. Naveed, M., et al. Simple methods of dissection protocols for the rapid isolation of rat dorsal root ganglia under the non-microscopic condition. Neuroscience Research Notes. 6 (2), 212 (2023).
  25. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
  26. Bai, X., et al. A high-resolution anatomical rat atlas. J Anatomy. 209 (5), 707-708 (2006).
  27. Bian, L., et al. The influence of hyaluronic acid hydrogel crosslinking density and macromolecular diffusivity on human MSC chondrogenesis and hypertrophy. Biomaterials. 34 (2), 413-421 (2013).
  28. Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. Human dorsal root ganglia. Front Cell Neurosci. 13, 271 (2019).
  29. Schwaid, A. G., Krasowka-Zoladek, A., Chi, A., Cornella-Taracido, I. Comparison of the rat and human dorsal root ganglion proteome. Scientific Rep. 8 (1), 13469 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

DRG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved