在多室装置中收获、包埋和培养背根神经节以研究外周神经元特征

摘要

该协议提供了一种在多隔室 （MC） 装置中从成年 Sprague Dawley 大鼠收获和培养外植背根神经节 （DRG） 的技术。

摘要

疼痛最常见的周围神经元特征是刺激阈值降低或背根神经节 （DRG） 终末神经超敏反应。这种超敏反应的一个拟议原因与外周组织中的免疫细胞和神经元之间的相互作用有关。 体外 模型为理解这些机制如何导致伤害感受器超敏反应提供了基础知识。然而， 体外 模型面临着将疗效转化为人类的挑战。为了应对这一挑战，已经开发了一种生理学和解剖学相关的 体外 模型，用于在 48 孔板的三个孤立隔室中培养完整的背根神经节 （DRG）。初级 DRG 是在人道安乐死后从成年 Sprague Dawley 大鼠身上收获的。修剪多余的神经根，并将 DRG 切成合适的大小进行培养。然后，DRG 在天然水凝胶中生长，从而在所有隔室中实现稳健生长。这种多室系统提供了从神经突、生理相关细胞类型和机械特性中分离 DRG 细胞体的解剖学相关分离，以研究神经细胞和免疫细胞之间的相互作用。因此，该培养平台为研究治疗隔离策略提供了有价值的工具，最终导致一种改进的预测疼痛的筛查方法。

引言

慢性疼痛是全球残疾和失业的主要原因¹。慢性疼痛影响着全球约 20% 的成年人，并造成了巨大的社会和经济负担²，在美国，每年的总成本估计在 560 至 6350 亿美元之间³。

慢性疼痛患者表现出的主要外周特征是神经刺激阈值降低，这导致神经系统对刺激更敏感 ^4,5。降低的刺激阈值会导致对先前非痛苦刺激的痛苦反应（痛觉异常）或对痛苦刺激的反应增强（痛觉过敏）⁶。目前的慢性疼痛治疗疗效有限，由于疼痛表现的机制差异，在动物模型中成功的治疗往往在人体试验中失败⁷。能够更准确地模拟外周敏化机制的体外模型有可能增加新疗法的翻译 ^8,9。此外，通过对培养系统中致敏神经的关键方面进行建模，研究人员可以更深入地了解驱动降低阈值的机制，并确定逆转阈值的新治疗靶点¹⁰。

理想的 体外 平台或微生....

研究方案

DRG 收获是按照内布拉斯加大学林肯分校的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 进行的。该研究使用 12 周龄 （~250 g） 的雌性 Sprague Dawley 大鼠。材料 表中列出了研究中使用的动物、试剂和设备的详细信息。

1. 多隔室器件制造和组装

1. 多隔间设备的计算机辅助设计和 3D 打印
   注意：MC 设备由三个隔室组成，用于分离 DRG 细胞体和神经突（图 2A）。MC 设备没有市售;但是，此处提供了 STL 文件（补充编码文件 1）以启用 3D 打印。打印 MC 需要一 （1） 天才能完成。
2. 使用兼容软件将 MC 的 STL 文件上传到 Resin 3D 打印机。
   注意：理想的打印材料是高温树脂。使用高温树脂的一个关键优点是它具有生物相容性，并且可以高压灭菌和重复使用。数字光处理 （DLP） 3D 打印机或其他 3D 打印机也可用于打印设备。
3. 将打印的设备转移到异丙醇 （>96%） 的洗涤溶液中 30 分钟，以去除打印的 MC 设备表面的残留树脂。
4. 使用市售固化剂在 80 °C 下对设备后固化 120 分钟（参见 材料表）。固化剂通过暴露于温度和紫外线下来增强印刷 MC 器件....

讨论

该协议概述了一种收获成年 Sprague Dawley DRG 并在 3D 天然水凝胶中培养它们的方法。与这种方法相反，从小鼠和大鼠中收集 DRG 的其他方法包括分离脊柱。切除的脊柱减半，并切除脊髓以露出 DRG 23,24,25。脊髓损伤会限制血液供应，从而影响 DRG 和内部神经元²⁶。这降低了 DRG 的活性，使手术方法更合适。此外，还.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Fine Science Tools	11252-00	For trimming and cutting DRG
10x DMEM	MilliporeSigma	D2429
1x PBS (autoclaved)	Prepared in lab		7.3 - 7.5 pH
24 well plates	VWR	82050-892	To temporarily store harvested and cut DRGs
3 mL Syringe sterile, single use	BD	309657
48 well plates	Greiner Bio-One	677180
60 mm Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713A	To hold media for trimming and cutting
Aluminium foil	Fisherbrand	01-213-104
B27 Plus 50x	ThermoFisher	17504044	For DRG media
Collagen type I	Ibidi	50205
Curved cup Friedman Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16221-14	For dissection
Dumont #3 forceps	Fine Science Tools	11293-00	For dissection
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	16000044	For DRG media
Form cure	Form Labs		curing agent
Form wash	Form Labs		To wash excess resins off MC
Glass bead sterilizer	Fisher Scientific	NC9531961
Glass vials (8 mL)	DWK Life Sciences (Wheaton)	224724
GlutaMax	ThermoFisher	35050-061	For DRG media
HEPES (1M)	Millipore Sigma	H0887
High temp V2 resin	FormLabs	FLHTAM02
Hyaluronic Acid Sodium Salt	MilliporeSigma	53747	Used to make MAHA
Irgacure	MilliporeSigma	410896
Laminin	R&D Systems	344600501
Large blunt-nose scissors	Militex	EG5-26	For dissection
Large forceps (serrated tips)	Militex	9538797	For dissection
Large sharp-nosed scissors	Fine Science Tools	14010-15	For dissection
Low Retention pipette tips	Fisher Scientific	02-707-017	For pipetting collagen and MAHA
Methacrylated hyaluronic acid (MAHA)	Prepared in lab	N/A	85 - 115 % methacrylation
Nerve Growth Factor (NGF)	R&D Systems	556-NG-100	For DRG media
Neurobasal A Media	ThermoFisher	10888022	For DRG media
Parafilm	Bemis	PM996
Parafilm	Bemis	PM996
Penicillin/Streptomycin (PS)	EMD Millipore	516106	For DRG media
pH test strips	VWR International	BDH35309.606
Pipette tips (1000 µL)	USA Scientific	1111-2021
Preform 3.23.1 software	Formslab		To upload STL file
Rat	Charles River
Resin 3D printer	Form Labs	Form 3L	3D printing MC device
Small sharp-nosed scissors	Fine Science Tools	14094-11	For dissection
Sodium bicarbonate	MilliporeSigma	S6014
Straight cup rongeur	Fine Science Tools	16004-16	For dissection
Straight edge spring scissors	Fine Science Tools	15024-10	For dissection
Surgical Scaplel blade (No. 10)	Fisher Scientific	22-079-690
Syring filters, PES (0.22 µm)	Celltreat	229747
Tiny spring scissors	World Precision Instruments	14003	For trimming and cutting DRG
UV lamp	Analytik Jena US		To photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2)