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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole fournit une technique pour récolter et cultiver le ganglion de la racine dorsale (DRG) explanté de rats Sprague Dawley adultes dans un dispositif à compartiments multiples (MC).

Résumé

La caractéristique neuronale périphérique la plus courante de la douleur est un seuil de stimulation abaissé ou une hypersensibilité des nerfs terminaux des ganglions de la racine dorsale (DRG). L’une des causes proposées de cette hypersensibilité est associée à l’interaction entre les cellules immunitaires du tissu périphérique et les neurones. Les modèles in vitro ont fourni des connaissances fondamentales pour comprendre comment ces mécanismes entraînent une hypersensibilité des nocicepteurs. Cependant, les modèles in vitro sont confrontés au défi de traduire l’efficacité chez l’homme. Pour relever ce défi, un modèle in vitro pertinent sur le plan physiologique et anatomique a été développé pour la culture de ganglions de la racine dorsale intacts (DRG) dans trois compartiments isolés d’une plaque de 48 puits. Les DRG primaires sont récoltés sur des rats Sprague Dawley adultes après euthanasie sans cruauté. Les racines nerveuses en excès sont coupées et le DRG est coupé à des tailles appropriées pour la culture. Les DRG sont ensuite cultivés dans des hydrogels naturels, ce qui permet une croissance robuste dans tous les compartiments. Ce système multi-compartiments offre une isolation anatomiquement pertinente des corps cellulaires DRG à partir des neurites, des types de cellules physiologiquement pertinents et des propriétés mécaniques pour étudier les interactions entre les cellules neurales et immunitaires. Ainsi, cette plateforme de culture fournit un outil précieux pour étudier les stratégies d’isolement du traitement, conduisant finalement à une meilleure approche de dépistage pour prédire la douleur.

Introduction

La douleur chronique est la principale cause d’invalidité et de perte d’emploi dans le monde1. La douleur chronique touche environ 20 % des adultes dans le monde et impose un fardeau sociétal et économique important2, avec des coûts totaux estimés entre 560 et 635 milliards de dollars chaque année aux États-Unis3.

La principale caractéristique périphérique présentée par les patients souffrant de douleurs chroniques est un seuil de stimulation abaissé des nerfs, ce qui conduit le système nerveux à être plus réactif aux stimuli 4,5. L’abaissement du seuil de stimulation peut entraîner une réponse douloureuse à un stimulus auparavant non douloureux (allodynie) ou une réponse accrue à un stimulus douloureux (hyperalgésie)6. Les traitements actuels de la douleur chronique ont une efficacité limitée, et les traitements qui réussissent sur des modèles animaux échouent souvent dans les essais humains en raison de différences mécanistes dans la manifestation de la douleur7. Les modèles in vitro qui peuvent imiter plus précisément les mécanismes de sensibilisation périphérique ont le potentiel d’augmenter la traduction de nouvelles thérapies 8,9. De plus, en modélisant les aspects clés des nerfs sensibilisés dans un système de culture, les chercheurs pourraient développer une compréhension plus profonde des mécanismes qui entraînent l’abaissement des seuils et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui les inversent10.

Les plateformes in vitro ou les systèmes microphysiologiques idéaux incorporeraient la séparation physique des neurites distaux et du corps cellulaire des ganglions de la racine dorsale (DRG), un environnement cellulaire tridimensionnel (3D) et la présence de cellules de soutien natives pour imiter étroitement les conditions in vivo . Cependant, un article récent de Caparaso et al.11 montre que les plateformes actuelles de culture de DRG manquent d’une ou plusieurs de ces caractéristiques clés, ce qui les rend insuffisantes pour reproduire des conditions in vivo . Même si ces plateformes sont faciles à mettre en place, elles n’imitent pas la base biologique de la sensibilisation périphérique et peuvent donc ne pas se traduire par une efficacité in vivo . Pour remédier à cette limitation, un modèle in vitro physiologiquement pertinent a été développé pour la culture de ganglions de la racine dorsale (DRG) dans une matrice d’hydrogel avec trois compartiments isolés pour permettre l’isolement fluidique temporel des neurites et des corps cellulaires DRG11. Ce modèle offre une pertinence à la fois physiologique et anatomique, ce qui a le potentiel d’étudier la sensibilisation périphérique des neurones in vitro.

L’intérêt croissant pour l’utilisation des explants de DRG dans une culture 3D est dû à leur capacité à faciliter la croissance robuste des neurites, qui sert d’indicateur indirect de la viabilité des DRG12. Alors que les explants primaires de DRG néonatals ou embryonnaires sont principalement utilisés dans les plateformes de culture in vitro actuelles13,14, l’utilisation d’explants de rongeurs adultes fournit un meilleur modèle de la physiologie neuronale mature, qui imite étroitement la physiologie humaine des DRG par rapport aux explants de rongeurs néonatals ou embryonnaires15. Les DRG explant font référence à la préservation du tissu cellulaire et moléculaire du tissu DRG natif, principalement en maintenant les cellules de soutien non neuronales natives. Le présent protocole décrit la méthodologie de récolte et de culture des explants de DRG de rats Sprague Dawley adultes dans un dispositif à compartiments multiples (figure 1).

L’efficacité a été démontrée dans la culture de DRG à partir de la colonne cervicale, thoracique et lombaire, sans aucune différence observable dans la croissance des neurites. Pour cette application, l’objectif était de provoquer la croissance de neurites dans les compartiments extérieurs du dispositif ; par conséquent, cet article n’a pas fait de distinction entre les niveaux de DRG. Cependant, si nécessaire pour une expérience spécifique, le niveau DRG peut être adapté pour répondre aux besoins des expérimentateurs. Il existe actuellement d’autres modèles de culture compartimentée pour la culture 3D des DRG16, cependant, ces dispositifs ne contiennent pas de cellules de support non neuronales natives préservées, ce qui peut limiter la traduction. La préservation de la structure native des DRG récoltés est importante car elle assure la rétention des cellules de soutien non neuronales, dont les interactions avec les neurones DRG sont essentielles pour maintenir les propriétés fonctionnelles de ces neurones. Plusieurs études ont co-cultivé des DRG dissociés avec des cellules neuronales non natives telles que les cellules de Schwann pour favoriser la myélinisation des neurones 17,18,19.

Protocole

La récolte de DRG a été effectuée conformément au Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Nebraska-Lincoln. Des rats Sprague Dawley femelles âgés de 12 semaines (~250 g) ont été utilisés pour l’étude. Les détails des animaux, des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Fabrication et assemblage de dispositifs à compartiments multiples

  1. Conception assistée par ordinateur et impression 3D de l’appareil à compartiments multiples
    REMARQUE : Le dispositif MC se compose de trois compartiments pour l’isolement des corps cellulaires DRG et des neurites (Figure 2A). Le dispositif MC n’est pas disponible dans le commerce ; cependant, le fichier STL est fourni ici (Supplementary Coding File 1) pour permettre l’impression 3D. L’impression du MC prend une (1) journée.
  2. Téléchargez le fichier STL du MC sur une imprimante 3D résine à l’aide d’un logiciel compatible.
    REMARQUE : Le matériau idéal pour l’impression est une résine haute température. L’un des principaux avantages de l’utilisation de la résine à haute température est qu’elle est biocompatible et qu’elle peut être autoclavée et réutilisée. Une imprimante 3D DLP (Digital Light Processing) ou d’autres imprimantes 3D peuvent également être utilisées pour imprimer l’appareil.
  3. Transférez les appareils imprimés dans une solution de lavage pendant 30 minutes dans de l’isopropanol (>96 %) pour éliminer la résine résiduelle de la surface de l’appareil MC imprimé.
  4. Postpolymériser les appareils à 80 °C pendant 120 min à l’aide d’un agent de durcissement disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux). L’agent de durcissement améliore les propriétés mécaniques du dispositif MC imprimé en l’exposant à la température et aux UV.
  5. Faites durcir thermiquement les appareils MC dans un four à 160 °C pendant 180 min.
  6. Stérilisez les appareils à l’aide d’un autoclave pendant 45 min sur un cycle de gravité.

2. Préparation de l’hydrogel

  1. Synthétiser l’acide hyaluronique méthacrylé (MAHA, méthacrylation de 85 % à 115 %) et le caractériser à l’aide d’un protocole décrit par Seidlits et al.20.
    REMARQUE : Pour soutenir la croissance des DRG, des hydrogels triples composés d’acide hyaluronique méthacrylé, de collagène de type I et de laminine sont couramment utilisés. Les résultats indiquent que les DRG se développent couramment dans MAHA, allant de 1,25 à 2,5 mg / ml et le collagène de 2,0 à 4,5 mg / ml. Pour la laminine, on constate que 0,75 mg/mL est suffisant pour assurer une croissance robuste des DRG. Ici, les méthodes de création d’un gel triple avec 1,25 mg/mL de MAHA, 4,5 mg/mL de collagène et 0,75 mg/mL de laminine sont détaillées. La préparation de l’hydrogel doit être effectuée dans une armoire à flux laminaire pour fournir un espace de travail aseptique.

3. Préparation de la solution de photo-initiateur

REMARQUE : Un photoinitiateur est nécessaire pour réticuler le MAHA sous la lumière UV. Il est couramment utilisé à des pourcentages de 0,3 % à 0,6 %.

  1. Préparez la solution photoinitiatrice 3 jours avant la récolte du DRG.
  2. Préchauffez le bain-marie à 37 °C avant de préparer la solution photoinitiatrice.
  3. En travaillant avec la technique stérile dans une hotte, préparez une solution de bicarbonate de sodium (NaHCO3) à 23,125 mg/mL en dissolvant le NaHCO3 dans une solution 5x Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-HEPES.
  4. Dans un flacon en verre, mélanger un photoinitiateur à 0,6 % en poids/volume (p/v) dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) 1x à 20 % vol/vol et une solution de DMEM/HEPES 5x à 80 % vol/vol.
  5. Pour le protéger de la lumière, enveloppez le flacon en verre dans du papier d’aluminium. Cependant, assurez-vous de retirer la feuille d’aluminium avant de transférer le flacon dans le bain-marie sonique chauffé à 37 °C avec sonication entre 30 et 40 min.
    REMARQUE : La solution photo-initiatrice doit être protégée de la lumière car elle peut se décomposer en radicaux et démarrer le processus de polymérisation lorsqu’elle est exposée à la lumière21.
  6. Filtrez stérilement la solution avec un filtre à seringue de 0,22 μm dans un nouveau flacon en verre stérile.

4. Dissolution de l’acide hyaluronique méthacrylé

  1. Dissoudre l’acide hyaluronique méthacrylé (préparé à l’étape 2) le jour même de la préparation de la solution photoinitiatrice (étape 3).
  2. Placez le MAHA lyophilisé congelé dans un dessiccateur pendant 15 min pour qu’il soit à température ambiante.
  3. En travaillant dans une hotte à flux laminaire et en utilisant la technique de pesage stérile, pesez le MAHA lyophilisé dans un flacon en verre.
  4. Ajouter le volume nécessaire de solution de photo-initiateur filtrée à MAHA pour obtenir la concentration MAHA souhaitée. La concentration finale courante sur gel est de 1,25 mg/mL de MAHA et de 4,5 mg/mL de collagène.
  5. Scellez le bouchon avec un film d’étanchéité de laboratoire, enveloppez le flacon en verre avec du papier d’aluminium et placez-le sur une plaque vibrante orbitale à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous (généralement 3 jours). De temps en temps, vortex la solution pour briser de gros amas de MAHA afin d’assurer une dissolution uniforme de MAHA.

5. Assemblage de l’appareil

  1. Placez l’appareil MC dans une plaque à 48 puits un jour avant la récolte du DRG.
  2. Appliquez une fine ligne de gel de silicone dans la rainure sous l’appareil MC (figure 2B) à l’aide d’une seringue de 3 ml. Cela aidera l’appareil à se fixer solidement à la plaque de puits.
  3. À l’aide de la pince #3, placez délicatement le dispositif MC dans le puits d’une plaque à 48 puits, comme illustré à la figure 2C.
    REMARQUE : La taille de l’appareil peut être modifiée pour s’adapter à l’application prévue, et une plaque d’une taille différente peut être utilisée si vous le souhaitez. Les appareils peuvent être réutilisés. Pour être réutilisé, l’hydrogel doit être lavé doucement de tous les tunnels, et la rainure de chargement sous l’appareil doit être utilisée avec de l’éthanol à 70 % avec une agitation douce. Une fois cette opération terminée, les appareils peuvent être ré-autoclavés pour être stérilisés avant utilisation.

6. Préparation des animaux

  1. Autoclavez tous les outils de dissection nécessaires avant le début de la récolte.
  2. Obtenez un rat Sprague Dawley mâle ou femelle adulte âgé de 12 à 20 semaines. Le sexe du rat n’a pas d’impact sur la croissance des DRG.
  3. Euthanasier le rat selon le protocole approuvé de l’IACUC en utilisant le surdosage de CO2 comme méthode principale d’euthanasie et la ponction bilatérale du pneumothorax comme méthode secondaire d’euthanasie selon les directives22 de l’American Veterinary Medical Association.
  4. Placez le rat sur un sous-tapis stérile sur une table de dissection, le côté ventral vers le bas. Vaporisez la fourrure avec de l’éthanol à 70%.

7. Récolte des ganglions de la racine dorsale (DRG)

  1. Préparez un milieu de parage contenant 86 % de milieu neurobasal A, 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de pénicilline-streptomycine (PS), 1 % de glutamine et 2 % de B27 plus 50x et transférez-le dans une plaque à 24 puits. Ce milieu et cette plaque de puits seront utilisés pour le stockage temporaire des DRG récoltés avant de les intégrer dans l’hydrogel.
  2. Portez une blouse de laboratoire, un masque chirurgical, un bonnet, des lunettes de sécurité et des gants.
  3. À l’aide de gros ciseaux à nez émoussé, coupez la peau à la base de la colonne cervicale, puis sur toute la longueur de la colonne vertébrale.
  4. Pour drainer davantage le sang loin du canal rachidien, coupez sous les omoplates et à travers le muscle pour sectionner les principaux vaisseaux sanguins.
  5. Utilisez de gros ciseaux à nez pointu pour couper le muscle de la colonne vertébrale. Nettoyez autant de muscle que possible pour visualiser la colonne vertébrale.
  6. Retirez les segments dorsal et latéral des vertèbres. Utilisez un Rongeur droit et des ciseaux à bec pointu pour enlever les apophyses épineuses et transversales des vertèbres, en commençant par l’extrémité cervicale et en allant vers l’extrémité lombaire.
  7. Retirez la moelle épinière. Utilisez de petits ciseaux à nez pointu pour couper soigneusement les racines nerveuses reliées aux DRG des deux côtés de la moelle épinière. Coupez l’extrémité cervicale de la moelle épinière et retirez-la doucement du canal rachidien, en coupant toutes les racines nerveuses restantes connectées aux DRG.
    REMARQUE : La motricité fine est essentielle pour s’assurer que le corps DRG n’est pas sectionné dans le processus.
  8. Pour exposer les DRG, utilisez le Rongeur incurvé pour enlever davantage de parties latérales des vertèbres. Tirez vers l’extérieur à partir de la ligne médiane, en alternant les côtés. Veillez à ne pas couper le corps DRG car cela pourrait endommager les corps cellulaires et les axones.
  9. À l’aide de la pince #3 et des ciseaux à ressort à règle droite, retirez les DRG entre chaque niveau des vertèbres. Saisissez les racines nerveuses de la colonne vertébrale du DRG, retirez-les soigneusement de la poche et coupez l’autre extrémité du nerf rachidien. Veillez à ne pas saisir directement le corps du DRG.
  10. Placez les DRG dans des puits d’une plaque de 24 puits (contenant le milieu de coupe, étape 7.1) sur de la glace.
  11. Après avoir collecté tous les DRG, nettoyez l’espace de travail, placez la carcasse dans un sac d’autoclave et stockez/éliminez-la de manière appropriée conformément au protocole IACUC.

8. Rognage et coupe DRG

  1. Remplissez une boîte de Pétri de 60 mm sur un banc propre avec un milieu de coupe (étape 7.1). Installez la lunette de dissection et le stérilisateur de billes de verre et placez une boîte à outils autoclavée avec des outils de coupe (pince #3 et ciseaux à ressort droits) près de la lunette.
  2. Sous la lunette de dissection, retirez l’excès de tissu autour du DRG et coupez les racines nerveuses près du corps du DRG (généralement légèrement plus foncées que les nerfs environnants).
  3. Remplissez une deuxième boîte de Pétri de 60 mm avec un produit frais. Sous la lunette de dissection, coupez les DRG coupés à environ 0,5 mm (ou entre 0,5 mm et 0,8 mm). Une règle est placée sous la boîte de Pétri pendant la coupe pour avoir la bonne estimation de la taille des DRG coupés.
  4. Transférez les DRG coupés dans une assiette fraîche à 24 puits avec le support sur de la glace.
    REMARQUE : Le rognage, la coupe et l’enrobage DRG doivent être effectués dans une armoire à flux laminaire pour fournir un espace de travail aseptique. En l’absence d’une armoire à flux laminaire, des techniques aseptiques doivent être observées, avec un équipement de protection individuelle (EPI) minimum approprié recommandé (blouse de laboratoire, masques, lunettes et gants) et tous les outils stérilisés tout au long du processus pour atténuer la contamination potentielle.

9. Neutralisation du collagène

  1. Neutralisez le collagène le même jour que la récolte des DRG après avoir taillé et coupé les DRG.
  2. Travaillant sur de la glace, pipetez ~8,16 % d’eau ultra-pure, ~1,84 % d’hydroxyde de sodium 1 M (NaOH), ~10 % 10x PBS et ~80 % de collagène du volume total de la solution dans un flacon en verre.
  3. Mélangez lentement à l’aide d’une pointe de pipette stérile à faible rétention pour pipeter le collagène (généralement ajouté en dernier) dans le mélange. Assurez-vous de garder la pointe de la pipette dans la solution pendant le mélange pour éviter de créer des bulles. Vérifiez le pH du collagène neutralisé à l’aide de bandelettes de pH pour vous assurer qu’il est de ~7.
    REMARQUE : Le collagène neutralisé peut être conservé sur de la glace pendant 2-3 h sans gélification ; Par conséquent, la fabrication de l’hydrogel doit être effectuée rapidement une fois que le collagène est neutralisé.

10. Fabrication d’hydrogel

  1. En travaillant sur de la glace, pipetez de la laminine (jusqu’à une concentration finale de 0,75 mg/mL) et 1x PBS dans un flacon en verre.
  2. À l’aide d’embouts de pipette stériles à faible rétention, la pipette a neutralisé le collagène et la solution MAHA dans le mélange pour obtenir la concentration souhaitée.
  3. Mélangez lentement et vérifiez le pH de l’hydrogel obtenu (doit être de ~7).

11. Intégration DRG

  1. Effectuez un encastrement à plusieurs compartiments.
    1. Pipeter 65,1 μL et 52,8 μL de l’hydrogel prémélangé dans les compartiments du soma et du neurite, respectivement.
      REMARQUE : Cela suppose l’utilisation de dispositifs MC dans une plaque à 48 puits. Ces volumes peuvent être modifiés en fonction de la taille du périphérique MC utilisé.
    2. Enfoncez doucement les DRG coupés dans le compartiment soma (Figure 2A), en vous assurant qu’ils ne rayent pas le fond de la plaque du puits. Placez le DRG au milieu pour que les neurites puissent se développer dans les compartiments adjacents à travers les tunnels.
    3. Réticulation thermique de l’hydrogel dans l’incubateur à 37 °C pendant 30 min. Pendant ce temps, allumez la lampe UV pour vous réchauffer.
    4. Après la réticulation thermique, réticulation UV de l’hydrogel pendant 90 s.
    5. Ajoutez le milieu de croissance DRG à l’hydrogel et au DRG et effectuez un changement complet de milieu après une heure pour éliminer les traces de photo-initiateur qui persistent dans le milieu ou qui n’ont pas réagi ou qui restent dans le milieu.
    6. Effectuez un demi-changement de support tous les 3 jours et surveillez la croissance des DRG en les regardant au microscope.
    7. Après ~4 semaines, lorsque les neurites DRG commencent à croître (Figure 3A), capturez des images avec l’imageur à plaque fluorescente et quantifiez la longueur des neurites à l’aide de FIJI (ImageJ).

12. Intégration de contrôle DRG

  1. Pipette 250 μL d’hydrogel dans une plaque de 48 puits (sans MC).
  2. Placez délicatement le DRG coupé au milieu du puits et à mi-chemin dans l’hydrogel, en veillant à ce qu’il ne raye pas le fond de la plaque du puits.
  3. Réticulation thermique de l’hydrogel dans l’incubateur à 37 °C pendant 30 min.
  4. Réticulation UV de l’hydrogel pendant 90 s.
  5. Ajoutez du milieu de croissance DRG à l’hydrogel et au DRG et effectuez un changement complet de milieu après une heure.
  6. Effectuez un demi-changement de média tous les 3 jours et surveillez la croissance du DRG en l’observant au microscope.
  7. Après ~4 semaines, lorsque les neurites DRG commencent à se développer (Figure 3B), capturez des images avec l’imageur à plaque fluorescente.
    REMARQUE : N’importe quel microscope à fond clair fonctionnera pour l’imagerie. Un microscope automatisé à plaque accélère ce processus. L’intégration de contrôle dans des gels simples sans l’appareil est effectuée pour comparer la croissance des neurites DRG dans plusieurs compartiments. Une fois que les utilisateurs ont validé que les DRG se développent de la même manière dans les gels MC et de contrôle, ils n’ont peut-être pas besoin de répéter les gels de contrôle à chaque fois.

13. Imagerie DRG

  1. Capturez des images en fond clair à un grossissement de 4x à l’aide d’un imageur à plaque fluorescente à différentes distances focales pour visualiser l’ensemble du DRG et du MC.
  2. Ajustez la luminosité et le contraste de l’image pour faciliter la visualisation des neurites.
  3. Enregistrez l’image en tant que fichier .tiff.

14. Quantification du neurite DRG

  1. Téléchargez et installez FIJI (ImageJ).
  2. Ouvrez ImageJ. Ouvrez le fichier image et assurez-vous qu’il est monochrome.
  3. Améliorez le contraste pour que les plus petits neurites soient visibles. Pour ce faire, ouvrez l’option de luminosité et de contraste à l’aide du raccourci Ctrl+Maj+C.
  4. Ajustez les curseurs du contrôleur au besoin pour visualiser les neurites, et cliquez sur Appliquer pour la luminosité et le contraste souhaités.
  5. Ouvrez le traceur neurite en ouvrant le menu Plugins , en sélectionnant Segmentation et en cliquant sur Simple Neurite Tracer.
  6. Démarrez une nouvelle trace en cliquant sur une extrémité du neurite juste contre le corps du DRG.
  7. Cliquez sur un autre point le long du neurite pour ajouter une trace jusqu’à ce que le neurite soit tracé de bout en bout. Cliquez sur Terminer le chemin après avoir tracé le neurite.
  8. Convertissez la longueur tracée en unités réelles et enregistrez les résultats en les copiant et en les collant dans Excel.
  9. Utilisez l’outil ligne droite dans FIJI pour tracer une ligne de la même longueur que la barre d’échelle (sans lâcher la fin de la ligne) et regardez la valeur de longueur visible sous la barre d’outils. La valeur length est utilisée pour la conversion.
  10. Mesurez la longueur de six longs neurites s’étendant des deux côtés du DRG (Figure 3C,D) et calculez la longueur moyenne de ces neurites pour donner une longueur moyenne représentative du DRG, comme le montre la figure 4.
    REMARQUE : L’immunocoloration a été testée sur des explants de DRG dans des gels simples pour montrer la présence de cellules de soutien non neuronales7. Les DRG sont fixés dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à température ambiante, lavés trois fois avec 1 PBS pendant 15 minutes et stockés dans 1 PBS à 4 °C jusqu’à l’immunomarquage.
  11. Pour les explants dans les appareils MC, retirez le dispositif MC et suivez le même processus décrit ci-dessus7.

Résultats

Le présent protocole décrit une technique de récolte et de culture de DRG sur des rats Sprague Dawley adultes dans un dispositif à compartiments multiples (MC). Comme le montre la figure 1, le DRG récolté sur des rats adultes a été taillé et coupé en ~0,5 mm. Les DRG coupés et coupés ont ensuite été intégrés dans un hydrogel dans la région soma du dispositif MC (Figure 2) et cultivés pendant 27 jours avant la quantification des...

Discussion

Ce protocole décrit une méthode pour récolter les Drg adultes de Sprague Dawley et les cultiver dans des hydrogels naturels en 3D. Contrairement à cette méthode, d’autres approches de récolte des DRG chez les souris et les rats impliquent l’isolement de la colonne vertébrale. La colonne vertébrale excisée est coupée en deux et la moelle épinière est retirée pour exposer les DRG23, 24, 25. Les lésions de la moel...

Déclarations de divulgation

Les auteurs de cette étude déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention de la NSF (2152065) et une bourse NSF CAREER (1846857). Les auteurs tiennent à remercier tous les membres actuels et passés du Wachs Lab pour leur contribution à ce protocole. Les diagrammes de la figure 1 ont été réalisés dans Biorender.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
#5 forcepsFine Science Tools11252-00For trimming and cutting DRG
10x DMEMMilliporeSigmaD2429
1x PBS (autoclaved)Prepared in lab7.3 - 7.5 pH
24 well platesVWR82050-892To temporarily store harvested and cut DRGs
3 mL Syringe sterile, single useBD309657
48 well platesGreiner Bio-One677180
60 mm Petri dishFisher ScientificFB0875713ATo hold media for trimming and cutting
Aluminium foilFisherbrand01-213-104
B27 Plus 50xThermoFisher17504044For DRG media
Collagen type IIbidi50205
Curved cup Friedman Pearson RongeurFine Science Tools16221-14For dissection
Dumont #3 forcepsFine Science Tools11293-00For dissection
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher16000044For DRG media
Form cureForm Labscuring agent
Form washForm LabsTo wash excess resins off MC
Glass bead sterilizerFisher ScientificNC9531961
Glass vials (8 mL)DWK Life Sciences (Wheaton)224724
GlutaMaxThermoFisher35050-061For DRG media
HEPES (1M)Millipore SigmaH0887
High temp V2 resinFormLabsFLHTAM02
Hyaluronic Acid Sodium SaltMilliporeSigma53747Used to make MAHA
IrgacureMilliporeSigma410896
LamininR&D Systems344600501
Large blunt-nose scissorsMilitexEG5-26For dissection
Large forceps (serrated tips)Militex9538797For dissection
Large sharp-nosed scissorsFine Science Tools14010-15For dissection
Low Retention pipette tipsFisher Scientific02-707-017For pipetting collagen and MAHA
Methacrylated hyaluronic acid (MAHA)Prepared in labN/A85 - 115 % methacrylation
Nerve Growth Factor (NGF)R&D Systems556-NG-100For DRG media
Neurobasal A MediaThermoFisher10888022For DRG media
ParafilmBemisPM996
ParafilmBemisPM996
Penicillin/Streptomycin (PS)EMD Millipore516106For DRG media
pH test stripsVWR InternationalBDH35309.606
Pipette tips (1000 µL)USA Scientific1111-2021
Preform 3.23.1 softwareFormslabTo upload STL file
RatCharles River
Resin 3D printerForm LabsForm 3L3D printing MC device
Small sharp-nosed scissorsFine Science Tools14094-11For dissection
Sodium bicarbonateMilliporeSigmaS6014
Straight cup rongeurFine Science Tools16004-16For dissection
Straight edge spring scissorsFine Science Tools15024-10For dissection
Surgical Scaplel blade (No. 10)Fisher Scientific22-079-690
Syring filters, PES (0.22 µm)Celltreat229747
Tiny spring scissorsWorld Precision Instruments14003For trimming and cutting DRG
UV lampAnalytik Jena USTo photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2)

Références

  1. Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: A systematic analysis for the global burden of disease study 2015. Lancet. 388 (10053), 1545-1602 (2016).
  2. Goldberg, D. S., Mcgee, S. J. Pain as a global public health priority. BMC Public Health. 11 (1), 770 (2011).
  3. Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
  4. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
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