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末梢神経細胞の特徴を研究するためのマルチコンパートメントデバイスにおける後根神経節の採取、埋め込み、および培養
要約
このプロトコルは、成体のSprague Dawleyラットから摘出された後根神経節(DRG)をマルチコンパートメント(MC)デバイスで収穫し、培養する技術を提供します。
要約
疼痛の最も一般的な末梢神経細胞の特徴は、刺激閾値の低下または後根神経節(DRG)からの末端神経の過敏症です。この過敏症の原因として提案されているのは、末梢組織の免疫細胞とニューロンとの相互作用に関連しています。 In vitro モデルは、これらのメカニズムが侵害受容器過敏症を引き起こす方法を理解するための基礎知識を提供してきました。しかし、 in vitro モデルは、有効性をヒトに翻訳するという課題に直面しています。この課題に対処するために、生理学的および解剖学的に関連する in vitro モデルが開発され、48ウェルプレートの3つの隔離されたコンパートメントで無傷の後根神経節(DRG)を培養しました。一次DRGは、人道的安楽死後に成体のSprague Dawleyラットから採取されます。余分な神経根をトリミングし、DRGを培養に適したサイズにカットします。その後、DRGは天然のハイドロゲルで増殖し、すべてのコンパートメントでしっかりとした増殖を可能にします。このマルチコンパートメントシステムは、神経突起からのDRG細胞体の解剖学的に関連性のある単離、生理学的に関連する細胞タイプ、および神経細胞と免疫細胞の間の相互作用を研究するための機械的特性を提供します。したがって、この培養プラットフォームは、治療の分離戦略を調査するための貴重なツールを提供し、最終的には疼痛を予測するためのスクリーニングアプローチの改善につながります。
概要
慢性疼痛は、世界的に障害と失業の主な原因です1。慢性疼痛は、世界の成人の約20%が罹患しており、社会的および経済的に大きな負担を強いており2、米国では毎年5,600億ドルから6,350億ドルの総費用が見積もられています3。
慢性疼痛患者が示す主な末梢の特徴は、神経の刺激閾値の低下であり、これにより神経系が刺激に対してより敏感になります4,5。刺激の閾値が低下すると、以前は痛みを伴わなかった刺激に対する痛みを伴う反応(異痛症)や、痛みを伴う刺激に対する反応の増加(痛覚過敏)が生じる可能性があります6。現在の慢性疼痛治療薬の有効性は限られており、動物モデルで成功した治療法は、疼痛発現のメカニズムの違いにより、ヒトでの試験で失敗することがよくあります7。末梢感作メカニズムをより正確に模倣できるin vitroモデルは、新しい治療法の翻訳を増加させる可能性を秘めています8,9。さらに、培養システムに....
プロトコル
DRGの収穫は、ネブラスカ大学リンカーン校の動物管理・使用委員会(IACUC)に準拠して行われました。この研究には、12週齢の雌Sprague Dawleyラット(~250 g)を使用しました。この研究で使用された動物、試薬、および機器の詳細は、 資料表に記載されています。
1.マルチコンパートメントデバイスの製造と組み立て
- マルチコンパートメントデバイスのコンピューター支援設計と3Dプリンティング
注:MCデバイスは、DRG細胞体と神経突起を単離するための3つのコンパートメントで構成されています(図2A)。MCデバイスは市販されていません。ただし、STLファイル(Supplementary Coding File 1)は、3Dプリンティングを可能にするためにここに提供されています。MCの印刷は完了するまでに1日かかります。 - MCのSTLファイルを対応ソフトウェアを使用してResin 3Dプリンタにアップロードします。
注:印刷に最適な材料は高温樹脂です。高温樹脂を使用する主な利点は、生体適合性があり、オートクレーブして再利用できることです。デジタル光処理(DLP)3Dプリンターまたはその他の3Dプリンターを使用してデバイスを印刷することもできます。
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代表的な結果
本プロトコルは、成体のSprague DawleyラットからDRGをマルチコンパートメント(MC)デバイスで収穫し培養する技術を記載しています。 図1に示すように、 成体ラットから採取したDRGをトリミングし、~0.5mmにカットしました。次に、トリミングおよび切断したDRGをMCデバイスの体細胞領域のハイドロゲルに包埋し(図2)、神経突起定量化の前に.......
ディスカッション
このプロトコルは、成虫のSprague Dawley DRGを収穫し、それらを3D天然ハイドロゲルで培養する方法を概説しています。この方法とは対照的に、マウスやラットからDRGを採取する他のアプローチでは、脊柱を分離します。切除された脊柱は半分になり、脊髄はDRGs23,24,25を露出させるために取り除かれます。脊髄の損傷は血液供?.......
開示事項
この研究の著者は、利益相反がないことを宣言します。
謝辞
この研究は、NSF Grant (2152065) と NSF CAREER Award (1846857) の支援を受けました。著者は、このプロトコルに貢献してくれたWachs Labの現在および過去のメンバー全員に感謝します。 図1 の図はBiorenderで作成されています。
....資料
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | For trimming and cutting DRG |
| 10x DMEM | MilliporeSigma | D2429 | |
| 1x PBS (autoclaved) | Prepared in lab | 7.3 - 7.5 pH | |
| 24 well plates | VWR | 82050-892 | To temporarily store harvested and cut DRGs |
| 3 mL Syringe sterile, single use | BD | 309657 | |
| 48 well plates | Greiner Bio-One | 677180 | |
| 60 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713A | To hold media for trimming and cutting |
| Aluminium foil | Fisherbrand | 01-213-104 | |
| B27 Plus 50x | ThermoFisher | 17504044 | For DRG media |
| Collagen type I | Ibidi | 50205 | |
| Curved cup Friedman Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16221-14 | For dissection |
| Dumont #3 forceps | Fine Science Tools | 11293-00 | For dissection |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | For DRG media |
| Form cure | Form Labs | curing agent | |
| Form wash | Form Labs | To wash excess resins off MC | |
| Glass bead sterilizer | Fisher Scientific | NC9531961 | |
| Glass vials (8 mL) | DWK Life Sciences (Wheaton) | 224724 | |
| GlutaMax | ThermoFisher | 35050-061 | For DRG media |
| HEPES (1M) | Millipore Sigma | H0887 | |
| High temp V2 resin | FormLabs | FLHTAM02 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | MilliporeSigma | 53747 | Used to make MAHA |
| Irgacure | MilliporeSigma | 410896 | |
| Laminin | R&D Systems | 344600501 | |
| Large blunt-nose scissors | Militex | EG5-26 | For dissection |
| Large forceps (serrated tips) | Militex | 9538797 | For dissection |
| Large sharp-nosed scissors | Fine Science Tools | 14010-15 | For dissection |
| Low Retention pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-017 | For pipetting collagen and MAHA |
| Methacrylated hyaluronic acid (MAHA) | Prepared in lab | N/A | 85 - 115 % methacrylation |
| Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 556-NG-100 | For DRG media |
| Neurobasal A Media | ThermoFisher | 10888022 | For DRG media |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) | EMD Millipore | 516106 | For DRG media |
| pH test strips | VWR International | BDH35309.606 | |
| Pipette tips (1000 µL) | USA Scientific | 1111-2021 | |
| Preform 3.23.1 software | Formslab | To upload STL file | |
| Rat | Charles River | ||
| Resin 3D printer | Form Labs | Form 3L | 3D printing MC device |
| Small sharp-nosed scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | For dissection |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S6014 | |
| Straight cup rongeur | Fine Science Tools | 16004-16 | For dissection |
| Straight edge spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | For dissection |
| Surgical Scaplel blade (No. 10) | Fisher Scientific | 22-079-690 | |
| Syring filters, PES (0.22 µm) | Celltreat | 229747 | |
| Tiny spring scissors | World Precision Instruments | 14003 | For trimming and cutting DRG |
| UV lamp | Analytik Jena US | To photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2) |
参考文献
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: A systematic analysis for the global burden of disease study 2015. Lancet. 388 (10053), 1545-1602 (2016).
- Goldberg, D. S., Mcgee, S. J.
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