Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Bu protokol, çok bölmeli (MC) bir cihazda yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından ekilen dorsal kök ganglionunu (DRG) hasat etmek ve kültürlemek için bir teknik sağlar.
Ağrının en sık görülen periferik nöronal özelliği, dorsal kök gangliyonlarından (DRG) terminal sinirlerin düşük stimülasyon eşiği veya aşırı duyarlılığıdır. Bu aşırı duyarlılığın önerilen bir nedeni, periferik dokudaki bağışıklık hücreleri ve nöronlar arasındaki etkileşim ile ilişkilidir. İn vitro modeller, bu mekanizmaların nosiseptör aşırı duyarlılığına nasıl yol açtığını anlamada temel bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, in vitro modeller, etkinliği insanlara tercüme etme zorluğuyla karşı karşıyadır. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, 48 oyuklu bir plakada üç izole bölmede sağlam dorsal kök gangliyonlarının (DRG'ler) kültürü için fizyolojik ve anatomik olarak ilgili bir in vitro model geliştirilmiştir. Birincil DRG'ler, insancıl ötenaziden sonra yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından toplanır. Fazla sinir kökleri kesilir ve DRG kültür için uygun boyutlarda kesilir. DRG'ler daha sonra doğal hidrojellerde büyütülür ve tüm bölmelerde sağlam bir büyüme sağlar. Bu çok bölmeli sistem, nöral ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için DRG hücre gövdelerinin nöritlerden, fizyolojik olarak ilgili hücre tiplerinden ve mekanik özelliklerden anatomik olarak ilgili izolasyonunu sunar. Bu nedenle, bu kültür platformu, tedavi izolasyon stratejilerini araştırmak için değerli bir araç sağlar ve sonuçta ağrıyı tahmin etmek için gelişmiş bir tarama yaklaşımına yol açar.
Kronik ağrı, küresel olarak engellilik ve iş kaybının önde gelen nedenidir1. Kronik ağrı, küresel olarak yetişkinlerin yaklaşık% 20'sini etkilemekte ve önemli bir toplumsal ve ekonomik yük getirmektedir2, Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl 560 ila 635 milyar dolar arasında tahmin edilen toplam maliyetler3.
Kronik ağrı hastaları tarafından sergilenen ana periferik özellik, sinir sisteminin uyaranlara daha duyarlı olmasına yol açan sinirlerin düşük stimülasyon eşiğidir 4,5. Düşük stimülasyon eşiği, daha önce ....
DRG hasadı, Nebraska-Lincoln Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ne (IACUC) uygun olarak gerçekleştirildi. Çalışma için 12 haftalık (~ 250 g) dişi Sprague Dawley sıçanları kullanıldı. Çalışmada kullanılan hayvanların, reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Çok bölmeli cihaz imalatı ve montajı
Mevcut protokol, çok bölmeli (MC) bir cihazda yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından DRG'yi hasat etmek ve kültürlemek için bir teknik tanımladı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, yetişkin sıçanlardan hasat edilen DRG kesildi ve ~ 0.5 mm'ye kesildi. Kesilmiş ve kesilmiş DRG'ler daha sonra MC cihazının soma bölgesinde bir hidrojel içine gömüldü (Şekil 2) ve nörit miktar tayininden önce 27 gün boyunca kültürlendi. DRG, .......
Bu protokol, yetişkin Sprague Dawley DRG'lerini hasat etmek ve bunları 3D doğal hidrojellerde kültürlemek için bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir. Bu yöntemin aksine, farelerden ve sıçanlardan DRG'lerin toplanmasına yönelik diğer yaklaşımlar, omurganın izole edilmesini içerir. Eksize edilen omurga yarıya indirilir ve omurilikDRG 23,24,25'i ortaya çıkarmak için çıkarılır. Omuriliğin hasar görmesi kan .......
Bu çalışmanın yazarları herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmişlerdir.
Bu çalışma bir NSF Hibesi (2152065) ve bir NSF KARİYER Ödülü (1846857) ile desteklenmiştir. Yazarlar, bu protokole katkıda bulundukları için Wachs Lab'ın mevcut ve geçmiş tüm üyelerine teşekkür eder. Şekil 1'deki diyagramlar Biorender'da yapılmıştır.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
#5 forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | For trimming and cutting DRG |
10x DMEM | MilliporeSigma | D2429 | |
1x PBS (autoclaved) | Prepared in lab | 7.3 - 7.5 pH | |
24 well plates | VWR | 82050-892 | To temporarily store harvested and cut DRGs |
3 mL Syringe sterile, single use | BD | 309657 | |
48 well plates | Greiner Bio-One | 677180 | |
60 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713A | To hold media for trimming and cutting |
Aluminium foil | Fisherbrand | 01-213-104 | |
B27 Plus 50x | ThermoFisher | 17504044 | For DRG media |
Collagen type I | Ibidi | 50205 | |
Curved cup Friedman Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16221-14 | For dissection |
Dumont #3 forceps | Fine Science Tools | 11293-00 | For dissection |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | For DRG media |
Form cure | Form Labs | curing agent | |
Form wash | Form Labs | To wash excess resins off MC | |
Glass bead sterilizer | Fisher Scientific | NC9531961 | |
Glass vials (8 mL) | DWK Life Sciences (Wheaton) | 224724 | |
GlutaMax | ThermoFisher | 35050-061 | For DRG media |
HEPES (1M) | Millipore Sigma | H0887 | |
High temp V2 resin | FormLabs | FLHTAM02 | |
Hyaluronic Acid Sodium Salt | MilliporeSigma | 53747 | Used to make MAHA |
Irgacure | MilliporeSigma | 410896 | |
Laminin | R&D Systems | 344600501 | |
Large blunt-nose scissors | Militex | EG5-26 | For dissection |
Large forceps (serrated tips) | Militex | 9538797 | For dissection |
Large sharp-nosed scissors | Fine Science Tools | 14010-15 | For dissection |
Low Retention pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-017 | For pipetting collagen and MAHA |
Methacrylated hyaluronic acid (MAHA) | Prepared in lab | N/A | 85 - 115 % methacrylation |
Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 556-NG-100 | For DRG media |
Neurobasal A Media | ThermoFisher | 10888022 | For DRG media |
Parafilm | Bemis | PM996 | |
Parafilm | Bemis | PM996 | |
Penicillin/Streptomycin (PS) | EMD Millipore | 516106 | For DRG media |
pH test strips | VWR International | BDH35309.606 | |
Pipette tips (1000 µL) | USA Scientific | 1111-2021 | |
Preform 3.23.1 software | Formslab | To upload STL file | |
Rat | Charles River | ||
Resin 3D printer | Form Labs | Form 3L | 3D printing MC device |
Small sharp-nosed scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | For dissection |
Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S6014 | |
Straight cup rongeur | Fine Science Tools | 16004-16 | For dissection |
Straight edge spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | For dissection |
Surgical Scaplel blade (No. 10) | Fisher Scientific | 22-079-690 | |
Syring filters, PES (0.22 µm) | Celltreat | 229747 | |
Tiny spring scissors | World Precision Instruments | 14003 | For trimming and cutting DRG |
UV lamp | Analytik Jena US | To photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2) |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
ISSN 2578-2614
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır
Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz
Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.