Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

Bu protokol, çok bölmeli (MC) bir cihazda yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından ekilen dorsal kök ganglionunu (DRG) hasat etmek ve kültürlemek için bir teknik sağlar.

Özet

Ağrının en sık görülen periferik nöronal özelliği, dorsal kök gangliyonlarından (DRG) terminal sinirlerin düşük stimülasyon eşiği veya aşırı duyarlılığıdır. Bu aşırı duyarlılığın önerilen bir nedeni, periferik dokudaki bağışıklık hücreleri ve nöronlar arasındaki etkileşim ile ilişkilidir. İn vitro modeller, bu mekanizmaların nosiseptör aşırı duyarlılığına nasıl yol açtığını anlamada temel bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, in vitro modeller, etkinliği insanlara tercüme etme zorluğuyla karşı karşıyadır. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, 48 oyuklu bir plakada üç izole bölmede sağlam dorsal kök gangliyonlarının (DRG'ler) kültürü için fizyolojik ve anatomik olarak ilgili bir in vitro model geliştirilmiştir. Birincil DRG'ler, insancıl ötenaziden sonra yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından toplanır. Fazla sinir kökleri kesilir ve DRG kültür için uygun boyutlarda kesilir. DRG'ler daha sonra doğal hidrojellerde büyütülür ve tüm bölmelerde sağlam bir büyüme sağlar. Bu çok bölmeli sistem, nöral ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için DRG hücre gövdelerinin nöritlerden, fizyolojik olarak ilgili hücre tiplerinden ve mekanik özelliklerden anatomik olarak ilgili izolasyonunu sunar. Bu nedenle, bu kültür platformu, tedavi izolasyon stratejilerini araştırmak için değerli bir araç sağlar ve sonuçta ağrıyı tahmin etmek için gelişmiş bir tarama yaklaşımına yol açar.

Giriş

Kronik ağrı, küresel olarak engellilik ve iş kaybının önde gelen nedenidir1. Kronik ağrı, küresel olarak yetişkinlerin yaklaşık% 20'sini etkilemekte ve önemli bir toplumsal ve ekonomik yük getirmektedir2, Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl 560 ila 635 milyar dolar arasında tahmin edilen toplam maliyetler3.

Kronik ağrı hastaları tarafından sergilenen ana periferik özellik, sinir sisteminin uyaranlara daha duyarlı olmasına yol açan sinirlerin düşük stimülasyon eşiğidir 4,5. Düşük stimülasyon eşiği, daha önce ....

Protokol

DRG hasadı, Nebraska-Lincoln Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ne (IACUC) uygun olarak gerçekleştirildi. Çalışma için 12 haftalık (~ 250 g) dişi Sprague Dawley sıçanları kullanıldı. Çalışmada kullanılan hayvanların, reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Çok bölmeli cihaz imalatı ve montajı

  1. Çok bölmeli cihazın bilgisayar destekli tasarımı ve 3D baskısı
    NOT: MC cihazı, DRG hücre gövdelerinin ve nöritlerin izolasyonu için üç bölmeden oluşur (Şekil 2A). MC cihazı ticari olarak mevcut değildir; ancak, ....

Temsili Sonuçlar

Mevcut protokol, çok bölmeli (MC) bir cihazda yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından DRG'yi hasat etmek ve kültürlemek için bir teknik tanımladı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, yetişkin sıçanlardan hasat edilen DRG kesildi ve ~ 0.5 mm'ye kesildi. Kesilmiş ve kesilmiş DRG'ler daha sonra MC cihazının soma bölgesinde bir hidrojel içine gömüldü (Şekil 2) ve nörit miktar tayininden önce 27 gün boyunca kültürlendi. DRG, .......

Tartışmalar

Bu protokol, yetişkin Sprague Dawley DRG'lerini hasat etmek ve bunları 3D doğal hidrojellerde kültürlemek için bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir. Bu yöntemin aksine, farelerden ve sıçanlardan DRG'lerin toplanmasına yönelik diğer yaklaşımlar, omurganın izole edilmesini içerir. Eksize edilen omurga yarıya indirilir ve omurilikDRG 23,24,25'i ortaya çıkarmak için çıkarılır. Omuriliğin hasar görmesi kan .......

Açıklamalar

Bu çalışmanın yazarları herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmişlerdir.

Teşekkürler

Bu çalışma bir NSF Hibesi (2152065) ve bir NSF KARİYER Ödülü (1846857) ile desteklenmiştir. Yazarlar, bu protokole katkıda bulundukları için Wachs Lab'ın mevcut ve geçmiş tüm üyelerine teşekkür eder. Şekil 1'deki diyagramlar Biorender'da yapılmıştır.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
#5 forcepsFine Science Tools11252-00For trimming and cutting DRG
10x DMEMMilliporeSigmaD2429
1x PBS (autoclaved)Prepared in lab7.3 - 7.5 pH
24 well platesVWR82050-892To temporarily store harvested and cut DRGs
3 mL Syringe sterile, single useBD309657
48 well platesGreiner Bio-One677180
60 mm Petri dishFisher ScientificFB0875713ATo hold media for trimming and cutting
Aluminium foilFisherbrand01-213-104
B27 Plus 50xThermoFisher17504044For DRG media
Collagen type IIbidi50205
Curved cup Friedman Pearson RongeurFine Science Tools16221-14For dissection
Dumont #3 forcepsFine Science Tools11293-00For dissection
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher16000044For DRG media
Form cureForm Labscuring agent
Form washForm LabsTo wash excess resins off MC
Glass bead sterilizerFisher ScientificNC9531961
Glass vials (8 mL)DWK Life Sciences (Wheaton)224724
GlutaMaxThermoFisher35050-061For DRG media
HEPES (1M)Millipore SigmaH0887
High temp V2 resinFormLabsFLHTAM02
Hyaluronic Acid Sodium SaltMilliporeSigma53747Used to make MAHA
IrgacureMilliporeSigma410896
LamininR&D Systems344600501
Large blunt-nose scissorsMilitexEG5-26For dissection
Large forceps (serrated tips)Militex9538797For dissection
Large sharp-nosed scissorsFine Science Tools14010-15For dissection
Low Retention pipette tipsFisher Scientific02-707-017For pipetting collagen and MAHA
Methacrylated hyaluronic acid (MAHA)Prepared in labN/A85 - 115 % methacrylation
Nerve Growth Factor (NGF)R&D Systems556-NG-100For DRG media
Neurobasal A MediaThermoFisher10888022For DRG media
ParafilmBemisPM996
ParafilmBemisPM996
Penicillin/Streptomycin (PS)EMD Millipore516106For DRG media
pH test stripsVWR InternationalBDH35309.606
Pipette tips (1000 µL)USA Scientific1111-2021
Preform 3.23.1 softwareFormslabTo upload STL file
RatCharles River
Resin 3D printerForm LabsForm 3L3D printing MC device
Small sharp-nosed scissorsFine Science Tools14094-11For dissection
Sodium bicarbonateMilliporeSigmaS6014
Straight cup rongeurFine Science Tools16004-16For dissection
Straight edge spring scissorsFine Science Tools15024-10For dissection
Surgical Scaplel blade (No. 10)Fisher Scientific22-079-690
Syring filters, PES (0.22 µm)Celltreat229747
Tiny spring scissorsWorld Precision Instruments14003For trimming and cutting DRG
UV lampAnalytik Jena USTo photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2)

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

This article has been published

Video Coming Soon

Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz

Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.