Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, çok bölmeli (MC) bir cihazda yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından ekilen dorsal kök ganglionunu (DRG) hasat etmek ve kültürlemek için bir teknik sağlar.

Özet

Ağrının en sık görülen periferik nöronal özelliği, dorsal kök gangliyonlarından (DRG) terminal sinirlerin düşük stimülasyon eşiği veya aşırı duyarlılığıdır. Bu aşırı duyarlılığın önerilen bir nedeni, periferik dokudaki bağışıklık hücreleri ve nöronlar arasındaki etkileşim ile ilişkilidir. İn vitro modeller, bu mekanizmaların nosiseptör aşırı duyarlılığına nasıl yol açtığını anlamada temel bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, in vitro modeller, etkinliği insanlara tercüme etme zorluğuyla karşı karşıyadır. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, 48 oyuklu bir plakada üç izole bölmede sağlam dorsal kök gangliyonlarının (DRG'ler) kültürü için fizyolojik ve anatomik olarak ilgili bir in vitro model geliştirilmiştir. Birincil DRG'ler, insancıl ötenaziden sonra yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından toplanır. Fazla sinir kökleri kesilir ve DRG kültür için uygun boyutlarda kesilir. DRG'ler daha sonra doğal hidrojellerde büyütülür ve tüm bölmelerde sağlam bir büyüme sağlar. Bu çok bölmeli sistem, nöral ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için DRG hücre gövdelerinin nöritlerden, fizyolojik olarak ilgili hücre tiplerinden ve mekanik özelliklerden anatomik olarak ilgili izolasyonunu sunar. Bu nedenle, bu kültür platformu, tedavi izolasyon stratejilerini araştırmak için değerli bir araç sağlar ve sonuçta ağrıyı tahmin etmek için gelişmiş bir tarama yaklaşımına yol açar.

Giriş

Kronik ağrı, küresel olarak engellilik ve iş kaybının önde gelen nedenidir1. Kronik ağrı, küresel olarak yetişkinlerin yaklaşık% 20'sini etkilemekte ve önemli bir toplumsal ve ekonomik yük getirmektedir2, Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl 560 ila 635 milyar dolar arasında tahmin edilen toplam maliyetler3.

Kronik ağrı hastaları tarafından sergilenen ana periferik özellik, sinir sisteminin uyaranlara daha duyarlı olmasına yol açan sinirlerin düşük stimülasyon eşiğidir 4,5. Düşük stimülasyon eşiği, daha önce ağrılı olmayan bir uyarana (allodini) ağrılı bir yanıt veya ağrılı bir uyarana (hiperaljezi) yüksek bir yanıt ile sonuçlanabilir6. Mevcut kronik ağrı tedavilerinin etkinliği sınırlıdır ve hayvan modellerinde başarılı olan tedaviler, ağrı tezahüründeki mekanik farklılıklar nedeniyle insan denemelerinde sıklıkla başarısız olmaktadır7. Periferik duyarlılık mekanizmalarını daha doğru bir şekilde taklit edebilen in vitro modeller, yeni terapötiklerin translasyonunu artırma potansiyeline sahiptir 8,9. Ayrıca, bir kültür sistemindeki hassaslaşmış sinirlerin temel yönlerini modelleyerek, araştırmacılar düşük eşikleri yönlendiren mekanizmalar hakkında daha derin bir anlayış geliştirebilir ve bunları tersine çeviren yeni terapötik hedefleri belirleyebilirler10.

İdeal in vitro platformlar veya mikrofizyolojik sistemler, distal nöritlerin ve dorsal kök gangliyonları (DRG) hücre gövdesinin fiziksel olarak ayrılmasını, üç boyutlu (3D) bir hücresel ortamı ve in vivo koşulları yakından taklit etmek için doğal destek hücrelerinin varlığını içerecektir. Bununla birlikte, Caparaso ve ark.11 tarafından yakın zamanda yayınlanan bir makale, mevcut DRG kültür platformlarının bu temel özelliklerden bir veya daha fazlasından yoksun olduğunu ve bu da onları in vivo koşullarda çoğaltmada yetersiz hale getirdiğini göstermektedir. Bu platformların kurulumu kolay olsa da, periferik duyarlılığın biyolojik temelini taklit etmezler ve bu nedenle in vivo etkinliğe dönüşmeyebilirler. Bu sınırlamayı ele almak için, nöritlerin ve DRG hücre gövdelerinin zamansal akışkan izolasyonuna izin vermek için üç izole bölmeye sahip bir hidrojel matrisi içinde dorsal kök gangliyonlarının (DRG) kültürü için fizyolojik olarak ilgili bir in vitro model geliştirilmiştir11. Bu model, in vitro nöronların periferik duyarlılığını inceleme potansiyeline sahip hem fizyolojik hem de anatomik alaka düzeyi sunar.

DRG eksplantlarının bir 3D kültürde kullanımına artan ilgi, DRG canlılığının dolaylı bir göstergesi olarak hizmet eden sağlam nörit büyümesini kolaylaştırma yeteneklerinden kaynaklanmaktadır12. Primer neonatal veya embriyonik DRG eksplantları ağırlıklı olarak mevcut in vitro kültür platformlarındakullanılırken 13,14, yetişkin kemirgenlerden elde edilen eksplantların kullanılması, neonatal veya embriyonik kemirgenlerden elde edilen eksplantlara kıyasla insan DRG fizyolojisini yakından taklit eden daha iyi bir olgun nöronal fizyoloji modeli sağlar15. Eksplant DRG'ler, öncelikle doğal nöronal olmayan destek hücrelerinin sürdürülmesi yoluyla, doğal DRG dokusunun hücresel ve moleküler dokusunun korunmasını ifade eder. Burada, bu protokol, çok bölmeli (MC) bir cihazda yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından DRG eksplantlarının hasat edilmesi ve kültürlenmesi için metodolojiyi açıklamaktadır (Şekil 1).

Drg'lerin servikal, torasik ve lomber omurgadan kültürlenmesinde, nörit büyümesinde gözlemlenebilir bir fark olmaksızın etkinlik gösterilmiştir. Bu uygulama için amaç, cihazın dış bölmelerine nörit büyümesi sağlamaktı; bu nedenle, bu makale DRG seviyeleri arasında ayrım yapmamıştır. Bununla birlikte, belirli bir deney için gerekliyse, DRG seviyesi deneycilerin ihtiyaçlarını karşılayacak şekilde uyarlanabilir. Şu anda DRG16'nın 3D kültürü için başka bölümlere ayrılmış kültür modelleri vardır, ancak bu cihazlar, translasyonu sınırlayabilen korunmuş doğal nöronal olmayan destek hücreleri içermez. Hasat edilen DRG'lerin doğal yapısını korumak önemlidir, çünkü DRG nöronları ile etkileşimleri bu nöronların fonksiyonel özelliklerini korumak için gerekli olan nöronal olmayan destek hücrelerinin tutulmasını sağlar. Birkaç çalışma, nöronların miyelinleşmesini teşvik etmek için DRG'leri Schwann hücreleri gibi doğal olmayan nöronal hücrelerle birlikte kültürledi 17,18,19.

Protokol

DRG hasadı, Nebraska-Lincoln Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ne (IACUC) uygun olarak gerçekleştirildi. Çalışma için 12 haftalık (~ 250 g) dişi Sprague Dawley sıçanları kullanıldı. Çalışmada kullanılan hayvanların, reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Çok bölmeli cihaz imalatı ve montajı

  1. Çok bölmeli cihazın bilgisayar destekli tasarımı ve 3D baskısı
    NOT: MC cihazı, DRG hücre gövdelerinin ve nöritlerin izolasyonu için üç bölmeden oluşur (Şekil 2A). MC cihazı ticari olarak mevcut değildir; ancak, 3D yazdırmayı etkinleştirmek için STL dosyası burada (Ek Kodlama Dosyası 1) sağlanmıştır. MC'nin yazdırılmasının tamamlanması bir (1) gün sürer.
  2. MC'nin STL dosyasını uyumlu yazılım kullanarak bir Resin 3D yazıcıya yükleyin.
    NOT: Baskı için ideal olan malzeme, yüksek sıcaklık reçinesidir. Yüksek sıcaklıkta reçine kullanmanın önemli bir avantajı, biyouyumlu olması ve otoklavlanıp yeniden kullanılabilmesidir. Cihazı yazdırmak için bir Dijital ışık işleme (DLP) 3D yazıcı veya diğer 3D yazıcılar da kullanılabilir.
  3. Basılı MC cihazının yüzeyinden kalan reçineyi çıkarmak için basılı cihazları izopropanol (%>96) içinde 30 dakika boyunca bir yıkama solüsyonuna aktarın.
  4. Cihazları 80 °C'de 120 dakika boyunca piyasada bulunan bir kürleme maddesi kullanarak kürleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Sertleştirici, basılı MC cihazını sıcaklığa ve UV'ye maruz bırakarak mekanik özelliklerini geliştirir.
  5. MC cihazlarını 160 °C'de 180 dakika boyunca bir fırında termal olarak kürleyin.
  6. Cihazları yerçekimi döngüsünde 45 dakika boyunca bir otoklav kullanarak sterilize edin.

2. Hidrojel hazırlama

  1. Metakrillenmiş hyaluronik asit (MAHA, %85-%115 metakrilasyon) sentezleyin ve Seidlits ve ark.20 tarafından açıklanan bir protokol kullanarak karakterize edin.
    NOT: DRG'lerin büyümesini desteklemek için, metakrillenmiş hyaluronik asit, tip I kollajen ve lamininden oluşan üçlü hidrojeller yaygın olarak kullanılır. Bulgular, DRG'lerin yaygın olarak MAHA'da 1.25-2.5 mg/mL arasında ve kollajenin 2.0-4.5 mg/mL arasında değiştiğini göstermektedir. Laminin için, DRG'lerin sağlam büyümesini sağlamak için 0.75 mg / mL'nin yeterli olduğu bulunmuştur. Burada, 1.25 mg / mL MAHA, 4.5 mg / mL kollajen ve 0.75 mg / mL laminin ile üçlü jel oluşturma yöntemleri detaylandırılmıştır. Hidrojel hazırlama, aseptik bir çalışma alanı sağlamak için laminer bir akış kabininde yapılmalıdır.

3. Foto başlatıcı çözelti hazırlama

NOT: MAHA'yı UV ışığı altında çapraz bağlamak için bir foto başlatıcı gereklidir. Genellikle %0,3 ila %0,6 arasındaki yüzdelerde kullanılır.

  1. DRG hasadından 3 gün önce foto başlatıcı çözeltisini hazırlayın.
  2. Foto başlatıcı çözeltisini hazırlamadan önce sonikasyon su banyosunu 37 ° C'ye ısıtın.
  3. Bir akış başlığında steril teknikle çalışarak, NaHCO3'ü 5x Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM)-HEPES çözeltisinde çözerek 23.125 mg / mL sodyum bikarbonat (NaHCO3) çözeltisi hazırlayın.
  4. Bir cam şişede,% 0.6 ağırlık / hacim (w / v) foto başlatıcıyı% 20 hacim / hacim 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS) ve% 80 hacim / hacim 5X DMEM / HEPES çözeltisi içinde karıştırın.
  5. Işıktan korumak için cam şişeyi alüminyum folyoya sarın. Bununla birlikte, şişeyi 30-40 dakika arasında sonikasyon ile 37 ° C'ye ısıtılmış sonikasyon su banyosuna aktarmadan önce alüminyum folyoyu çıkardığınızdan emin olun.
    NOT: Foto başlatıcı çözelti ışıktan korunmalıdır çünkü ışığa maruz kaldığında radikallere ayrılabilir ve polimerizasyon sürecini başlatabilir21.
  6. Çözeltiyi 0.22 μm'lik bir şırınga filtresi ile yeni bir steril cam şişeye steril olarak süzün.

4. Metakrilatlanmış hyaluronik asit çözünmesi

  1. Metakrillenmiş hyaluronik asidi (2. adımda hazırlanır) foto başlatıcı çözeltisinin hazırlandığı gün (3. adım) çözün.
  2. Dondurulmuş liyofilize MAHA'yı oda sıcaklığına gelmesi için 15 dakika kurutucuya koyun.
  3. Laminer akış başlığında çalışarak ve steril tartım tekniğini kullanarak, liyofilize MAHA'yı bir cam şişede tartın.
  4. İstenen MAHA konsantrasyonuna ulaşmak için gerekli hacimde filtrelenmiş foto başlatıcı çözeltisini MAHA'ya ekleyin. Yaygın nihai jel konsantrasyonu 1.25 mg / mL MAHA ve 4.5 mg / mL kollajendir.
  5. Kapağı laboratuvar sızdırmazlık filmi ile kapatın, cam şişeyi alüminyum folyo ile sarın ve tamamen eriyene kadar (genellikle 3 gün) oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı plaka üzerine yerleştirin. Bazen, MAHA'nın düzgün bir şekilde çözünmesini sağlamak için büyük MAHA kümelerini parçalamak için çözeltiyi girdaplayın.

5. Cihaz montajı

  1. MC cihazını DRG hasadından bir gün önce 48 oyuklu bir plakaya yerleştirin.
  2. 2 mL'lik bir şırınga kullanarak MC cihazının altındaki oluğa (Şekil 3B) ince bir silikon jel çizgisi uygulayın. Bu, cihazın kuyu plakasına güvenli bir şekilde bağlanmasına yardımcı olacaktır.
  3. # 3 forseps yardımıyla, MC cihazını Şekil 2C'de gösterildiği gibi 48 oyuklu bir plakanın kuyusuna yavaşça yerleştirin.
    NOT: Cihazın boyutu, amaçlanan uygulamaya uyacak şekilde değiştirilebilir ve istenirse farklı boyutta bir plaka kullanılabilir. Cihazlar tekrar kullanılabilir. Yeniden kullanmak için, hidrojel tüm tünellerden nazikçe yıkanmalı ve cihazın altındaki yükleme oluğu, hafif çalkalama ile %70 etanol ile kullanılmalıdır. Bu tamamlandıktan sonra, cihazlar kullanımdan önce sterilize etmek için yeniden otoklavlanabilir.

6. Hayvan hazırlığı

  1. Hasat başlamadan önce gerekli tüm diseksiyon aletlerini otoklavlayın.
  2. 12-20 haftalık yetişkin bir erkek veya dişi Sprague Dawley sıçanı edinin. Sıçanın cinsiyeti DRG büyümesini etkilemez.
  3. Amerikan Veteriner Hekimler Birliği Yönergeleri22'ye göre, birincil ötenazi yöntemi olarak CO2 doz aşımı ve ikincil bir ötenazi yöntemi olarak bilateral pnömotoraks ponksiyonu kullanarak sıçanı onaylanmış IACUC protokolüne göre ötenazi yapın.
  4. Fareyi, ventral tarafı aşağı bakacak şekilde bir diseksiyon masasına steril bir alt ped üzerine yerleştirin. Kürkü %70 etanol ile püskürtün.

7. Dorsal kök gangliyonları (DRG) hasadı

  1. % 86 Nörobazal A ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 penisilin-streptomisin (PS),% 1 Glutamin ve% 2 B27 artı 50x içeren kırpma ortamını hazırlayın ve 24 oyuklu bir plakaya aktarın. Bu ortam ve kuyu plakası, hasat edilen DRG'lerin hidrojel içine gömülmeden önce geçici olarak depolanması için kullanılacaktır.
  2. Laboratuvar önlüğü, cerrahi maske, bone, koruyucu gözlük ve eldiven giyin.
  3. Büyük künt burun makası kullanarak, servikal omurganın tabanındaki cildi kesin ve ardından omurganın uzunluğu boyunca kesin.
  4. Omurilik kanalındaki kanı daha fazla boşaltmak için, büyük kan damarlarını kesmek için kürek kemiklerinin altından ve kasın içinden aşağı doğru kesin.
  5. Kası omurgadan uzaklaştırmak için büyük, keskin burunlu makas kullanın. Omurgayı görselleştirmek için mümkün olduğunca fazla kası temizleyin.
  6. Omurların dorsal ve lateral segmentlerini çıkarın. Omurların dikenli ve enine süreçlerini çıkarmak için servikal uçtan başlayıp bel ucuna doğru hareket etmek için düz bir Rongeur ve keskin burunlu makas kullanın.
  7. Omuriliği çıkarın. Omuriliğin her iki tarafı boyunca DRG'lere bağlı sinir köklerini dikkatlice kesmek için küçük keskin burunlu makas kullanın. Omuriliğin servikal ucunu kesin ve DRG'lere bağlı kalan sinir köklerini keserek omurilik kanalından kademeli olarak dikkatlice kaldırın.
    NOT: DRG gövdesinin işlem sırasında kopmamasını sağlamak için ince motor beceriler gereklidir.
  8. DRG'leri ortaya çıkarmak için, omurların yan kısımlarının daha fazlasını çıkarmak için kavisli Rongeur'u kullanın. Alternatif taraflar olmak üzere orta hattan dışa doğru çekin. Hücre gövdelerine ve aksonlara zarar verebileceği için DRG gövdesini kesmemeye dikkat edin.
  9. # 3 forseps ve düz kenarlı yaylı makası kullanarak, omurun her seviyesi arasındaki DRG'leri çıkarın. Omurilik siniri köklerini DRG'den kavrayın, dikkatlice cepten çıkarın ve omurilik sinirinin diğer ucunu kesin. DRG gövdesini doğrudan tutmamaya dikkat edin.
  10. DRG'leri buz üzerinde 24 oyuklu bir plakanın (kırpma ortamı içeren, adım 7.1) kuyularına yerleştirin.
  11. Tüm DRG'leri topladıktan sonra, çalışma alanını temizleyin, karkası bir otoklav torbasına koyun ve IACUC protokolüne göre uygun şekilde saklayın/atın.

8. DRG kırpma ve kesme

  1. 60 mm'lik bir Petri kabını temiz bir tezgah üzerinde düzeltme ortamı ile doldurun (adım 7.1). Diseksiyon dürbününü ve cam boncuk sterilizatörünü kurun ve dürbün yanına düzeltme aletleri (# 3 forseps ve düz kenarlı yaylı makas) içeren otoklavlanmış bir alet kutusu yerleştirin.
  2. Diseksiyon kapsamı altında, DRG etrafındaki fazla dokuyu çıkarın ve DRG gövdesine yakın sinir köklerini kesin (tipik olarak çevredeki sinirlerden biraz daha koyu).
  3. İkinci bir 60 mm Petri kabını taze ortamla doldurun. Diseksiyon kapsamı altında, kesilmiş DRG'leri yaklaşık 0,5 mm'ye (veya 0,5 mm ile 0,8 mm arasında) kesin. Kesilmiş DRG'lerin doğru tahmini boyutuna sahip olmak için kesim sırasında Petri kabının altına bir cetvel yerleştirilir.
  4. Kesilmiş DRG'leri, ortam buz üzerinde olacak şekilde 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarın.
    NOT: DRG kırpma, kesme ve gömme, aseptik bir çalışma alanı sağlamak için laminer akış kabininde yapılmalıdır. Laminer akış kabininin yokluğunda, minimum uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) önerilir (laboratuvar önlüğü, maskeler, gözlükler ve eldivenler) ve potansiyel kontaminasyonu azaltmak için süreç boyunca sterilize edilen tüm aletler ile aseptik tekniklere uyulmalıdır.

9. Kollajen nötralizasyonu

  1. DRG'leri kestikten ve kestikten sonra kollajeni DRG hasadı ile aynı gün nötralize edin.
  2. Buz üzerinde çalışırken, toplam çözelti hacminin ~%8,16'sı ultra saf su, ~%1,84'ü 1 M sodyum hidroksit (NaOH), ~%10'u 10x PBS ve ~%80'i kolajeni bir cam şişeye pipetleyin.
  3. Karışıma kolajeni (genellikle en son eklenir) pipetlemek için steril, düşük tutmalı bir pipet ucu kullanarak yavaşça karıştırın. Kabarcık oluşmasını önlemek için karıştırırken pipet ucunu solüsyonun içinde tuttuğunuzdan emin olun. ~ 7 olduğundan emin olmak için pH şeritleri kullanarak nötralize edilmiş kollajenin pH'ını kontrol edin.
    NOT: Nötralize kollajen jelleşmeden 2-3 saat buz üzerinde tutulabilir; Bu nedenle, kollajen nötralize edildikten sonra hidrojel üretimi hızlı bir şekilde yapılmalıdır.

10. Hidrojel imalatı

  1. Buz üzerinde çalışarak, laminini (0.75 mg / mL'lik nihai konsantrasyona kadar) ve 1x PBS'yi bir cam şişeye pipetleyin.
  2. Steril düşük retansiyonlu pipet uçları kullanarak, istenen konsantrasyona ulaşmak için karışıma nötralize kollajen ve MAHA solüsyonu pipetleyin.
  3. Yavaşça karıştırın ve elde edilen hidrojelin pH'ını kontrol edin (~ 7 olmalıdır).

11. DRG yerleştirme

  1. Çok bölmeli gömme işlemi gerçekleştirin.
    1. Önceden karıştırılmış hidrojelden sırasıyla 65.1 μL ve 52.8 μL'yi soma ve nörit bölmelerine pipetleyin.
      NOT: Bu, MC cihazlarının 48 oyuklu bir plakada kullanıldığını varsayar. Bu hacimler, kullanılan MC cihazının boyutuna göre değiştirilebilir.
    2. Kesilen DRG'leri soma bölmesine nazikçe gömün (Şekil 2A), kuyu plakasının tabanını çizmediklerinden emin olun. DRG'yi ortasına yerleştirin, böylece nöritler tüneller aracılığıyla bitişik bölmelere büyüyebilir.
    3. Hidrojeli inkübatörde 37 °C'de 30 dakika boyunca termal çapraz bağlayın. Bu olurken, ısınmak için UV lambasını açın.
    4. Termal çapraz bağlamadan sonra, hidrojeli 90 saniye boyunca UV çapraz bağlayın.
    5. Hidrojel ve DRG'ye DRG büyüme ortamı ekleyin ve ortamda kalan reaksiyona girmemiş veya kalan foto başlatıcı izlerini ortadan kaldırmak için bir saat sonra tam bir ortam değişikliği gerçekleştirin.
    6. Her 3 günde bir yarım ortam değişimi yapın ve mikroskop altında görüntüleyerek DRG'lerin büyümesini izleyin.
    7. ~4 hafta sonra, DRG nöritleri büyümeye başladığında (Şekil 3A), floresan plaka görüntüleyici ile görüntüler yakalayın ve FIJI (ImageJ) kullanarak nöritlerin uzunluğunu ölçün.

12. DRG yerleştirmeyi kontrol edin

  1. 48 oyuklu bir plakaya (MC olmadan) 250 μL hidrojel pipetleyin.
  2. Kesilen DRG'yi nazikçe kuyunun ortasına ve yarısına kadar hidrojelin içine yerleştirin, böylece kuyu plakasının tabanını çizmediğinden emin olun.
  3. Hidrojeli inkübatörde 37 °C'de 30 dakika boyunca termal çapraz bağlayın.
  4. Hidrojeli 90 saniye boyunca UV çapraz bağlayın.
  5. Hidrojel ve DRG'ye DRG büyüme ortamı ekleyin ve bir saat sonra tam bir ortam değişikliği gerçekleştirin.
  6. Her 3 günde bir yarım ortam değişimi yapın ve DRG'nin büyümesini mikroskop altında görüntüleyerek izleyin.
  7. ~4 hafta sonra, DRG nöritleri büyümeye başladığında (Şekil 3B), floresan plaka görüntüleyici ile görüntüler yakalayın.
    NOT: Herhangi bir parlak alan mikroskobu görüntüleme için çalışacaktır. Otomatik plaka bazlı mikroskop bu işlemi daha hızlı hale getirir. Çok bölmeli DRG nöritlerinin büyümesini karşılaştırmak için cihaz olmadan düz jellere kontrol gömme yapılır. Kullanıcılar, DRG'lerin MC ve kontrol jellerinde benzer şekilde büyüdüğünü doğruladıktan sonra, her seferinde kontrol jellerini tekrarlamaları gerekmeyebilir.

13. DRG görüntüleme

  1. Tüm DRG ve MC Cihazını görselleştirmek için çeşitli odak mesafelerinde bir floresan plaka görüntüleyici kullanarak 4x büyütmede parlak alan görüntüleri yakalayın.
  2. Nöritleri görüntülemeyi kolaylaştırmak için görüntünün parlaklığını ve kontrastını ayarlayın.
  3. Görüntüyü .tiff dosyası olarak kaydedin.

14. DRG nörit miktar tayini

  1. FIJI'yi (ImageJ) indirin ve yükleyin.
  2. ImageJ'yi açın. Görüntü dosyasını açın ve dosyanın tek renkli olduğundan emin olun.
  3. En küçük nöritler görünür olacak şekilde kontrastı artırın. Bunu, Ctrl+Shift+C kısayolunu kullanarak parlaklık ve kontrast seçeneğini açarak yapın.
  4. Nöritleri görselleştirmek için denetleyicinin kaydırıcılarını gerektiği gibi ayarlayın ve istenen parlaklık ve kontrast için Uygula'ya tıklayın.
  5. Eklentiler menüsünü açarak, Segmentasyon'u seçerek ve Simple Neurite Tracer'a tıklayarak nörit izleyiciyi açın.
  6. Nöritin bir ucuna DRG gövdesine doğru tıklayarak yeni bir izleme başlatın.
  7. Nörit uçtan uca izlenene kadar bir iz eklemek için nörit boyunca başka bir noktaya tıklayın. Nöritin izini sürdükten sonra Finish Path'e tıklayın.
  8. İzlenen uzunluğu gerçek birimlere dönüştürün ve sonuçları kopyalayıp Excel'e yapıştırarak kaydedin.
  9. Ölçek çubuğuyla aynı uzunlukta bir çizgi çizmek için FIJI'deki düz çizgi aracını kullanın (çizginin sonunu bırakmadan) ve araç çubuğunun altında görünen uzunluk değerine bakın. Uzunluk değeri dönüştürme için kullanılır.
  10. DRG'nin her iki tarafından uzanan altı uzun nöritin uzunluğunu ölçün (Şekil 3C,D) ve Şekil 4'te gösterildiği gibi DRG'nin temsili bir ortalama uzunluğunu vermek için bu nöritlerin ortalama uzunluğunu hesaplayın.
    NOT: İmmün boyama, nöronal olmayan destek hücrelerinin varlığını göstermek için düz jellerdeki DRG eksplantları üzerinde test edilmiştir7. DRG'ler oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitlenir, 1 x PBS ile 15 dakika boyunca üç kez yıkanır ve immün boyamaya kadar 4 ° C'de 1x PBS'de saklanır.
  11. MC cihazlarındaki eksplantlar için, MC cihazını çıkarın ve yukarıda açıklanan işlemin aynısını izleyin7.

Sonuçlar

Mevcut protokol, çok bölmeli (MC) bir cihazda yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından DRG'yi hasat etmek ve kültürlemek için bir teknik tanımladı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, yetişkin sıçanlardan hasat edilen DRG kesildi ve ~ 0.5 mm'ye kesildi. Kesilmiş ve kesilmiş DRG'ler daha sonra MC cihazının soma bölgesinde bir hidrojel içine gömüldü (Şekil 2) ve nörit miktar tayininden önce 27 gün boyunca kültürlendi. DRG, ...

Tartışmalar

Bu protokol, yetişkin Sprague Dawley DRG'lerini hasat etmek ve bunları 3D doğal hidrojellerde kültürlemek için bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir. Bu yöntemin aksine, farelerden ve sıçanlardan DRG'lerin toplanmasına yönelik diğer yaklaşımlar, omurganın izole edilmesini içerir. Eksize edilen omurga yarıya indirilir ve omurilikDRG 23,24,25'i ortaya çıkarmak için çıkarılır. Omuriliğin hasar görmesi kan ...

Açıklamalar

Bu çalışmanın yazarları herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmişlerdir.

Teşekkürler

Bu çalışma bir NSF Hibesi (2152065) ve bir NSF KARİYER Ödülü (1846857) ile desteklenmiştir. Yazarlar, bu protokole katkıda bulundukları için Wachs Lab'ın mevcut ve geçmiş tüm üyelerine teşekkür eder. Şekil 1'deki diyagramlar Biorender'da yapılmıştır.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
#5 forcepsFine Science Tools11252-00For trimming and cutting DRG
10x DMEMMilliporeSigmaD2429
1x PBS (autoclaved)Prepared in lab7.3 - 7.5 pH
24 well platesVWR82050-892To temporarily store harvested and cut DRGs
3 mL Syringe sterile, single useBD309657
48 well platesGreiner Bio-One677180
60 mm Petri dishFisher ScientificFB0875713ATo hold media for trimming and cutting
Aluminium foilFisherbrand01-213-104
B27 Plus 50xThermoFisher17504044For DRG media
Collagen type IIbidi50205
Curved cup Friedman Pearson RongeurFine Science Tools16221-14For dissection
Dumont #3 forcepsFine Science Tools11293-00For dissection
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher16000044For DRG media
Form cureForm Labscuring agent
Form washForm LabsTo wash excess resins off MC
Glass bead sterilizerFisher ScientificNC9531961
Glass vials (8 mL)DWK Life Sciences (Wheaton)224724
GlutaMaxThermoFisher35050-061For DRG media
HEPES (1M)Millipore SigmaH0887
High temp V2 resinFormLabsFLHTAM02
Hyaluronic Acid Sodium SaltMilliporeSigma53747Used to make MAHA
IrgacureMilliporeSigma410896
LamininR&D Systems344600501
Large blunt-nose scissorsMilitexEG5-26For dissection
Large forceps (serrated tips)Militex9538797For dissection
Large sharp-nosed scissorsFine Science Tools14010-15For dissection
Low Retention pipette tipsFisher Scientific02-707-017For pipetting collagen and MAHA
Methacrylated hyaluronic acid (MAHA)Prepared in labN/A85 - 115 % methacrylation
Nerve Growth Factor (NGF)R&D Systems556-NG-100For DRG media
Neurobasal A MediaThermoFisher10888022For DRG media
ParafilmBemisPM996
ParafilmBemisPM996
Penicillin/Streptomycin (PS)EMD Millipore516106For DRG media
pH test stripsVWR InternationalBDH35309.606
Pipette tips (1000 µL)USA Scientific1111-2021
Preform 3.23.1 softwareFormslabTo upload STL file
RatCharles River
Resin 3D printerForm LabsForm 3L3D printing MC device
Small sharp-nosed scissorsFine Science Tools14094-11For dissection
Sodium bicarbonateMilliporeSigmaS6014
Straight cup rongeurFine Science Tools16004-16For dissection
Straight edge spring scissorsFine Science Tools15024-10For dissection
Surgical Scaplel blade (No. 10)Fisher Scientific22-079-690
Syring filters, PES (0.22 µm)Celltreat229747
Tiny spring scissorsWorld Precision Instruments14003For trimming and cutting DRG
UV lampAnalytik Jena USTo photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2)

Referanslar

  1. Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: A systematic analysis for the global burden of disease study 2015. Lancet. 388 (10053), 1545-1602 (2016).
  2. Goldberg, D. S., Mcgee, S. J. Pain as a global public health priority. BMC Public Health. 11 (1), 770 (2011).
  3. Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
  4. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  5. Im, H. J., et al. Alteration of sensory neurons and spinal response to an experimental osteoarthritis pain model. Arthritis Rheum. 62 (10), 2995-3005 (2010).
  6. Jensen, T. S., Finnerup, N. B. Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: Clinical manifestations and mechanisms. Lancet Neurol. 13 (9), 924-935 (2014).
  7. Berge, O. G. Predictive validity of behavioral animal models for chronic pain. Br J Pharmacol. 164 (4), 1195-1206 (2011).
  8. Anderson, W. A., Willenberg, A. R., Bosak, A. J., Willenberg, B. J., Lambert, S. Use of a capillary alginate gel (capgel™) to study the three-dimensional development of sensory nerves reveals the formation of a rudimentary perineurium. J Neurosci Methods. 305, 46-53 (2018).
  9. Mohammed Izham, N. A., et al. Exploring the possibilities of using in vitro model for neuropathic pain studies. Neurosci Res Notes. 5, 144 (2022).
  10. Park, S. E., et al. A three-dimensional in vitro model of the peripheral nervous system. NPG Asia Mater. 13 (1), 2 (2021).
  11. Caparaso, S. M., Redwine, A. L., Wachs, R. A. Engineering a multi-compartment in vitro model for dorsal root ganglia phenotypic assessment. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 111 (11), 1903-1920 (2023).
  12. Krug, A. K., et al. Evaluation of a human neurite growth assay as specific screen for developmental neurotoxicants. Arch Toxicol. 87 (12), 2215-2231 (2013).
  13. F, M., et al. Extracellular matrix stiffness negatively affects axon elongation, growth cone area and F-actin levels in a collagen type I 3D culture. J Tissue Eng Regen Med. 16 (2), 151-162 (2021).
  14. Spearman, B. S., et al. Tunable methacrylated hyaluronic acid-based hydrogels as scaffolds for soft tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. 108 (2), 279-291 (2020).
  15. Zhu, W., Oxford, G. S. Differential gene expression of neonatal and adult DRG neurons correlates with the differential sensitization of TRPV1 responses to nerve growth factor. Neurosci Lett. 500 (3), 192-196 (2011).
  16. Van De Wijdeven, R., et al. Structuring a multi-nodal neural network in vitro within a novel design microfluidic chip. Biomed Microdevices. 20, 1-8 (2018).
  17. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  18. Ng, B. K., Chen, L., Mandemakers, W., Cosgaya, J. M., Chan, J. R. Anterograde transport and secretion of brain-derived neurotrophic factor along sensory axons promote Schwann cell myelination. J Neurosci. 27 (28), 7597-7603 (2007).
  19. Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent drg neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
  20. Seidlits, S. K., et al. The effects of hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties on neural progenitor cell differentiation. Biomaterials. 31 (14), 3930-3940 (2010).
  21. Tomal, W., Ortyl, J. Water-soluble photoinitiators in biomedical applications. Polymers. 12 (5), 1073 (2020).
  22. Leary, S., et al. Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. Veterinary Medical Association. , (2013).
  23. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Res Notes. 9 (1), 82 (2016).
  24. Naveed, M., et al. Simple methods of dissection protocols for the rapid isolation of rat dorsal root ganglia under the non-microscopic condition. Neuroscience Research Notes. 6 (2), 212 (2023).
  25. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
  26. Bai, X., et al. A high-resolution anatomical rat atlas. J Anatomy. 209 (5), 707-708 (2006).
  27. Bian, L., et al. The influence of hyaluronic acid hydrogel crosslinking density and macromolecular diffusivity on human MSC chondrogenesis and hypertrophy. Biomaterials. 34 (2), 413-421 (2013).
  28. Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. Human dorsal root ganglia. Front Cell Neurosci. 13, 271 (2019).
  29. Schwaid, A. G., Krasowka-Zoladek, A., Chi, A., Cornella-Taracido, I. Comparison of the rat and human dorsal root ganglion proteome. Scientific Rep. 8 (1), 13469 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Dorsal K k GangliyonlarDRGn Vitro ModelPeriferik N ronlarNosisept r A r Duyarl lok Kompartman K lt rHidrojelN ral mm n Etkile imlerA r Ara t rmalar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır