استخدام نموذج قلب الفئران العامل المعزول لاختبار استراتيجيات الحفاظ على قلب المتبرع

Summary

نصف بروتوكول قلب الفئران العامل المعزول خارج الجسم الحي لاختبار استراتيجيات الحفاظ على قلب المتبرع. تصف هذه الورقة بروتوكول الاستخدام في التخزين البارد الثابت لقلوب المتبرعين بالقوارض. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام البروتوكول لقلوب المتبرعين التي تم الحصول عليها بعد التبرع بعد الموت أثناء الدورة الدموية وموت الدماغ.

Abstract

لعب تحسين حلول الحفاظ على قلب المتبرعين دورا رئيسيا في الحد من إصابة نقص التروية وإعادة التروية في قلوب المتبرعين أثناء استرجاع الأعضاء ونقلها وزرعها. أظهر العمل السابق من مختبرنا أن إضافة ثلاثي نترات الجلسريل والإريثروبويتين إلى حلول الحفاظ على قلب المتبرع يمكن أن يحسن بشكل كبير من تعافي وظائف القلب بعد التخزين البارد لفترات طويلة والتبرع بعد قلوب الموت في الدورة الدموية. تم تنفيذ بروتوكول المكملات هذا في الاستخدام السريري في وحدات الزرع في جميع أنحاء أستراليا وبلجيكا والمملكة المتحدة. هنا ، نحدد بروتوكولا لاختبار استراتيجيات المكملات باستخدام دائرة تروية قلب الفئران العامل المعزول خارج الجسم الحي (IWRH). باستخدام هذه المنهجية ، يمكن اختبار استراتيجيات المكملات في سياق التخزين الساكن البارد لفترات طويلة ، والتبرع بعد موت الدماغ ، والتبرع بعد الحفاظ على قلب المتبرع بالدورة الدموية. يمكن استخدام الانتعاش الوظيفي للقلب ، الذي يقاس بتدفق الأبهر ، والتدفق التاجي ، والنتاج القلبي ، وضغط النبض ، ومعدل ضربات القلب ، لتحديد ما إذا كانت استراتيجية حفظ معينة يمكن أن تقلل من إصابة نقص التروية وإعادة التروية في قلب المتبرع.

Introduction

يمكن أن يتأثر نجاح عملية زرع القلب بشكل كبير بطريقة الحفظ المستخدمة لقلب المتبرع. تتعرض قلوب المتبرعين لإهانات إقفارية طوال عملية استرجاع الأعضاء ونقلها وزرعها. يمكن التخفيف من درجة الضرر الإقفاري الذي يلحق بالعضو المتبرع عن طريق اختيار استراتيجية مناسبة للحفاظ على قلب المتبرع. يظل التخزين الساكن البارد (CSS) الطريقة الأكثر جدوى وشيوعا للحفاظ على قلب المتبرع. ومع ذلك ، قد لا يكون CSS بالضرورة هو الخيار الأفضل لجميع مسارات التبرع بالقلب. على سبيل المثال ، يتم الحفاظ على القلوب التي تم شراؤها عن طريق التبرع بعد مسار الموت الدوري (DCD) وتقييمها للتأكد من صلاحيتها باستخدام نضح الآلة القياسي ، في حين يمكن الحفاظ على القلوب التي يتم شراؤها عن طريق التبرع بعد موت الدماغ (DBD) باستخدام CSS أو التروية الآلية المنخفضة للحرارة. محدد مهم آخر لاستراتيجية الحفظ المستخدمة هو مقدار نقص التروية الدافئ (ل DCD) أو نقص التروية الباردة (ل DBD) الذي يتعرض له القلب أثناء شراء الأعضاء ونقلها.

تستخدم العديد من المراكز مكملات دوائية إضافية لمحلول الحفاظ على القلب لزيادة تحمل الإقفار وتحسين وظيفة القلب بعد الزراعة. أظهرت دراسات القوارض من مختبرنا أن مكملات شلل القلب مع الإريثروبويتين والجليسريل ثلاثي نترات كانت قادرة على تحسين الانتعاش الوظيفي للقلب بشكل كبير بعد التخزين البارد لفترات طويلة لقلب المتبرع^1،2. ثم تقدمت هذه الدراسات إلى دراسات الخنازير للحفاظ على قلب المتبرعين وقدمت الأساس قبل السريري الذي أدى إلى دمج الإريثروبويتين والجلسريل ثلاثي نترات في محلول شلل القلب للقلوب الذي تم شراؤه عبر مسار DCD باستخدام نضح آلة الحرارة^{العادية 3،4،5}. حاليا ، يتم استخدام مكملات الإريثروبويتين وثلاثي نيترات الجلسريل أيضا في وحدات الزرع الأسترالية لاسترجاع القلب السريري DBD الذي يتضمن CSS. الهدف العام لبروتوكول نضح قلب الفئران العامل المعزول (IWRH) الموضح أدناه هو اختبار استراتيجيات الحفاظ على قلب المتبرع في بيئة معملية واختبار فعاليتها في الحفاظ على وظيفة قلب المتبرع بعد إعادة التروية. تم استخدام بروتوكول قلب الفئران العامل المعزول الموصوف لأكثر من عقدين من الزمن داخل مختبرنا وأثبت أنه مفيد للغاية في فحص المكملات الغذائية و / أو الاستراتيجيات المحتملة التي يمكن أن تحسن الحفاظ على قلب المتبرع^2،7،8،9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تلقت جميع رعاية إنسانية وفقا لإرشادات المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (أستراليا). تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات التابعة لمعهد غارفان للبحوث الطبية (سيدني ، أستراليا).

1. تحضير المخزن المؤقت Krebs-Henseleit (KH)

1. قم بإعداد 2 لتر من محلول مخزون 20x من KH المخزن المؤقت الذي يحتوي على 2.36 M كلوريد الصوديوم ، 0.094 M KCl ، 0.024 M MgSO₄ ، 0.024 M KH₂PO₄. Aliquot في أنابيب 50 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
2. قبل التجربة ، قم بإعداد قارورتين 2 لتر من Erlenmyer من 1x KH buffer تحتوي على 1900 مل من الماء منزوع الأيونات ، و 100 مل من مخزن KH 20x ، و 4.20 جم من NaHCO₃ (25 ملم) ، و 3.96 جم من الجلوكوز (11 مل).
   1. ضع قوارير عازلة في حمام مائي 37 درجة مئوية وقم بغاز المحلول بالكربوجين (95٪ أكسجين ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، ضبط معدل التدفق على 2 لتر / دقيقة) عبر أحجار الهواء (مرشح مدخل الانزلاق) لمدة 5 دقائق ، ثم أضف 2.8 مل من 1 M CaCl₂ (1.4 مل). استمر في غلي المحلول لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل بدء التجربة. يساعد استخدام حجر الهواء في التهوية المنتظمة للمخزن المؤقت.
   2. ضع حجما صغيرا (~ 50 مل) من المخزن المؤقت في طبق معدني دائري عند -20 درجة مئوية ليبرد ويشكل طبقة من العازلة المثلجة.

2. إعداد دائرة التروية

1. تأكد من نظافة جميع الأنابيب والأواني الزجاجية مع عدم وجود نمو / تلوث مرئي.
2. إعداد ارتفاعات الغرف الزجاجية لتتوافق مع ضغوط التروية المطلوبة على أساس ارتفاع₂درجة حرارة 1 سم يعادل 1.36 مم زئبق: لانغندورف إلى القلب 100 سم (حوالي 75 مم زئبق)، العمل قبل التحميل من جانب إلى قلب 15 سم (حوالي 11 مم زئبق)، حجرة من القلب إلى الحمل اللاحق 100 سم (حوالي 75 مم زئبق).
3. ابدأ تدوير الماء الساخن حول الدائرة قبل 10 دقائق على الأقل من نضح القلب.
4. ضع مرشحات الألياف الدقيقة (1.2 ميكرومتر) في حاملات المرشحات وثبتها بإحكام.
5. قم بتجهيز الدائرة باستخدام المخزن المؤقت KH ، مما يضمن إزالة كل الهواء ، واستخدم مشبك أنبوب التحكم في التدفق لضبط التدفق على جانب Langendorff (الشكل 1A ، B) إلى ~ 50 مل / دقيقة. يسمح التدفق البطيء بسهولة قنية الأبهر ويمنع إزاحة القلب قبل الربط. ضع مقياس حرارة داخل الدائرة عبر موصل أنبوب على شكل حرف T لمراقبة درجة حرارة المخزن المؤقت عند ~ 37 درجة مئوية.

3. إعداد برنامج مخطط المختبر (تحليل البيانات)

1. تأكد من تشغيل Powerlab (نظام الحصول على البيانات) ومقياس الجريان وتوصيلهم بالكمبيوتر قبل فتح برنامج تحليل البيانات.
2. افتح ملفا جديدا.
3. يمكنك إعداد جمع البيانات عن طريق تحديد القائمة المنسدلة الإعدادات واختيار إعدادات القناة. حدد ضغط الأبهر وتدفق الأبهر ومعدل ضربات القلب (الشكل 2 أ).
4. قم بإعداد كل قناة بالإعدادات الموضحة في الشكل 2 ب.

4. تحضير لعزل قلب الفئران

ملاحظة: فيما يلي طريقة عزل قلب الفئران والتروية للقلوب غير DBD وغير DCD للتخزين الساكن البارد. تتشابه طرق أجهزة القلب في دائرة التروية نسبيا بغض النظر عن طريقة التبرع المستخدمة. تحدث الاختلافات في بروتوكول التبرع بقلب الفئران DBD و DCD بشكل أساسي من وقت سريان التخدير الحيواني إلى وقت استئصال القلب من.

1. قم بوزن ، مع التأكد من أن وزنه >330 جم. نطاق الوزن المثالي لذكور الفئران هو 330-420 جم.
2. يتم تطبيق حقنة داخل الصفاق من الكيتامين (80 ملغ/كغ) والزيلازين (10 ملغ/كغ). تأكد من مستوى التخدير الجراحي المناسب بناء على عدم وجود منعكس دواسة (منعكس قرصة إصبع القدم) وانعكاس وميض العين.
3. ضع في وضع ضعيف ، وقم بتأمين الأطراف بشريط لاصق. قم بإعطاء الأكسجين للحيوان عبر مخروط الأنف.
4. احصل على حاوية معدنية من الثلج عازلة KH وحاوية معدنية صغيرة بها ثلج في محطة التشريح. انقع شاشا مقاس 7.5 سم × 7.5 سم في مخزن KH وضعه على الحاوية مع الثلج.
5. بمجرد التأكد من مستوى التخدير الجراحي الكافي ، احلق الجلد في موقع الشق الجراحي ونظف الجلد بمادة معقمة مثل البيتادين أو 70٪ كحول. قم بعمل شق جانبي عبر البطن (بضع البطن) وحرك المعدة والأمعاء إلى الجانب للسماح بالوصول إلى الوريد الكلوي الأيسر. حقن 1500 وحدة دولية من الهيبارين واضغط على موقع الحقن حتى يتوقف النزيف. اترك 1-2 دقيقة حتى يدور الهيبارين قبل الاستمرار في استرجاع القلب.
6. افتح تجويف الصدر عن طريق قطع القفص الصدري على كلا الجانبين وقطع الحجاب الحاجز. أمسك كتلة القلب والرئة وارفعها بحذر أثناء قطع الشريان الأورطي الهابط ، مع التأكد من بقاء قوس الأبهر سليما. سيسمح ذلك بطول الشريان الأورطي الكافي للبقاء للقنية.
7. يتم القتل الرحيم للفأر عن طريق إزالة القلب والرئتين أثناء التخدير. اغمر كتلة القلب والرئة في طين الجليد العازل KH للسماح للقلب بالاعتقال.

5. قنبل القلب على دائرة نضح القلب العاملة المعزولة

1. انقل كتلة القلب والرئة إلى شاش على الجليد. قم بتشريح الدهون الزائدة حول الشريان الأورطي ، وقم بقص الشريان الأورطي ليترك طولا 3-5 مم للقنية ، وقم بعمل شق صغير ~ 1-2 مم في الشريان الرئوي. سيسمح ذلك بمسار للنفايات السائلة التاجية.
2. ضع كتلة القلب والرئة المشذبة (بينما لا تزال على الجليد) أسفل القنيات مباشرة. اضبط التدفق من جانب Langendorff باستخدام مشبك أنبوب التحكم في التدفق لتسهيل قنية الأبهر. قم بتقطيع الشريان الأورطي بعناية على القنية اليسرى ، وامسكه بمشبك أسود ، واربطه بخياطة حريرية 2-0.
3. قم بزيادة التدفق من نضح Langendorff عن طريق فتح مشبك أنبوب التحكم في التدفق بالكامل. افتح مشبك ما بعد التحميل. تأكد من وجود تدفق مستمر من غرفة Langendorff. ابدأ في مراقبة نشاط القلب باستخدام البرنامج.
   ملاحظة: إذا كانت قيمة تدفق الأبهر على شاشة مقياس الجريان <10 مل / دقيقة ، فتأكد من أن بضع الشرايين الرئوية بحجم كاف. يمكن أن يشير تتبع / قيمة تدفق الأبهر المنخفض أيضا إلى أن قنية الأبهر قد تم إدخالها بعيدا جدا.
4. اضبط كتلة القلب والرئة بحيث يكون السطح الأمامي للرئتين مواجها للمشغل. اربط فص الرئة الأيسر بخياطة حريرية 2-0 واقطع أنسجة الرئة اليسرى الزائدة. اربط فصوص الرئة المتبقية في عملية مسح واحدة بخياطة حريرية 2-0 وقطع الأنسجة. قم بتدوير القلب بحيث تكون الرئتان المقيدتان باتجاه الخلف.
5. باستخدام مقص Vannas الصغير ، قم بقص حافة 2-3 مم من الزائدة الأذينية اليسرى ، مما يضمن تحقيق فتحة صغيرة في الأذينين. قم بتدوير الملحق الأذيني الأيسر بعناية إلى القنية اليسرى ، وامسكه بمشبك أسود ، واربطه بخياطة حريرية 2-0. يوضح الشكل 3 أ وضع كلا القنيات.
6. اضبط سترة الماء في حجرة القلب بحيث يجلس القلب داخل وسط الغرفة.
7. افتح محول الضغط في الهواء وقم بتصفير محول الضغط في البرنامج عن طريق تحديد القائمة المنسدلة للضغط الأبهري > Bridge Amp > Zero. انقر فوق موافق.
8. قم بتنقيب القلب في وضع Langendorff لمدة 10 دقائق. تأكد من أن تدفق الأبهر Langendoff يقيس بين 10-20 مل / دقيقة (مثالي 20 مل / دقيقة).
9. قبل تبديل وضع العمل ، تأكد من وضع حجر الهواء (مرشح المدخل المنزلق) من خزان Langendorff KH العازل في خزان KH العازل العامل.
10. قم بتبديل القلب إلى وضع العمل عن طريق إغلاق المشبك الكبير المؤدي إلى قنية الأبهر وفتح التدفق المؤدي إلى الزائدة الأذينية اليسرى. فتح الصنبور ثلاثي الاتجاهات يؤدي من التعقيم العمل. انقل أنبوب الإرجاع المشترك (إعادة المخزن المؤقت KH إلى الخزان) من خزان Langendorff إلى خزان العمل.
11. قم بتفريخ القلب في وضع العمل لمدة 15 دقيقة. يجب أن تكون قيم تدفق الأبهر من الناحية المثالية >30 مل / دقيقة في نهاية 15 دقيقة من التروية. بمجرد استقرار القلب ، ابدأ في تسجيل البيانات في برنامج تحليل البيانات.
12. قم بقياس النفايات السائلة التاجية (تدفق الشريان التاجي) في 1 دقيقة و 5 دقائق و 10 دقائق و 15 دقيقة.
    ملاحظة: يجب أن تكون قيم التدفق التاجي بين 10-20 مل / دقيقة. يشير التدفق التاجي الأكبر من 22 مل / دقيقة بشكل عام إلى تسرب ينشأ من وعاء رئوي غير مقيد. يجب أن يكون معدل ضربات القلب بين 200-300 نبضة في الدقيقة. يمكن جمع النفايات السائلة التاجية لتحليل المصب لعلامات إصابة الأنسجة (على سبيل المثال ، التروبونين I ، إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات).

6. إدارة شلل القلب للتخزين البارد للقلب

1. املأ حجرة شلل القلب (الموضوعة على ارتفاع 60 سم لإنتاج ضغط نضح يبلغ حوالي 40 مم زئبق) ب 50 مل من محلول الحفاظ على القلب المخصص (مع أو بدون مكملات).
2. اخفض سترة الماء وأغلق الصنبور ثلاثي الاتجاهات على جانب وضع العمل.
3. أوقف التدفق نحو القنية الأذينية اليسرى عن طريق إغلاق المشبك.
4. افتح التدفق إلى قنية الأبهر.
5. أغلق المشبك من جانب Langendoff وعلى التحميل اللاحق.
6. افتح المشبك من خط شلل القلب واغسل 15 مل من شلل القلب من خط الضغط. أغلق الصنبور عند خط الضغط.
7. اسمح للقلب باحمرار شلل القلب عبر قنية الأبهر وجمع النفايات السائلة التاجية. قم بتشغيل شلل القلب لمدة 3 دقائق وسجل حجم شلل القلب الذي يتم إعطاؤه.
8. توقف عن تسجيل البيانات في البرنامج واحفظ الملف.
9. بعد 3 دقائق ، أغلق مشبك شلل القلب والمشبك الأزرق الصغير المؤدي إلى قنية الأبهر.
10. ضع مشبك البلدغ على قنية الأبهر ومشبك بولدوج ثان على القنية اليسرى. افصل كتلة قنية القلب عن الدائرة وضعها في دورق يحتوي على شلل القلب في صندوق ثلج (الشكل 3 ب ، ج).
11. قم بتخزين القلب في الثلاجة لمدة 6 ساعات (أو وقت التخزين البارد المطلوب).

7. إعادة تروية القلب بعد التخزين البارد الساكنة

1. قم بإعداد المخزن المؤقت KH وفقا للقسم 1.
2. قم بتجهيز دائرة التروية وفقا للقسم 2.
3. افتح الملف المحفوظ من التروية الأساسية.
4. قم بإزالة كتلة قنية القلب بعناية من صندوق الثلج وثبتها في دائرة التروية. قبل إعادة توصيل قنية الأبهر ، استخدم حقنة غير حادة 18 G مملوءة بعازلة KH لإزالة أي هواء من القنية. قم بتوصيل قنية الأبهر أولا ، وافتح مشبك الأنبوب على جانب Langendorff ، وتأكد من فتح مشبك أنبوب ما بعد التحميل.
5. أعد توصيل القنية الأذينية اليسرى ، مع التأكد من إزالة الهواء من القنية قبل الاتصال بدائرة التروية. احتفظ بمشبك جانب العمل مغلقا حتى يحين وقت التبديل من Langendorff إلى وضع العمل.
6. قم بدمج القلب في وضع Langendorff لمدة 15 دقيقة. تأكد من بدء تسجيل البيانات في بداية إعادة تروية Langendorff.
7. قبل التبديل إلى وضع العمل ، ضع كلا الحجرين الفقاعيين في المخزن المؤقت KH ، وافتح الصنبور ثلاثي الاتجاهات على جانب العمل ، وانقل أنابيب الإرجاع الشائعة إلى خزان العمل.
8. أغلق مشبك Langendorff الأبيض ، وافتح المشبك الجانبي الأبيض ، وقم بنفخ القلب لمدة 30 دقيقة. قياس وجمع النفايات السائلة التاجية في نقاط زمنية محددة لتحليل المصب (على سبيل المثال ، علامات إصابة القلب). تأكد من إيقاف تسجيل البرنامج لإعادة تشغيله لبدء مقطع جديد (أو بدلا من ذلك، إضافة تعليق).
9. عند حوالي 15 دقيقة من إعادة التروية في وضع العمل ، أغلق الصنبور ثلاثي الاتجاهات.
10. في نهاية إعادة التروية ، احفظ ملف البيانات ، وأوقف التدفق عبر الدائرة ، وافصل كتلة القلب. جمع عينات البطين الأيسر للمعالجة النسيجية و / أو التجميد المفاجئ للدراسات المستقبلية (على سبيل المثال ، استخراج البروتين لدراسات اللطخة الغربية).
11. قم بإزالة المرشحات من حاملات المرشح ، واستنزاف المخزن المؤقت من الدائرة ، واغسلها مرتين ب 5 لترات من الماء المقطر.
    ملاحظة: على الرغم من أنه ليس ضروريا ، إلا أنه يساعد في تسخين الماء المقطر مسبقا في وعاء كبير داخل الحمام المائي.

8. تحليل الانتعاش الوظيفي

1. افتح ملف LabChart.
2. قم بتمييز منطقة لا تقل عن 30 ثانية من التسجيل، ثم انقر على > "الأوامر إضافة تحديد البيانات" أو الإضافة المتعددة إلى البيانات. سيؤدي هذا إلى إضافة المعلمات المطلوبة إلى ملف DataPad داخل البرنامج.
3. حدد القائمة المنسدلة نافذة > DataPad.
4. قم بتمييز قيم الاسترداد وانسخها من DataPad إلى جدول بيانات لتحليل الاسترداد الوظيفي. احسب الاسترداد الوظيفي كنسبة مئوية من قيمة خط الأساس^{الخاصة به 1،6،7}.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ستحدد نتائج التروية الأساسية ما إذا كانت التجربة الأولية (التخزين المسبق) ناجحة أم لا. يجب أن يتراوح تدفق الأبهر المعروض أثناء وضع Langendorff بين 14 - 22 مل / دقيقة. يتم عرض تدفق Langendorff كقيمة سالبة على مقياس التدفق بسبب التروية الارتجاعية للشريان الأورطي. يظهر مثال على أثر Langendorff ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نظرا للطبيعة الحساسة لوظيفة خط الأساس للقلب ، يجب توخي الحذر للحفاظ على جهاز التروية نظيفا وبمكونات متوافقة. على سبيل المثال ، يجب استخدام الأنابيب البلاستيكية الصحيحة. يمكن أن تساهم بعض مواد الأنابيب، مثل السيليكون، في انخفاض تدفق الأبهر والانقباض، والذي قد يكون بسبب ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit	ADInstruments	MLT1199	Data Acquisition
Bridge Amp	ADInstruments	FE221	Data Acquisition
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 thermometer	Hanna Instruments	HI98509	Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12	Thomas Scientific	2848Y40	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.	Thomas Scientific	8847T08	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.	Thomas Scientific	8847T02	Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure	Coherent Scientific	14121	Surgical Equipment
Closed Connector	Thomas Scientific	8847E25	Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24	Specialist Medical Supplies	S195	Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	To make Krebs Buffer
Dual Channel Console	ADInstruments	TS402	Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD	Coherent Scientific	14114	Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated	Met-App Australia Pty Ltd	1352	Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)	Thermoline Scientific	TU3	Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter	Thomas Scientific	8847V08	Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor	John Morris	1015164	Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved	Coherent Scientific	WPI-501748	Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight	Coherent Scientific	WPI-501252	Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS	John Morris	1014414	Mounting screws for pump heads
Open-sided connector	Thomas Scientific	8847E05	Rig Construction
Paraformadehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g	VWR Chemicals	26764.26	To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software	ADInstruments	ML826	Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK	Merck Millipore	SX0004701	Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK	Merck Millipore	XX1104707	Rig Construction
Single Buret Clamp	Thomas Scientific	8847T32	Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler)	Sigma-aldrich	59277	Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector	Thomas Scientific	8847E35	Rig Construction
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm	Merck Millipore	SX0004700	Rig Construction
syringes 1 mL box/100	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm	Met-App Australia Pty Ltd	1356	Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410	ADInstruments	TS410	Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades	Coherent Scientific	WPI-500-086	Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray	Thermoline Scientific	TLWB-30	Rig Construction