Usando um modelo isolado de coração de rato de trabalho para testar estratégias de preservação do coração do doador

Resumo

Descrevemos um protocolo de coração de rato isolado ex vivo para testar estratégias de preservação do coração do doador. Este trabalho descreve o protocolo para uso em armazenamento estático a frio de corações de doadores de roedores; no entanto, o protocolo também pode ser usado para corações de doadores obtidos após doação após morte circulatória e morte encefálica.

Resumo

A otimização das soluções de preservação do coração do doador tem desempenhado um papel fundamental na redução da lesão de isquemia-reperfusão em corações de doadores durante a recuperação, transporte e transplante de órgãos. Trabalhos anteriores de nosso laboratório mostraram que a adição de trinitrato de glicerila e eritropoietina às soluções de preservação cardíaca do doador poderia melhorar significativamente a recuperação funcional cardíaca após armazenamento refrigerado prolongado e na doação após morte circulatória de corações. Este protocolo de suplementação foi implementado em uso clínico em unidades de transplante na Austrália, Bélgica e Reino Unido. Aqui, descrevemos um protocolo para testar estratégias de suplementação usando um circuito de perfusão de coração de rato (IWRH) isolado ex vivo . Usando essa metodologia, as estratégias de suplementação podem ser testadas no contexto de armazenamento estático prolongado a frio, doação após morte encefálica e doação após preservação do coração do doador de morte circulatória. A recuperação funcional cardíaca, medida pelo fluxo aórtico, fluxo coronariano, débito cardíaco, pressão de pulso e frequência cardíaca, pode ser usada para determinar se uma estratégia de preservação específica pode minimizar a lesão de isquemia-reperfusão do coração doador.

Introdução

O sucesso de um transplante de coração pode ser muito influenciado pelo método de preservação usado para o coração do doador. Os corações dos doadores são submetidos a insultos isquêmicos durante todo o processo de recuperação, transporte e transplante de órgãos. O grau de dano isquêmico ao órgão doador pode ser mitigado selecionando uma estratégia apropriada de preservação do coração do doador. O armazenamento estático a frio (CSS) continua sendo o método mais viável e comum para a preservação do coração do doador; no entanto, o CSS pode não ser necessariamente a melhor opção para todas as vias de doação de coração. Por exemplo, os corações obtidos por meio da via de doação após morte circulatória (DCD) são mantidos e avaliados quanto à viabilidade usando perfusão de máquina normotérmica, enquanto os corações obtidos por meio da via de doação após morte encefálica (DBD) podem ser preservados usando CSS ou perfusão de máquina hipotérmica. Outro determinante importante para a estratégia de preservação utilizada é a quantidade de isquemia quente (para DCD) ou isquemia fria (para DBD) a que o coração é submetido durante a obtenção e transporte de órgãos.

Muitos centros usam suplementação farmacológica adicional da solução de preservação do coração para aumentar a tolerância isquêmica e melhorar a função cardíaca pós-transplante. Estudos com roedores de nosso laboratório mostraram que a suplementação de cardioplegia com eritropoietina e trinitrato de glicerila foi capaz de melhorar significativamente a recuperação funcional cardíaca após armazenamento prolongado no coração do doador ^1,2. Esses estudos então progrediram para estudos suínos de preservação do coração do doador e forneceram a base pré-clínica que levou à incorporação de eritropoietina e trinitrato de glicerila na solução de cardioplegia de corações obtidos por meio de uma via DCD utilizando perfusão normotérmica^{da máquina 3,4,5}. Atualmente, a suplementação com eritropoietina e trinitrato de glicerila também é usada em unidades de transplante australianas para recuperações cardíacas clínicas de DBD incorporando CSS. O objetivo geral do protocolo de perfusão de coração de rato de trabalho isolado (IWRH) descrito abaixo é testar estratégias de preservação do coração do doador em um ambiente de laboratório e testar sua eficácia para preservar a função cardíaca do doador após a reperfusão. O protocolo de coração de rato de trabalho isolado descrito tem sido usado há mais de duas décadas em nosso laboratório e tem se mostrado extremamente útil na triagem de potenciais suplementos e/ou estratégias que podem melhorar a preservação do coração do doador 2,7,8,9.

Protocolo

Todos os animais receberam cuidados humanitários em conformidade com as diretrizes do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (Austrália). Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Instituto Garvan de Pesquisa Médica (Sydney, Austrália).

1. Preparação do tampão Krebs-Henseleit (KH)

1. Prepare 2 L de uma solução estoque 20x de tampão KH contendo 2,36 M NaCl, 0,094 M KCl, 0,024 M MgSO₄, 0,024 M KH₂PO₄. Alíquota em tubos de 50 mL e armazenar a -20 °C.
2. Antes do experimento, prepare dois frascos Erlenmyer de 2 L de tampão KH 1x contendo 1900 mL de água deionizada, 100 mL de tampão KH estoque 20x, 4,20 g de NaHCO₃ (25 mM) e 3,96 g de glicose (11 mM).
   1. Colocar os balões tampão num banho-maria a 37 °C e aplicar gás à solução com carbógeno (oxigénio a 95%, dióxido de carbono a 5%, caudal regulado para 2 l/min) através de pedras de ar (filtro de entrada de encaixe) durante 5 min, depois adicionar 2,8 ml de CaCl₂ 1 M (1,4 mM). Continue borbulhando a solução por pelo menos 1 h antes do início do experimento. O uso de uma pedra de ar auxilia na aeração uniforme do amortecedor.
   2. Coloque um pequeno volume (~ 50 mL) de tampão em um prato redondo de metal a -20 ° C para esfriar e formar uma camada de tampão gelado.

2. Preparação do circuito de perfusão

1. Certifique-se de que todos os tubos e vidrarias estejam limpos, sem crescimento/contaminação visível.
2. Configure as alturas das câmaras de vidro para corresponder às pressões de perfusão necessárias com base em 1 cm H₂O sendo equivalente a 1.36 mmHg: Langendorff-to-heart 100 cm (aproximadamente 75 mmHg), pré-carga trabalhando lado a coração 15 cm (aproximadamente 11 mmHg), câmara coração-pós-carga 100 cm (aproximadamente 75 mmHg).
3. Inicie a circulação de água quente ao redor do circuito pelo menos 10 minutos antes da perfusão cardíaca.
4. Coloque filtros de microfibra (1.2 μm) nos porta-filtros e prenda-os firmemente.
5. Prepare o circuito com tampão KH, garantindo que todo o ar seja removido, e use uma braçadeira de tubulação de controle de fluxo para ajustar o fluxo no lado de Langendorff (Figura 1A, B) para ~ 50 mL / min. O fluxo mais lento permite facilitar a canulação da aorta e evita que o coração seja desalojado antes de amarrar. Coloque um termômetro dentro do circuito por meio de um conector de tubulação em forma de T para monitorar a temperatura do buffer em ~ 37 °C.

3. Configuração do software Lab Chart (análise de dados)

1. Certifique-se de que o Powerlab (sistema de aquisição de dados) e o medidor de vazão estejam ligados e conectados ao computador antes de abrir o software de análise de dados.
2. Abra um novo arquivo.
3. Configure a coleta de dados selecionando o menu suspenso Configurações e selecionando Configurações do canal. Selecione Pressão Aórtica, Fluxo Aórtico e Frequência Cardíaca (Figura 2A).
4. Configure cada canal com as configurações mostradas na Figura 2B.

4. Preparação do animal para isolamento do coração do rato

NOTA: A metodologia para isolamento e perfusão de coração de rato para corações não DBD e não DCD para armazenamento estático a frio é descrita abaixo. Os métodos de instrumentação cardíaca no circuito de perfusão são relativamente semelhantes, independentemente do método de doação usado. As diferenças no protocolo para doação de coração de rato DBD e DCD ocorrem principalmente desde o momento em que a anestesia animal faz efeito até quando o coração é excisado do animal.

1. Pese o animal, certificando-se de que seu peso seja de >330 g. A faixa de peso ideal para ratos machos é de 330-420 g.
2. Administre uma injeção intraperitoneal de cetamina (80 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Garanta um plano cirúrgico adequado de anestesia com base na ausência de reflexo podal (reflexo de pinça do dedo do pé) e reflexo de piscar os olhos.
3. Coloque o animal em decúbito dorsal, prendendo os membros com fita adesiva. Administre oxigênio ao animal por meio de um cone nasal.
4. Tenha o recipiente de metal de lama de gelo KH e um pequeno recipiente de metal com gelo na estação de dissecação. Mergulhe uma gaze de 7,5 cm x 7,5 cm em tampão KH e coloque-a no recipiente com gelo.
5. Uma vez confirmado o plano cirúrgico adequado da anestesia, raspe a pele no local da incisão cirúrgica e limpe a pele com asséptico, como betadine ou álcool a 70%. Faça uma incisão lateral no abdômen (laparotomia) e mova o estômago e os intestinos para o lado para permitir o acesso à veia renal esquerda. Injete 1500 UI de heparina e aplique pressão no local da injeção até que o sangramento pare. Aguarde 1-2 minutos para que a heparina circule antes de continuar com a recuperação cardíaca.
6. Abra a cavidade torácica cortando a caixa torácica de ambos os lados e cortando o diafragma. Segure e levante cuidadosamente o bloco coração-pulmão enquanto corta ao longo da aorta descendente, garantindo que o arco aórtico permaneça intacto. Isso permitirá que o comprimento da aorta permaneça suficiente para a canulação.
7. O rato é sacrificado pela remoção do coração e dos pulmões sob anestesia. Mergulhe o bloco coração-pulmão na lama de gelo tampão KH para permitir que o coração pare.

5. Canulação do coração no circuito de perfusão cardíaca de trabalho isolado

1. Transfira o bloco coração-pulmão para uma gaze no gelo. Disseque o excesso de gordura ao redor da aorta, apare a aorta para deixar 3-5 mm de comprimento para a canulação e faça uma pequena incisão ~ 1-2 mm na artéria pulmonar. Isso permitirá um caminho para o efluente coronário.
2. Coloque o bloco coração-pulmão aparado (ainda no gelo) diretamente sob as cânulas. Ajuste o fluxo do lado de Langendorff usando uma braçadeira de tubo de controle de fluxo para facilitar a canulação aórtica. Canule cuidadosamente a aorta na cânula esquerda, segure-a com uma pinça preta e amarre-a com uma sutura de seda 2-0.
3. Aumente o fluxo da perfusão de Langendorff abrindo completamente a braçadeira da tubulação de controle de fluxo. Abra o grampo de pós-carga. Certifique-se de que haja fluxo contínuo da câmara de Langendorff. Comece a monitorar a atividade cardíaca com software.
   NOTA: se o valor do fluxo aórtico no visor do medidor de vazão for <10 mL/min, certifique-se de que a arteriotomia pulmonar seja de tamanho suficiente. Um traço/valor de fluxo aórtico baixo também pode indicar que a cânula aórtica foi inserida demais.
4. Ajuste o bloco coração-pulmão de modo que a superfície anterior dos pulmões fique voltada para o operador. Amarre o lobo do pulmão esquerdo com uma sutura de seda 2-0 e corte o excesso de tecido do pulmão esquerdo. Amarre os lobos pulmonares restantes de uma só vez com uma sutura de seda 2-0 e corte o tecido. Gire o coração para que os pulmões amarrados fiquem voltados para trás.
5. Usando uma pequena tesoura Vannas, corte uma borda de 2-3 mm do apêndice atrial esquerdo, garantindo que uma pequena abertura nos átrios seja alcançada. Canine cuidadosamente o apêndice atrial esquerdo à cânula esquerda, segure-o com uma pinça preta e amarre-o com uma sutura de seda 2-0. A Figura 3A mostra a colocação de ambas as cânulas.
6. Ajuste a camisa de água da câmara cardíaca para que o coração fique no centro da câmara.
7. Abra o transdutor de pressão para ar e zere o transdutor de pressão no software selecionando o menu suspenso Pressão Aórtica > Bridge Amp > Zero. Clique em OK.
8. Perfunda o coração no modo Langendorff por 10 min. Certifique-se de que o fluxo aórtico de Langendoff mede entre 10-20 mL / min (ideal 20 mL / min).
9. Antes de alternar o modo de trabalho, certifique-se de que a pedra de ar (filtro de entrada deslizante) do reservatório de buffer Langendorff KH seja colocada no reservatório de buffer KH em funcionamento.
10. Coloque o coração no modo de trabalho fechando a pinça grande que leva à cânula aórtica e abrindo o fluxo que leva ao apêndice atrial esquerdo. Abra a torneira de três vias que sai do perfusato de trabalho. Transfira a tubulação de retorno comum (levando o tampão KH de volta ao reservatório) do reservatório de Langendorff para o reservatório de trabalho.
11. Perfunda o coração no modo de trabalho por 15 min. Os valores do fluxo aórtico devem ser idealmente >30 mL/min ao final de 15 min de perfusão. Assim que o coração se estabilizar, comece a registrar os dados no software de análise de dados.
12. Meça o efluente coronário (fluxo coronário) em 1 min, 5 min, 10 min e 15 min.
    NOTA: Os valores do fluxo coronariano devem estar entre 10-20 mL / min. Fluxo coronariano maior que 22 mL/min geralmente indica um vazamento originado de um vaso pulmonar desamarrado. A frequência cardíaca deve estar entre 200-300 bpm. O efluente coronariano pode ser coletado para análise a jusante de marcadores de lesão tecidual (por exemplo, troponina-I, liberação de lactato desidrogenase).

6. Administração de cardioplegia para armazenamento estático frio do coração

1. Encha a câmara de cardioplegia (posicionada a uma altura de 60 cm para produzir pressão de perfusão de aproximadamente 40 mmHg) com 50 mL de solução de preservação cardíaca designada (com ou sem suplementação).
2. Abaixe a camisa de água e feche a torneira de três vias no lado do modo de trabalho.
3. Pare o fluxo em direção à cânula atrial esquerda fechando a pinça.
4. Abra o fluxo para a cânula aórtica.
5. Feche o grampo do lado de Langendoff e na pós-carga.
6. Abra a pinça da linha de cardioplegia e elimine 15 mL de cardioplegia da linha de pressão. Feche a torneira na linha de pressão.
7. Permita que o coração seja lavado com cardioplegia através da cânula aórtica e colete o efluente coronário. Execute a cardioplegia por 3 min e registre o volume de cardioplegia administrado.
8. Pare de gravar dados no software e salve o arquivo.
9. Após 3 min, feche a pinça de cardioplegia e a pequena pinça azul que leva à cânula aórtica.
10. Coloque uma pinça de buldogue na cânula aórtica e uma segunda pinça de buldogue na cânula esquerda. Desconecte o bloco da cânula cardíaca do circuito e coloque-o em um béquer contendo cardioplegia em uma caixa de gelo (Figura 3B, C).
11. Guarde o coração na geladeira por 6 h (ou tempo de armazenamento refrigerado desejado).

7. Reperfusão cardíaca após armazenamento estático a frio

1. Prepare o tampão KH de acordo com a seção 1.
2. Prepare o circuito de perfusão conforme a seção 2.
3. Abra o arquivo salvo da perfusão da linha de base.
4. Remova cuidadosamente o bloco da cânula cardíaca da caixa de gelo e prenda-o no circuito de perfusão. Antes de reconectar a cânula aórtica, use uma seringa de ponta romba 18 G cheia de tampão KH para remover qualquer ar da cânula. Conecte a cânula aórtica primeiro, abra a braçadeira da tubulação no lado Langendorff e certifique-se de que a braçadeira da tubulação de pós-carga esteja aberta.
5. Reconecte a cânula atrial esquerda, certificando-se de que o ar foi removido da cânula antes de conectá-la ao circuito de perfusão. Mantenha o lado de trabalho clamp fechado até que seja hora de mudar do modo Langendorff para o modo de trabalho.
6. Perfunda o coração no modo Langendorff por 15 min. Certifique-se de iniciar o registro de dados no início da reperfusão de Langendorff.
7. Antes de mudar para o modo de trabalho, coloque as duas pedras borbulhantes no buffer KH, abra a torneira de 3 vias no lado de trabalho e transfira a tubulação de retorno comum para o reservatório de trabalho.
8. Feche o grampo Langendorff branco, abra o grampo lateral de trabalho branco e perfunda o coração por 30 min. Meça e colete efluentes coronários em pontos de tempo designados para análise a jusante (por exemplo, marcadores de lesão cardíaca). Certifique-se de parar e reiniciar a gravação do software para iniciar um novo segmento (ou, alternativamente, adicionar um comentário).
9. Com aproximadamente 15 minutos de reperfusão no modo de trabalho, feche a torneira de três vias.
10. No final da reperfusão, salve o arquivo de dados, interrompa o fluxo através do circuito e desconecte o bloqueio cardíaco. Colete amostras do ventrículo esquerdo para processamento histológico e/ou congeladas para estudos futuros (por exemplo, extração de proteínas para estudos de western blot).
11. Remova os filtros dos porta-filtros, drene o tampão do circuito e lave duas vezes com 5 L de água destilada.
    NOTA: Embora não seja necessário, ajuda a pré-aquecer a água destilada em um grande recipiente dentro do banho-maria.

8. Análise da recuperação funcional

1. Abra o arquivo LabChart.
2. Realce uma região de pelo menos 30 s de gravação e clique em Comando > Adicionar seleção de dados OU Adicionar vários dados aos dados. Isso adicionará os parâmetros desejados a um arquivo DataPad dentro do software.
3. Selecione o menu suspenso Janela > DataPad.
4. Realce e copie os valores de recuperação do DataPad para uma planilha para análise de recuperação funcional. Calcule a recuperação funcional como uma porcentagem de seu respectivo valor basal ^1,6,7.

Resultados

Os resultados da perfusão basal determinarão se o experimento inicial (pré-armazenamento) foi bem-sucedido. O fluxo aórtico exibido durante o modo de Langendorff deve estar entre 14 - 22 mL/min. O fluxo de Langendorff é exibido como um valor negativo no medidor de vazão devido à perfusão retrógrada da aorta. Um exemplo de um traço de Langendorff aceitável é mostrado na Figura 4A.

Uma vez alternado para o modo de trabal...

Discussão

Dada a natureza sensível da função basal do coração, deve-se tomar cuidado para manter o equipamento de perfusão limpo e com componentes compatíveis. Por exemplo, o tubo de PVC correto deve ser usado. Alguns materiais de tubulação, como silicone, podem contribuir para menor fluxo aórtico e contratilidade, o que pode ser devido à perda de oxigênio através da tubulação. Embora existam circuitos isolados de perfusão cardíaca de ratos disponíveis comercialmente, a maioria d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit	ADInstruments	MLT1199	Data Acquisition
Bridge Amp	ADInstruments	FE221	Data Acquisition
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 thermometer	Hanna Instruments	HI98509	Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12	Thomas Scientific	2848Y40	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.	Thomas Scientific	8847T08	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.	Thomas Scientific	8847T02	Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure	Coherent Scientific	14121	Surgical Equipment
Closed Connector	Thomas Scientific	8847E25	Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24	Specialist Medical Supplies	S195	Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	To make Krebs Buffer
Dual Channel Console	ADInstruments	TS402	Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD	Coherent Scientific	14114	Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated	Met-App Australia Pty Ltd	1352	Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)	Thermoline Scientific	TU3	Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter	Thomas Scientific	8847V08	Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor	John Morris	1015164	Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved	Coherent Scientific	WPI-501748	Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight	Coherent Scientific	WPI-501252	Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS	John Morris	1014414	Mounting screws for pump heads
Open-sided connector	Thomas Scientific	8847E05	Rig Construction
Paraformadehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g	VWR Chemicals	26764.26	To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software	ADInstruments	ML826	Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK	Merck Millipore	SX0004701	Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK	Merck Millipore	XX1104707	Rig Construction
Single Buret Clamp	Thomas Scientific	8847T32	Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler)	Sigma-aldrich	59277	Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector	Thomas Scientific	8847E35	Rig Construction
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm	Merck Millipore	SX0004700	Rig Construction
syringes 1 mL box/100	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm	Met-App Australia Pty Ltd	1356	Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410	ADInstruments	TS410	Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades	Coherent Scientific	WPI-500-086	Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray	Thermoline Scientific	TLWB-30	Rig Construction