Usando um modelo isolado de coração de rato de trabalho para testar estratégias de preservação do coração do doador

Resumo

Descrevemos um protocolo de coração de rato isolado ex vivo para testar estratégias de preservação do coração do doador. Este trabalho descreve o protocolo para uso em armazenamento estático a frio de corações de doadores de roedores; no entanto, o protocolo também pode ser usado para corações de doadores obtidos após doação após morte circulatória e morte encefálica.

Resumo

A otimização das soluções de preservação do coração do doador tem desempenhado um papel fundamental na redução da lesão de isquemia-reperfusão em corações de doadores durante a recuperação, transporte e transplante de órgãos. Trabalhos anteriores de nosso laboratório mostraram que a adição de trinitrato de glicerila e eritropoietina às soluções de preservação cardíaca do doador poderia melhorar significativamente a recuperação funcional cardíaca após armazenamento refrigerado prolongado e na doação após morte circulatória de corações. Este protocolo de suplementação foi implementado em uso clínico em unidades de transplante na Austrália, Bélgica e Reino Unido. Aqui, descrevemos um protocolo para testar estratégias de suplementação usando um circuito de perfusão de coração de rato (IWRH) isolado ex vivo . Usando essa metodologia, as estratégias de suplementação podem ser testadas no contexto de armazenamento estático prolongado a frio, doação após morte encefálica e doação após preservação do coração do doador de morte circulatória. A recuperação funcional cardíaca, medida pelo fluxo aórtico, fluxo coronariano, débito cardíaco, pressão de pulso e frequência cardíaca, pode ser usada para determinar se uma estratégia de preservação específica pode minimizar a lesão de isquemia-reperfusão do coração doador.

Introdução

O sucesso de um transplante de coração pode ser muito influenciado pelo método de preservação usado para o coração do doador. Os corações dos doadores são submetidos a insultos isquêmicos durante todo o processo de recuperação, transporte e transplante de órgãos. O grau de dano isquêmico ao órgão doador pode ser mitigado selecionando uma estratégia apropriada de preservação do coração do doador. O armazenamento estático a frio (CSS) continua sendo o método mais viável e comum para a preservação do coração do doador; no entanto, o CSS pode não ser necessariamente a melhor opção para todas as vias de doação de coração. Por exemplo, os c....

Protocolo

Todos os animais receberam cuidados humanitários em conformidade com as diretrizes do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (Austrália). Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Instituto Garvan de Pesquisa Médica (Sydney, Austrália).

1. Preparação do tampão Krebs-Henseleit (KH)

1. Prepare 2 L de uma solução estoque 20x de tampão KH contendo 2,36 M NaCl, 0,094 M KCl, 0,024 M MgSO₄, 0,024 M KH₂PO₄. Alíquota em tubos de 50 mL e armazenar a -20 °C.
2. Antes do experimento, prepare dois frascos Erlenmy....

Discussão

Dada a natureza sensível da função basal do coração, deve-se tomar cuidado para manter o equipamento de perfusão limpo e com componentes compatíveis. Por exemplo, o tubo de PVC correto deve ser usado. Alguns materiais de tubulação, como silicone, podem contribuir para menor fluxo aórtico e contratilidade, o que pode ser devido à perda de oxigênio através da tubulação. Embora existam circuitos isolados de perfusão cardíaca de ratos disponíveis comercialmente, a maioria d.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit	ADInstruments	MLT1199	Data Acquisition
Bridge Amp	ADInstruments	FE221	Data Acquisition
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 thermometer	Hanna Instruments	HI98509	Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12	Thomas Scientific	2848Y40	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.	Thomas Scientific	8847T08	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.	Thomas Scientific	8847T02	Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure	Coherent Scientific	14121	Surgical Equipment
Closed Connector	Thomas Scientific	8847E25	Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24	Specialist Medical Supplies	S195	Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	To make Krebs Buffer
Dual Channel Console	ADInstruments	TS402	Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD	Coherent Scientific	14114	Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated	Met-App Australia Pty Ltd	1352	Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)	Thermoline Scientific	TU3	Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter	Thomas Scientific	8847V08	Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor	John Morris	1015164	Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved	Coherent Scientific	WPI-501748	Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight	Coherent Scientific	WPI-501252	Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS	John Morris	1014414	Mounting screws for pump heads
Open-sided connector	Thomas Scientific	8847E05	Rig Construction
Paraformadehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g	VWR Chemicals	26764.26	To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software	ADInstruments	ML826	Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK	Merck Millipore	SX0004701	Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK	Merck Millipore	XX1104707	Rig Construction
Single Buret Clamp	Thomas Scientific	8847T32	Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler)	Sigma-aldrich	59277	Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector	Thomas Scientific	8847E35	Rig Construction
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm	Merck Millipore	SX0004700	Rig Construction
syringes 1 mL box/100	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm	Met-App Australia Pty Ltd	1356	Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410	ADInstruments	TS410	Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades	Coherent Scientific	WPI-500-086	Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray	Thermoline Scientific	TLWB-30	Rig Construction