Verwendung eines isolierten funktionierenden Rattenherzmodells zum Testen von Strategien zur Erhaltung des Spenderherzens

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein ex vivo isoliertes funktionierendes Rattenherzprotokoll, um Strategien zur Erhaltung des Spenderherzens zu testen. In diesem Artikel wird das Protokoll für die Verwendung in der statischen Kühllagerung von Nagetierspenderherzen beschrieben. Das Protokoll kann aber auch für Spenderherzen verwendet werden, die nach einer Spende nach Kreislauftod und Hirntod gewonnen wurden.

Zusammenfassung

Die Optimierung von Lösungen zur Erhaltung des Spenderherzens hat eine Schlüsselrolle bei der Reduzierung von Ischämie-Reperfusionsschäden bei Spenderherzen während der Organentnahme, des Transports und der Transplantation gespielt. Frühere Arbeiten aus unserem Labor haben gezeigt, dass die Zugabe von Glyceryltrinitrat und Erythropoietin zu Lösungen zur Erhaltung des Spenderherzens die Wiederherstellung der Herzfunktion nach längerer Kühllagerung und bei der Spende nach dem Bluttod von Herzen signifikant verbessern kann. Dieses Supplementierungsprotokoll wurde im klinischen Einsatz in Transplantationseinheiten in Australien, Belgien und dem Vereinigten Königreich implementiert. Hier skizzieren wir ein Protokoll zum Testen von Supplementierungsstrategien unter Verwendung eines ex vivo isolierten funktionierenden Rattenherz-Perfusionskreislaufs (IWRH). Mit dieser Methode können Supplementierungsstrategien im Zusammenhang mit längerer kalter statischer Lagerung, Spende nach Hirntod und Spende nach Kreislauftod und Spenderherzerhaltung getestet werden. Die Wiederherstellung der kardialen Funktionsfähigkeit, gemessen anhand des Aortenflusses, des Koronarflusses, des Herzzeitvolumens, des Pulsdrucks und der Herzfrequenz, kann verwendet werden, um festzustellen, ob eine bestimmte Konservierungsstrategie die Ischämie-Reperfusionsverletzung des Spenderherzens minimieren kann.

Einleitung

Der Erfolg einer Herztransplantation kann stark von der Konservierungsmethode des Spenderherzens beeinflusst werden. Spenderherzen sind während des gesamten Prozesses der Organentnahme, des Transports und der Transplantation ischämischen Beleidigungen ausgesetzt. Das Ausmaß der ischämischen Schädigung des Spenderorgans kann durch die Auswahl einer geeigneten Strategie zur Erhaltung des Spenderherzens gemildert werden. Die kalte statische Lagerung (CSS) ist nach wie vor die praktikabelste und gebräuchlichste Methode zur Konservierung des Spenderherzens. CSS ist jedoch nicht unbedingt die beste Option für alle Herzspendewege. Zum Beispiel werden Herzen, die über den Spendenweg nach dem Kreislauftod (DCD) gewonnen wurden, mit Hilfe der normothermen maschinellen Perfusion erhalten und auf Lebensfähigkeit untersucht, während Herzen, die über den Spendenweg nach dem Hirntod (DBD) gewonnen wurden, mit CSS oder hypothermischer maschineller Perfusion konserviert werden können. Eine weitere wichtige Determinante für die verwendete Konservierungsstrategie ist die Menge an warmer Ischämie (bei DCD) oder kalter Ischämie (bei DBD), der das Herz während der Organbeschaffung und des Transports ausgesetzt ist.

Viele Zentren verwenden eine zusätzliche pharmakologische Supplementierung der Herzkonservierungslösung, um die ischämische Toleranz zu erhöhen und die Herzfunktion nach der Transplantation zu verbessern. Nagetierstudien aus unserem Labor zeigten, dass die Supplementierung von Kardioplegie mit Erythropoietin und Glyceryltrinitrat in der Lage war, die kardiale Funktionserholung nach längerer Kältelagerung des Spenderherzens signifikant zu verbessern ^1,2. Diese Studien wurden dann zu Schweinestudien zur Erhaltung des Spenderherzens weiterentwickelt und lieferten die präklinische Grundlage, die zum Einbau von Erythropoietin und Glyceryltrinitrat in die Kardioplegielösung von Herzen führte, die über einen DCD-Weg unter Verwendung der normothermen maschinellen Perfusion gewonnen wurde ^3,4,5. Derzeit wird die Supplementierung mit Erythropoietin und Glyceryltrinitrat auch in australischen Transplantationseinheiten für klinische DBD-Herzentnahmen mit CSS eingesetzt. Das übergeordnete Ziel des unten beschriebenen Perfusionsprotokolls für isoliertes funktionierendes Rattenherz (IWRH) besteht darin, Strategien zur Erhaltung des Spenderherzens in einer Laborumgebung zu testen und ihre Wirksamkeit bei der Erhaltung der Herzfunktion des Spenderherzens nach der Reperfusion zu testen. Das beschriebene isolierte funktionierende Rattenherzprotokoll wird seit über zwei Jahrzehnten in unserem Labor verwendet und hat sich beim Screening auf potenzielle Nahrungsergänzungsmittel und/oder Strategien, die den Erhalt des Spenderherzens verbessern können, als äußerst nützlich erwiesen 2,7,8,9.

Protokoll

Alle Tiere erhielten eine humane Pflege in Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Health and Medical Research Council (Australien). Alle tierexperimentellen Verfahren wurden von der Tierethikkommission des Garvan Institute of Medical Research (Sydney, Australien) genehmigt.

1. Herstellung von Krebs-Henseleit (KH) -Puffer

1. 2 l einer 20-fachen Stammlösung KH-Puffer mit 2,36 M NaCl, 0,094 M KCl, 0,024 M MgSO₄ und 0,024 M KH₂PO₄ herstellen. In 50-ml-Röhrchen aliquotieren und bei -20 °C lagern.
2. Bereiten Sie vor dem Experiment zwei 2-Liter-Erlenmyer-Kolben mit 1x KH-Puffer vor, die 1900 ml deionisiertes Wasser, 100 ml 20x KH-Stammpuffer, 4,20 g NaHCO₃ (25 mM) und 3,96 g Glukose (11 mM) enthalten.
   1. Die Pufferkolben werden in ein 37 °C heißes Wasserbad gestellt und die Lösung mit Carbogen (95 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid, Durchflussmenge auf 2 l/min) über Ausströmersteine (Aufsteckfilter) 5 min lang begast, dann 2,8 mL 1 M CaCl₂ (1,4 mM) zugegeben. Lassen Sie die Lösung vor Beginn des Experiments mindestens 1 Stunde lang sprudeln. Die Verwendung eines Ausströmers unterstützt die gleichmäßige Belüftung des Puffers.
   2. Geben Sie ein kleines Volumen (~50 ml) Puffer zum Abkühlen in eine runde Metallschale bei -20 °C und bilden Sie eine Schicht aus eisgekühltem Puffer.

2. Vorbereitung des Perfusionskreislaufs

1. Stellen Sie sicher, dass alle Schläuche und Glaswaren sauber sind und kein sichtbarer Bewuchs/Kontamination vorhanden ist.
2. Die Höhe der Glaskammern ist so einzustellen, dass sie den erforderlichen Perfusionsdrücken entspricht, basierend auf 1 cm H₂O entspricht 1,36 mmHg: Langendorff-zu-Herz 100 cm (ca. 75 mmHg), Vorspannung von Seite zu Herz 15 cm (ca. 11 mmHg), Herz-zu-Nachlast-Kammer 100 cm (ca. 75 mmHg).
3. Beginnen Sie die Zirkulation von heißem Wasser um den Kreislauf mindestens 10 Minuten vor der Herzperfusion.
4. Legen Sie Mikrofaserfilter (1,2 μm) in die Filterhalter und verschließen Sie diese.
5. Grundieren Sie den Kreislauf mit KH-Puffer, stellen Sie sicher, dass die gesamte Luft entfernt wird, und verwenden Sie eine Schlauchschelle zur Durchflussregelung, um den Durchfluss auf der Langendorff-Seite (Abbildung 1A, B) auf ~50 mL/min einzustellen. Der langsamere Fluss ermöglicht eine einfache Kanülierung der Aorta und verhindert, dass das Herz vor dem Binden verschoben wird. Platzieren Sie ein Thermometer über einen T-förmigen Schlauchanschluss im Kreislauf, um die Temperatur des Puffers bei ~37 °C zu überwachen.

3. Einrichtung der Lab Chart (Datenanalyse) Software

1. Stellen Sie sicher, dass Powerlab (Datenerfassungssystem) und Durchflussmesser eingeschaltet und mit dem Computer verbunden sind, bevor Sie die Datenanalysesoftware öffnen.
2. Öffnen Sie eine neue Datei.
3. Richten Sie die Datenerfassung ein, indem Sie das Dropdown-Menü Einstellungen und dann Kanaleinstellungen auswählen. Wählen Sie für Aortendruck, Aortenfluss und Herzfrequenz (Abbildung 2A).
4. Richten Sie jeden Kanal mit den in Abbildung 2B gezeigten Einstellungen ein.

4. Vorbereitung des Tieres auf die Isolierung des Rattenherzens

HINWEIS: Die Methodik für die Isolierung und Perfusion von Rattenherzen für Nicht-DBD- und Nicht-DCD-Herzen für die kalte statische Lagerung wird im Folgenden beschrieben. Die Methoden für die Herzinstrumentierung in den Perfusionskreislauf sind relativ ähnlich, unabhängig davon, welche Spendemethode verwendet wird. Die Unterschiede im Protokoll für DBD- und DCD-Rattenherzspende treten hauptsächlich ab dem Zeitpunkt auf, an dem die Tieranästhesie wirksam geworden ist, bis zu dem Zeitpunkt, an dem das Herz aus dem Tier herausgeschnitten wird.

1. Wiegen Sie das Tier und achten Sie darauf, dass es >330 g wiegt. Der ideale Gewichtsbereich für männliche Ratten liegt bei 330-420 g.
2. Verabreichen Sie eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (80 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg). Stellen Sie eine angemessene chirurgische Anästhesieebene sicher, die auf dem Fehlen eines Pedalreflexes (Zehenkneifreflex) und eines Augenblinzelreflexes basiert.
3. Bringen Sie das Tier in Rückenlage und sichern Sie die Gliedmaßen mit Klebeband. Verabreichen Sie dem Tier Sauerstoff über einen Nasenkonus.
4. Halten Sie den Eis-Matsch-Metallbehälter KH Puffer und einen kleinen Metallbehälter mit Eis an der Präparierstation bereit. Tränken Sie eine 7,5 cm x 7,5 cm große Gaze in KH-Puffer und legen Sie sie auf den Behälter mit Eis.
5. Sobald eine angemessene chirurgische Anästhesie bestätigt ist, rasieren Sie die Haut an der chirurgischen Schnittstelle und reinigen Sie die Haut mit Aseptika wie Betadin oder 70% Alkohol. Machen Sie einen seitlichen Schnitt quer durch den Bauch (Laparotomie) und verschieben Sie Magen und Darm zur Seite, um den Zugang zur linken Nierenvene zu ermöglichen. Injizieren Sie 1500 IE Heparin und üben Sie Druck auf die Injektionsstelle aus, bis die Blutung aufhört. Lassen Sie 1-2 Minuten warten, bis Heparin zirkuliert, bevor Sie mit der Herzentnahme fortfahren.
6. Öffne die Brusthöhle, indem du den Brustkorb auf beiden Seiten durchschneidest und das Zwerchfell durchschneidest. Halten und heben Sie den Herz-Lungen-Block vorsichtig an, während Sie entlang der absteigenden Aorta schneiden, um sicherzustellen, dass der Aortenbogen intakt bleibt. Dadurch bleibt genügend Aortenlänge für die Kanülierung übrig.
7. Die Ratte wird durch die Entfernung von Herz und Lunge unter Narkose eingeschläfert. Tauchen Sie den Herz-Lungen-Block in den KH-Puffer-Eismatsch, damit das Herz stillstehen kann.

5. Kanülierung des Herzens auf den isolierten funktionierenden Herzperfusionskreislauf

1. Übertragen Sie den Herz-Lungen-Block auf eine Gaze auf Eis. Präparieren Sie überschüssiges Fett um die Aorta, kürzen Sie die Aorta, um 3-5 mm Länge für die Kanüle zu lassen, und machen Sie einen kleinen Schnitt ~1-2 mm in der Lungenarterie. Dadurch wird ein Weg für den koronaren Abfluss ermöglicht.
2. Legen Sie den getrimmten Herz-Lungen-Block (noch auf Eis) direkt unter die Kanülen. Stellen Sie den Durchfluss von der Langendorff-Seite mit einer Schlauchschelle zur Durchflussregelung ein, um die Aortenkanülierung zu erleichtern. Kanülieren Sie die Aorta vorsichtig auf die linke Kanüle, halten Sie sie mit einer schwarzen Klemme fest und binden Sie sie mit einer 2-0 Seidennaht fest.
3. Erhöhen Sie den Durchfluss aus der Langendorff-Perfusion, indem Sie die Schlauchschelle vollständig öffnen. Öffnen Sie die Nachspannklemme. Stellen Sie sicher, dass ein kontinuierlicher Durchfluss aus der Langendorff-Kammer erfolgt. Beginnen Sie mit der Überwachung der Herzaktivität mit Software.
   HINWEIS: Wenn der Aortenflusswert auf dem Display des Durchflussmessers <10 ml/min beträgt, stellen Sie sicher, dass die Lungenarteriotomie eine ausreichende Größe hat. Eine niedrige Aortenflussspur/ein niedriger Wert könnte auch darauf hindeuten, dass die Aortenkanüle zu weit eingeführt wurde.
4. Stellen Sie den Herz-Lungen-Block so ein, dass die vordere Oberfläche der Lunge dem Bediener zugewandt ist. Binden Sie den linken Lungenlappen mit einer 2-0-Seidennaht zusammen und schneiden Sie überschüssiges linkes Lungengewebe ab. Binden Sie die restlichen Lungenlappen in einem Zug mit einer 2-0 Seidennaht zusammen und schneiden Sie das Gewebe auf. Drehen Sie das Herz so, dass die gefesselten Lungen nach hinten zeigen.
5. Schneiden Sie mit einer kleinen Vannas-Schere eine Kante von 2-3 mm am linken Vorhofohr ab und achten Sie darauf, dass eine kleine Öffnung in die Vorhöfe entsteht. Kanülieren Sie das linke Vorhofohr vorsichtig mit der linken Kanüle, halten Sie es mit einer schwarzen Klemme fest und binden Sie es mit einer 2-0-Seidennaht zusammen. Abbildung 3A zeigt die Platzierung beider Kanülen.
6. Stellen Sie den Wassermantel der Herzkammer so ein, dass das Herz in der Mitte der Kammer sitzt.
7. Öffnen Sie den Druckmessumformer auf Luft und stellen Sie den Druckmessumformer in der Software auf Null, indem Sie das Dropdown-Menü Aortendruck > Bridge Amp > Zero auswählen. Klicken Sie auf OK.
8. Perfundierte des Herzens im Langendorff-Modus für 10 min. Stellen Sie sicher, dass der Langendoff-Aortenfluss zwischen 10 und 20 ml/min misst (ideal 20 mL/min).
9. Vor dem Umschalten des Arbeitsmodus ist darauf zu achten, dass der Ausströmer (aufsteckbarer Einlauffilter) aus dem Langendorff KH Pufferbehälter in den arbeitenden KH Pufferbehälter eingelegt wird.
10. Schalten Sie das Herz in den Arbeitsmodus, indem Sie die große Klemme schließen, die zur Aortenkanüle führt, und den Fluss öffnen, der zum linken Vorhofohr führt. Öffnen Sie den Drei-Wege-Hahn, der vom Arbeitsperfusat führt. Übertragen Sie den üblichen Rückführschlauch (Rückführung des KH-Puffers in den Behälter) vom Langendorff-Behälter in den Arbeitsbehälter.
11. Perfundieren Sie das Herz im Arbeitsmodus für 15 Minuten. Die Aortenflusswerte müssen idealerweise am Ende der 15-minütigen Perfusion >30 ml/min betragen. Sobald sich das Herz stabilisiert hat, beginnen Sie mit der Datenaufzeichnung in einer Datenanalysesoftware.
12. Messen Sie den koronaren Abfluss (koronarer Fluss) nach 1 min, 5 min, 10 min und 15 min.
    HINWEIS: Die koronaren Flusswerte sollten zwischen 10-20 ml/min liegen. Ein koronarer Fluss von mehr als 22 ml/min weist im Allgemeinen auf ein Leck hin, das von einem nicht gebundenen Lungengefäß ausgeht. Die Herzfrequenz sollte zwischen 200 und 300 Schlägen pro Minute liegen. Koronarabwässer können für die nachgelagerte Analyse von Gewebeverletzungsmarkern (z. B. Troponin-I, Laktatdehydrogenase-Freisetzung) gesammelt werden.

6. Verabreichung von Kardioplegie zur kalten statischen Lagerung des Herzens

1. Füllen Sie die Kardioplegiekammer (in einer Höhe von 60 cm positioniert, um einen Perfusionsdruck von ca. 40 mmHg zu erzielen) mit 50 ml einer speziellen kardialen Konservierungslösung (mit oder ohne Supplementierung).
2. Senken Sie den Wassermantel ab und schließen Sie den Drei-Wege-Wasserhahn auf der Seite des Arbeitsmodus.
3. Stoppen Sie den Fluss zur linken Vorhofkanüle, indem Sie die Klemme schließen.
4. Öffnen Sie den Fluss zur Aortenkanüle.
5. Schließen Sie die Klemme von der Langendoff-Seite und an der Nachlade.
6. Öffnen Sie die Klemme von der Kardioplegieleitung und spülen Sie 15 ml Kardioplegie aus der Druckleitung heraus. Schließen Sie den Wasserhahn an der Druckleitung.
7. Lassen Sie das Herz über die Aortenkanüle mit Kardioplegie spülen und sammeln Sie den Koronarabfluss. Führen Sie die Kardioplegie 3 Minuten lang durch und notieren Sie das Volumen der verabreichten Kardioplegie.
8. Stoppen Sie die Datenaufzeichnung in der Software und speichern Sie die Datei.
9. Nach 3 Minuten schließen Sie die Kardioplegieklemme und die kleine blaue Klemme, die zur Aortenkanüle führt.
10. Platzieren Sie eine Bulldog-Klemme auf der Aortenkanüle und eine zweite Bulldoggenklemme auf der linken Kanüle. Trennen Sie den Herzkanülenblock vom Kreislauf und legen Sie ihn in ein Becherglas mit Kardioplegie in einer Eisbox (Abbildung 3B, C).
11. Bewahren Sie das Herz 6 h (oder die gewünschte Kühlzeit) im Kühlschrank auf.

7. Herzreperfusion nach kalter statischer Lagerung

1. Bereiten Sie den KH-Puffer gemäß Abschnitt 1 vor.
2. Entlüften Sie den Perfusionskreislauf gemäß Abschnitt 2.
3. Öffnen Sie die gespeicherte Datei aus der Basislinienperfusion.
4. Nehmen Sie den Herzkanülenblock vorsichtig aus der Eisbox und befestigen Sie ihn am Perfusionskreislauf. Verwenden Sie vor dem Wiederanschließen der Aortenkanüle eine stumpfe 18-G-Spritze, die mit KH-Puffer gefüllt ist, um die Luft aus der Kanüle zu entfernen. Schließen Sie zuerst die Aortenkanüle an, öffnen Sie die Schlauchschelle auf der Langendorff-Seite und stellen Sie sicher, dass die Nachlader-Schlauchschelle geöffnet ist.
5. Schließen Sie die linke Vorhofkanüle wieder an und stellen Sie sicher, dass die Luft aus der Kanüle entfernt wurde, bevor Sie sie an den Perfusionskreislauf anschließen. Halten Sie die Arbeitsseitenklemme geschlossen, bis es Zeit ist, vom Langendorff-Modus in den Arbeitsmodus zu wechseln.
6. Perfundierte das Herz im Langendorff-Modus für 15 min. Stellen Sie sicher, dass die Datenaufzeichnung zu Beginn der Langendorff-Reperfusion beginnt.
7. Legen Sie vor dem Umschalten in den Arbeitsmodus beide Blasensteine in den KH-Puffer, öffnen Sie den 3-Wege-Hahn auf der Arbeitsseite und führen Sie den gemeinsamen Rücklaufschlauch in den Arbeitsbehälter ein.
8. Schließen Sie die weiße Langendorff-Klemme, öffnen Sie die weiße Arbeitsseitenklemme und perfundieren Sie das Herz für 30 min. Messen und sammeln Sie koronare Abwässer zu bestimmten Zeitpunkten für die nachgelagerte Analyse (z. B. Marker für Herzverletzungen). Stellen Sie sicher, dass die Softwareaufzeichnung gestoppt und neu gestartet wird, um ein neues Segment zu starten (oder alternativ einen Kommentar hinzuzufügen).
9. Schließen Sie bei ca. 15 Minuten Reperfusion im Arbeitsmodus den Drei-Wege-Hahn.
10. Am Ende der Reperfusion speichern Sie die Datendatei, stoppen Sie den Fluss durch den Kreislauf und trennen Sie den Herzblock. Entnahme von Proben des linken Ventrikels für die histologische Verarbeitung und/oder Schockfrost für zukünftige Studien (z. B. Proteinextraktion für Western-Blot-Studien).
11. Entfernen Sie die Filter aus den Filterhaltern, entleeren Sie den Puffer aus dem Kreislauf und spülen Sie zweimal mit 5 l destilliertem Wasser.
    HINWEIS: Obwohl es nicht notwendig ist, hilft es, das destillierte Wasser in einem großen Behälter im Wasserbad vorzuwärmen.

8. Analyse der funktionellen Wiederherstellung

1. Öffnen Sie die LabChart-Datei.
2. Markieren Sie einen Aufnahmebereich von mindestens 30 s und klicken Sie dann auf Befehl > Datenauswahl hinzufügen ODER Mehrfaches Hinzufügen zu Daten. Dadurch werden die gewünschten Parameter zu einer DataPad-Datei in der Software hinzugefügt.
3. Wählen Sie das Dropdown-Menü Fenster > DataPad aus.
4. Markieren Sie die Wiederherstellungswerte, und kopieren Sie sie aus DataPad in eine Tabelle, um die Funktionswiederherstellung zu analysieren. Berechnen Sie die funktionelle Wiederherstellung als Prozentsatz des jeweiligen Ausgangswerts ^1,6,7.

Ergebnisse

Die Ergebnisse der Basisperfusion werden bestimmen, ob das erste Experiment (vor der Lagerung) erfolgreich war. Der Aortenfluss, der im Langendorff-Modus angezeigt wird, sollte zwischen 14 und 22 mL/min liegen. Die Langendorff-Strömung wird aufgrund der retrograden Perfusion der Aorta als negativer Wert auf dem Durchflussmesser angezeigt. Ein Beispiel für eine akzeptable Langendorff-Kurve ist in Abbildung 4A dargestellt.

Nach de...

Diskussion

Angesichts der Empfindlichkeit der Ausgangsfunktion des Herzens muss darauf geachtet werden, dass das Perfusionspräparat sauber und mit kompatiblen Komponenten ausgestattet bleibt. So muss zum Beispiel der richtige PVC-Schlauch verwendet werden. Einige Schlauchmaterialien, wie z. B. Silikon, können zu einer geringeren Aortenströmung und Kontraktilität beitragen, was auf den Sauerstoffverlust über die Schläuche zurückzuführen sein kann. Es gibt zwar isolierte funktionierende Ratte...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit	ADInstruments	MLT1199	Data Acquisition
Bridge Amp	ADInstruments	FE221	Data Acquisition
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 thermometer	Hanna Instruments	HI98509	Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12	Thomas Scientific	2848Y40	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.	Thomas Scientific	8847T08	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.	Thomas Scientific	8847T02	Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure	Coherent Scientific	14121	Surgical Equipment
Closed Connector	Thomas Scientific	8847E25	Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24	Specialist Medical Supplies	S195	Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	To make Krebs Buffer
Dual Channel Console	ADInstruments	TS402	Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD	Coherent Scientific	14114	Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated	Met-App Australia Pty Ltd	1352	Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)	Thermoline Scientific	TU3	Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter	Thomas Scientific	8847V08	Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor	John Morris	1015164	Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved	Coherent Scientific	WPI-501748	Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight	Coherent Scientific	WPI-501252	Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS	John Morris	1014414	Mounting screws for pump heads
Open-sided connector	Thomas Scientific	8847E05	Rig Construction
Paraformadehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g	VWR Chemicals	26764.26	To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software	ADInstruments	ML826	Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK	Merck Millipore	SX0004701	Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK	Merck Millipore	XX1104707	Rig Construction
Single Buret Clamp	Thomas Scientific	8847T32	Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler)	Sigma-aldrich	59277	Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector	Thomas Scientific	8847E35	Rig Construction
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm	Merck Millipore	SX0004700	Rig Construction
syringes 1 mL box/100	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm	Met-App Australia Pty Ltd	1356	Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410	ADInstruments	TS410	Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades	Coherent Scientific	WPI-500-086	Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray	Thermoline Scientific	TLWB-30	Rig Construction