Donör Kalp Koruma Stratejilerini Test Etmek için İzole Çalışan Bir Sıçan Kalbi Modeli Kullanma

Özet

Donör kalp koruma stratejilerini test etmek için ex vivo izole çalışan bir sıçan kalbi protokolü tanımladık. Bu makale, kemirgen donör kalplerinin statik soğuk depolanmasında kullanım protokolünü açıklamaktadır; Bununla birlikte, protokol dolaşım ölümü ve beyin ölümü sonrası bağış sonrası elde edilen donör kalpler için de kullanılabilir.

Özet

Donör kalp koruma çözümlerinin optimizasyonu, organ alımı, taşınması ve transplantasyon sırasında donör kalplerinde iskemi-reperfüzyon hasarının azaltılmasında önemli bir rol oynamıştır. Laboratuvarımızdaki önceki çalışmalar, donör kalp koruma solüsyonlarına gliseril trinitrat ve eritropoietin ilavesinin, uzun süreli soğuk hava deposundan sonra ve dolaşım ölümü kalplerinden sonra bağışta kardiyak fonksiyonel iyileşmeyi önemli ölçüde iyileştirebileceğini gösterdi. Bu takviye protokolü, Avustralya, Belçika ve Birleşik Krallık'taki nakil ünitelerinde klinik kullanımda uygulanmıştır. Burada, ex vivo izole çalışan sıçan kalbi (IWRH) perfüzyon devresi kullanarak takviye stratejilerini test etmek için bir protokol özetliyoruz. Bu metodolojiyi kullanarak, takviye stratejileri, uzun süreli soğuk statik depolama, beyin ölümünden sonra bağış ve dolaşım ölümünden sonra bağış donörü kalbinin korunması bağlamında test edilebilir. Aort akımı, koroner akım, kardiyak debi, nabız basıncı ve kalp hızı ile ölçülen kardiyak fonksiyonel iyileşme, belirli bir koruma stratejisinin donör kalbin iskemi-reperfüzyon hasarını en aza indirip indiremeyeceğini belirlemek için kullanılabilir.

Giriş

Bir kalp naklinin başarısı, donör kalp için kullanılan koruma yönteminden büyük ölçüde etkilenebilir. Donör kalpler, organ alımı, taşınması ve nakli süreci boyunca iskemik hakaretlere maruz kalır. Donör organdaki iskemik hasarın derecesi, uygun bir donör kalp koruma stratejisi seçilerek azaltılabilir. Soğuk statik depolama (CSS), donör kalbinin korunması için en uygun ve yaygın yöntem olmaya devam etmektedir; bununla birlikte, CSS tüm kalp bağışı yolları için en iyi seçenek olmayabilir. Örneğin, dolaşım ölümü sonrası bağış (DCD) yolu ile temin edilen kalpler, normotermik makine perfüzyonu kullanılarak korunur ve canlılık açısından değerlendirilirken, beyin ölümü sonrası bağış (DBD) yolu ile temin edilen kalpler CSS veya hipotermik makine perfüzyonu kullanılarak korunabilir. Kullanılan koruma stratejisi için bir diğer önemli belirleyici, kalbin organ temini ve nakli sırasında maruz kaldığı sıcak iskemi (DCD için) veya soğuk iskemi (DBD için) miktarıdır.

Birçok merkez, iskemik toleransı artırmak ve nakil sonrası kalp fonksiyonunu iyileştirmek için kalp koruma solüsyonunun ek farmakolojik takviyesini kullanır. Laboratuvarımızdan yapılan kemirgen çalışmaları, kardiyoplejinin eritropoietin ve gliseril trinitrat ile takviyesinin, donör kalbin uzun süreli soğuk depolanmasından sonra kardiyak fonksiyonel iyileşmeyi önemli ölçüde iyileştirebildiğini göstermiştir ^1,2. Bu çalışmalar daha sonra donör kalbin korunmasına yönelik domuz çalışmalarına ilerledi ve normotermik makine perfüzyonu ^3,4,5 kullanılarak bir DCD yolu yoluyla elde edilen kalplerin kardiyopleji çözeltisine eritropoietin ve gliseril trinitratın dahil edilmesine yol açan klinik öncesi temeli sağladı. Şu anda, eritropoietin ve gliseril trinitrat takviyesi, CSS'yi içeren klinik DBD kalp alımları için Avustralya nakil ünitelerinde de kullanılmaktadır. Aşağıda özetlenen izole çalışan sıçan kalbi (IWRH) perfüzyon protokolünün genel amacı, donör kalp koruma stratejilerini laboratuvar ortamında test etmek ve reperfüzyondan sonra donör kalp fonksiyonunu korumak için etkinliklerini test etmektir. Tarif edilen izole çalışan sıçan kalbi protokolü, laboratuvarımızda yirmi yılı aşkın bir süredir kullanılmaktadır ve donör kalp korumasını iyileştirebilecek potansiyel takviyeler ve / veya stratejilerin taranmasında son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır 2,7,8,9.

Protokol

Tüm hayvanlar, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (Avustralya) yönergelerine uygun olarak insancıl bakım aldı. Tüm hayvan prosedürleri, Garvan Tıbbi Araştırma Enstitüsü (Sidney, Avustralya) Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Krebs-Henseleit (KH) tamponunun hazırlanması

1. 2.36 M NaCl, 0.094 M KCl, 0.024 M MgSO₄, 0.024 M KH₂PO₄ içeren 20x stok çözeltisinden 2 L hazırlayın. 50 mL'lik tüplere koyun ve -20 °C'de saklayın.
2. Deneyden önce, 1900 mL deiyonize su, 100 mL 20x stok KH tamponu, 4.20 g_NaHCO3 (25 mM) ve 3.96 g glikoz (11 mM) içeren iki adet 2 L Erlenmyer şişesi 1x KH tamponu hazırlayın.
   1. Tampon şişelerini 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve çözeltiyi karbojen (%95 oksijen, %5 karbondioksit, akış hızı 2 L/dk'ya ayarlanmış) ile hava taşları (geçmeli giriş filtresi) aracılığıyla 5 dakika boyunca gazlayın, ardından 2,8 mL 1 M CaCl₂ (1,4 mM) ekleyin. Deneyin başlamasından önce çözeltiyi en az 1 saat köpürtmeye devam edin. Bir hava taşının kullanılması, tamponun düzgün bir şekilde havalandırılmasına yardımcı olur.
   2. Soğuması ve bir buzlu tampon tabakası oluşturması için -20 °C'de yuvarlak metal bir tabağa küçük hacimli (~ 50 mL) bir tampon yerleştirin.

2. Perfüzyon devresinin hazırlanması

1. Tüm boru ve cam eşyaların görünür bir büyüme/kirlenme olmadan temiz olduğundan emin olun.
2. 1 cm H₂O'nun 1,36 mmHg'ye eşdeğer olmasına bağlı olarak gerekli perfüzyon basınçlarına karşılık gelecek şekilde cam odaların yüksekliklerini ayarlayın: Langendorff'tan kalbe 100 cm (yaklaşık 75 mmHg), ön yük yan kalbe çalışma 15 cm (yaklaşık 11 mmHg), kalpten son yüke bölme 100 cm (yaklaşık 75 mmHg).
3. Kalp perfüzyonundan en az 10 dakika önce devrenin etrafında sıcak su sirkülasyonunu başlatın.
4. Mikrofiber filtreleri (1.2 μm) filtre tutuculara yerleştirin ve sıkıca sabitleyin.
5. Devreyi KH tamponu ile doldurun, tüm havanın çıkarıldığından emin olun ve bir akış kontrol tüpü cl kullanınamp Langendorff tarafındaki akışı ayarlamak için (Şekil 1A, B) ~50 mL/dk'ya ayarlayın. Daha yavaş akış, aort kanülasyonunu kolaylaştırır ve bağlamadan önce kalbin yerinden çıkmasını önler. Tamponun sıcaklığını ~37 °C'de izlemek için T şeklinde bir boru konektörü aracılığıyla devrenin içine bir termometre yerleştirin.

3. Lab Chart (veri analizi) yazılımının kurulması

1. Veri analiz yazılımını açmadan önce Powerlab (veri toplama sistemi) ve akış ölçerin açık ve bilgisayara bağlı olduğundan emin olun.
2. Yeni bir dosya açın.
3. Ayarlar açılır menüsünü ve Kanal Ayarları'nı seçerek veri toplamayı ayarlayın. Aort basıncı, aort akışı ve kalp atış hızı için seçin (Şekil 2A).
4. Her kanalı Şekil 2B'de gösterilen ayarlarla ayarlayın.

4. Sıçan kalbi izolasyonu için hayvanın hazırlanması

NOT: Soğuk statik depolama için DBD olmayan ve DCD olmayan kalpler için sıçan kalbi izolasyonu ve perfüzyonu metodolojisi aşağıda özetlenmiştir. Perfüzyon devresine kalp enstrümantasyonu yöntemleri, hangi bağış yönteminin kullanıldığına bakılmaksızın nispeten benzerdir. DBD ve DCD sıçan kalbi bağışı protokolündeki farklılıklar, esas olarak hayvan anestezisinin yürürlüğe girdiği andan kalbin hayvandan çıkarıldığı zamana kadar ortaya çıkar.

1. Hayvanı tartın ve ağırlığının >330 g olduğundan emin olun. Erkek sıçanlar için ideal ağırlık aralığı 330-420 g'dır.
2. İntraperitoneal ketamin (80 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) enjeksiyonu uygulayın. Pedal refleksi (ayak parmağını sıkıştırma refleksi) ve göz kırpma refleksinin olmamasına bağlı olarak yeterli cerrahi anestezi düzlemi sağlayın.
3. Hayvanı sırtüstü pozisyona getirin ve uzuvları bantla sabitleyin. Hayvana bir burun konisi ile oksijen verin.
4. Diseksiyon istasyonunda KH tampon buzlu rüşvet metal kabını ve buzlu küçük bir metal kabı bulundurun. 7,5 cm x 7,5 cm'lik bir gazlı bezi KH tamponuna batırın ve buzlu kabın üzerine yerleştirin.
5. Yeterli cerrahi anestezi düzlemi onaylandıktan sonra, cerrahi insizyon bölgesinde cildi tıraş edin ve cildi betadin gibi aseptik veya% 70 alkol ile temizleyin. Karın boyunca yanal bir kesi yapın (laparotomi) ve sol böbrek damarına erişim sağlamak için mide ve bağırsakları yana doğru hareket ettirin. 1500 IU heparin enjekte edin ve kanama durana kadar enjeksiyon bölgesine basınç uygulayın. Kalp alımına devam etmeden önce heparinin dolaşması için 1-2 dakika bekleyin.
6. Her iki taraftaki göğüs kafesini keserek ve diyaframı keserek göğüs boşluğunu açın. İnen aort boyunca keserken kalp-akciğer bloğunu dikkatlice tutun ve kaldırın, aort kemerinin sağlam kalmasını sağlayın. Bu, kanülasyon için yeterli aort uzunluğunun kalmasına izin verecektir.
7. Sıçan, anestezi altındayken kalbin ve akciğerlerin çıkarılmasıyla ötenazi yapılır. Kalbin durmasına izin vermek için kalp-akciğer bloğunu KH tampon buz çamuruna batırın.

5. Kalbin izole çalışan kalp perfüzyon devresine kanüle edilmesi

1. Kalp-akciğer bloğunu buz üzerinde bir gazlı beze aktarın. Aort çevresindeki fazla yağı inceleyin, aortu kanülasyon için 3-5 mm uzunlukta kalacak şekilde kesin ve pulmoner arterde ~ 1-2 mm küçük bir kesi yapın. Bu, koroner atık su için bir yol sağlayacaktır.
2. Kesilmiş kalp-akciğer bloğunu (hala buz üzerindeyken) doğrudan kanüllerin altına yerleştirin. Aort kanülasyonunu kolaylaştırmak için bir akış kontrol tüpü kelepçesi kullanarak Langendorff tarafından akışı ayarlayın. Aortu dikkatlice sol kanül üzerine kanül edin, siyah bir klemp ile tutun ve 2-0 ipek dikiş ile bağlayın.
3. Akış kontrol hortumu kelepçesini tamamen açarak Langendorff perfüzyonundan gelen akışı artırın. Son yük kelepçesini açın. Langendorff odasından sürekli akış olduğundan emin olun. Yazılımla kalp aktivitesini izlemeye başlayın.
   NOT: Akış ölçer ekranındaki aort akış değeri <10 mL/dk ise, pulmoner arteriyotominin yeterli boyutta olduğundan emin olun. Düşük bir aort akış izi/değeri, aort kanülünün çok uzağa yerleştirildiğini de gösterebilir.
4. Kalp-akciğer bloğunu, akciğerlerin ön yüzeyi operatöre bakacak şekilde ayarlayın. Sol akciğer lobunu 2-0 ipek dikişle bağlayın ve fazla sol akciğer dokusunu kesin. Kalan akciğer loblarını 2-0 ipek sütür ile tek seferde bağlayın ve dokuyu kesin. Kalbi, bağlı akciğerler arkaya doğru olacak şekilde döndürün.
5. Küçük Vannas makası kullanarak sol atriyal apendiksin 2-3 mm'lik bir kenarını kesin ve kulakçıklara küçük bir açıklık elde edilmesini sağlayın. Sol atriyal apendiksiyi dikkatlice sol kanüle edin, siyah bir kelepçe ile tutun ve 2-0 ipek dikişle bağlayın. Şekil 3A , her iki kanülün yerleşimini göstermektedir.
6. Kalp haznesi su ceketini, kalp haznenin ortasına oturacak şekilde ayarlayın.
7. Basınç dönüştürücüsünü havaya açın ve yazılımdaki Aort Basıncı açılır menüsünü > Bridge Amp > Zero'yu seçerek basınç dönüştürücüyü sıfırlayın. Tamam'a tıklayın.
8. Kalbi Langendorff modunda 10 dakika boyunca perfüze edin. Langendoff aort akışının 10-20 mL/dk (ideal 20 mL/dk) arasında ölçüldüğünden emin olun.
9. Çalışma modunu değiştirmeden önce, Langendorff KH tampon haznesinden gelen hava taşının (geçmeli giriş filtresi) çalışan KH tampon haznesine yerleştirildiğinden emin olun.
10. Aort kanülüne giden büyük kelepçeyi kapatarak ve sol atriyal apendiks'e giden akışı açarak kalbi çalışma moduna geçirin. Çalışma perfüzatöründen çıkan üç musluğu açın. Ortak dönüş borusunu (KH tamponunu rezervuara geri alarak) Langendorff rezervuarından çalışan rezervuara aktarın.
11. Kalbi 15 dakika boyunca çalışma modunda perfüze edin. Aort akım değerleri ideal olarak 15 dakikalık perfüzyon sonunda >30 mL/dk olmalıdır. Kalp stabilize olduktan sonra, verileri veri analiz yazılımına kaydetmeye başlayın.
12. Koroner atık suyu (koroner akış) 1 dakika, 5 dakika, 10 dakika ve 15 dakikada ölçün.
    NOT: Koroner akım değerleri 10-20 mL/dk arasında olmalıdır. 22 mL/dk'dan büyük koroner akış genellikle bağlanmamış bir akciğer damarından kaynaklanan bir sızıntıyı gösterir. Kalp atış hızı 200-300 bpm arasında olmalıdır. Koroner atık su, doku hasarı belirteçlerinin (örneğin, troponin-I, laktat dehidrojenaz salınımı) aşağı akış analizi için toplanabilir.

6. Kalbin soğuk statik depolanması için kardiyoplejinin uygulanması

1. Kardiyopleji odasını (yaklaşık 40 mmHg perfüzyon basıncı elde etmek için 60 cm yüksekliğe yerleştirilmiş) 50 mL belirlenmiş kardiyak koruma solüsyonu (takviyeli veya takviyesiz) ile doldurun.
2. Su ceketini indirin ve çalışma modu tarafındaki üç musluğu kapatın.
3. Kelepçeyi kapatarak sol atriyal kanüle doğru akışı durdurun.
4. Aort kanülüne giden akışı açın.
5. Kelepçeyi Langendoff tarafından ve art yük üzerinde kapatın.
6. Kelepçeyi kardiyopleji hattından açın ve 15 mL kardiyoplejiyi basınç hattından dışarı atın. Basınç hattındaki musluğu kapatın.
7. Kalbin aort kanülü yoluyla kardiyopleji ile yıkanmasına izin verin ve koroner atık suyu toplayın. Kardiyoplejiyi 3 dakika çalıştırın ve uygulanan kardiyopleji hacmini kaydedin.
8. Yazılımda veri kaydetmeyi durdurun ve dosyayı kaydedin.
9. 3 dakika sonra, kardiyopleji kelepçesini ve aort kanülüne giden küçük mavi kelepçeyi kapatın.
10. Aort kanülüne bir bulldog kelepçesi ve sol kanüle ikinci bir bulldog kelepçesi yerleştirin. Kalp kanülü bloğunu devreden ayırın ve bir buz kutusunda kardiyopleji içeren bir behere yerleştirin (Şekil 3B, C).
11. Kalbi buzdolabında 6 saat (veya istediğiniz soğuk saklama süresi) saklayın.

7. Soğuk statik depolamadan sonra kalp reperfüzyonu

1. KH tamponunu bölüm 1'e göre hazırlayın.
2. Perfüzyon devresini bölüm 2'ye göre hazırlayın.
3. Kaydedilen dosyayı taban çizgisi perfüzyonundan açın.
4. Kalp kanülü bloğunu buz kutusundan dikkatlice çıkarın ve perfüzyon devresine sabitleyin. Aort kanülünü yeniden bağlamadan önce, kanüldeki havayı çıkarmak için KH tamponu ile doldurulmuş künt uçlu 18 G'lik bir şırınga kullanın. Önce aort kanülünü bağlayın, Langendorff tarafındaki boru kelepçesini açın ve son yük boru kelepçesinin açık olduğundan emin olun.
5. Perfüzyon devresine bağlanmadan önce kanülden havanın alındığından emin olarak sol atriyal kanülü yeniden bağlayın. Langendorff'tan çalışma moduna geçme zamanı gelene kadar çalışma tarafı kelepçesini kapalı tutun.
6. Kalbi Langendorff modunda 15 dakika boyunca perfüze edin. Langendorff reperfüzyonunun başlangıcında veri kaydetmeye başladığınızdan emin olun.
7. Çalışma moduna geçmeden önce, her iki köpüren taşı da KH tamponuna yerleştirin, çalışma tarafındaki 3 musluğu açın ve ortak dönüş borusunu çalışma rezervuarına aktarın.
8. Beyaz Langendorff kelepçesini kapatın, beyaz çalışma tarafı kelepçesini açın ve kalbi 30 dakika boyunca perfüze edin. Aşağı akış analizi için belirlenen zaman noktalarında koroner atık suyu ölçün ve toplayın (örn., kardiyak hasar belirteçleri). Yeni bir segment başlatmak (veya alternatif olarak bir yorum eklemek) için yazılım kaydını durdurup yeniden başlattığınızdan emin olun.
9. Yaklaşık 15 dakikalık çalışma modu reperfüzyonunda, üç musluğu kapatın.
10. Reperfüzyonun sonunda, veri dosyasını kaydedin, devredeki akışı durdurun ve kalp bloğunun bağlantısını kesin. Histolojik işleme için sol ventrikül örneklerini toplayın ve / veya gelecekteki çalışmalar için donduruldu (ör., western blot çalışmaları için protein ekstraksiyonu).
11. Filtreleri filtre tutucularından çıkarın, tamponu devreden boşaltın ve 5 L damıtılmış su ile iki kez yıkayın.
    NOT: Gerekli olmasa da, damıtılmış suyun su banyosu içindeki büyük bir kapta önceden ısıtılmasına yardımcı olur.

8. Fonksiyonel geri kazanım analizi

1. LabChart dosyasını açın.
2. En az 30 saniyelik bir kayıt bölgesini vurgulayın, ardından Veri seçimi ekle VEYA Veriye çoklu ekleme > Komut düğmesini tıklayın. Bu, istenen parametreleri yazılım içindeki bir DataPad dosyasına ekleyecektir.
3. DataPad'> Pencere açılır menüsünü seçin.
4. İşlevsel kurtarma analizi için kurtarma değerlerini DataPad'den vurgulayın ve bir elektronik tabloya kopyalayın. İşlevsel kurtarmayı, ilgili temel değeri 1,6,7'nin yüzdesi olarak hesaplayın.

Sonuçlar

Başlangıç perfüzyonundan elde edilen sonuçlar, ilk deneyin (ön depolama) başarılı olup olmadığını belirleyecektir. Langendorff modu sırasında görüntülenen aort akışı 14 - 22 mL/dk arasında olmalıdır. Langendorff akışı, aortun retrograd perfüzyonu nedeniyle akış ölçerde negatif bir değer olarak görüntülenir. Kabul edilebilir bir Langendorff izi örneği Şekil 4A'da gösterilmiştir.

Çalışma m...

Tartışmalar

Kalbin temel işlevinin hassas doğası göz önüne alındığında, perfüzyon teçhizatını temiz ve uyumlu bileşenlerle tutmak için özen gösterilmelidir. Örneğin, doğru PVC boru kullanılmalıdır. Silikon gibi bazı boru malzemeleri, boru yoluyla oksijen kaybına bağlı olabilecek daha düşük aort akışına ve kasılmasına katkıda bulunabilir. Piyasada izole edilmiş çalışan sıçan kalbi perfüzyon devreleri olsa da, bunların çoğu öncelikle sadece Langendorff p...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit	ADInstruments	MLT1199	Data Acquisition
Bridge Amp	ADInstruments	FE221	Data Acquisition
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 thermometer	Hanna Instruments	HI98509	Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12	Thomas Scientific	2848Y40	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.	Thomas Scientific	8847T08	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.	Thomas Scientific	8847T02	Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure	Coherent Scientific	14121	Surgical Equipment
Closed Connector	Thomas Scientific	8847E25	Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24	Specialist Medical Supplies	S195	Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	To make Krebs Buffer
Dual Channel Console	ADInstruments	TS402	Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD	Coherent Scientific	14114	Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated	Met-App Australia Pty Ltd	1352	Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)	Thermoline Scientific	TU3	Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter	Thomas Scientific	8847V08	Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor	John Morris	1015164	Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved	Coherent Scientific	WPI-501748	Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight	Coherent Scientific	WPI-501252	Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS	John Morris	1014414	Mounting screws for pump heads
Open-sided connector	Thomas Scientific	8847E05	Rig Construction
Paraformadehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g	VWR Chemicals	26764.26	To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software	ADInstruments	ML826	Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK	Merck Millipore	SX0004701	Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK	Merck Millipore	XX1104707	Rig Construction
Single Buret Clamp	Thomas Scientific	8847T32	Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler)	Sigma-aldrich	59277	Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector	Thomas Scientific	8847E35	Rig Construction
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm	Merck Millipore	SX0004700	Rig Construction
syringes 1 mL box/100	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm	Met-App Australia Pty Ltd	1356	Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410	ADInstruments	TS410	Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades	Coherent Scientific	WPI-500-086	Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray	Thermoline Scientific	TLWB-30	Rig Construction