使用分离的工作大鼠心脏模型测试供体心脏保存策略

摘要

我们描述了一种 离体 分离的工作大鼠心脏方案，以测试供体心脏保存策略。本文描述了用于啮齿动物供体心脏静态冷藏的方案;然而，该方案也可用于循环死亡和脑死亡后捐献后获得的供体心脏。

摘要

优化供体心脏保存解决方案在减少器官提取、运输和移植过程中供体心脏缺血再灌注损伤方面发挥了关键作用。我们实验室以前的研究表明，在供体心脏保存溶液中添加三硝酸甘油酯和促红细胞生成素可以显着改善长时间冷藏后和循环死亡心脏后捐献后的心脏功能恢复。该补充方案已在澳大利亚、比利时和英国的移植单位临床使用中实施。在这里，我们概述了使用 离体 分离工作大鼠心脏 （IWRH） 灌注回路测试补充策略的方案。使用这种方法，可以在长期冷静态储存、脑死亡后捐献和循环死亡后捐献供体心脏保存的情况下测试补充策略。通过主动脉血流、冠状动脉血流、心输出量、脉压和心率测量的心脏功能恢复可用于确定特定的保留策略是否可以最大限度地减少供体心脏的缺血再灌注损伤。

引言

心脏移植的成功与否在很大程度上受到供体心脏保存方法的影响。供体心脏在整个器官提取、运输和移植过程中会受到缺血性损伤。通过选择合适的供体心脏保存策略，可以减轻供体器官的缺血性损伤程度。静态冷储存 （CSS） 仍然是最可行和最常见的供体心脏保存方法;然而，CSS 可能不一定是所有心脏捐献途径的最佳选择。例如，通过循环死亡后捐献 （DCD） 途径获得的心脏使用常温机器灌注进行维持和生存评估，而通过脑死亡后捐献 （DBD） 途径获得的心脏可以使用 CSS 或低温机器灌注进行保留。所用保存策略的另一个重要决定因素是心脏在器官获取和运输过程中遭受的热缺血（对于 DCD）或冷缺血（对于 DBD）的量。

许多中心使用心脏保存溶液的额外药物补充剂来提高缺血耐受性并改善移植后的心脏功能。我们实验室的啮齿动物研究表明，在供体心脏长期冷藏后，用促红细胞生成素和三硝酸甘油补充心脏麻痹能够显著改善心脏功能的恢复 ^1,2。这些研究随后发展到供体心脏保存的猪研究，并为导致促红细胞生成素和硝酸甘油酯掺入利用常温机器灌注的 DCD 途径获得的心脏心脏停搏溶液中提供了临床前基础 ^3,4,5

研究方案

所有动物都按照国家健康与医学研究委员会（澳大利亚）的指导方针接受了人道照顾。所有动物程序均已获得 Garvan 医学研究所（澳大利亚悉尼）动物伦理委员会的批准。

1. Krebs-Henseleit （KH） 缓冲液的制备

1. 制备 2 L 含有 2.36 M NaCl、0.094 M KCl、0.024 M MgSO₄、0.024 M KH₂PO₄ 的 20x KH 缓冲液储备液。分装到 50 mL 试管中并储存在 -20 °C 下。
2. 实验前，准备两个 2 L Erlenmyer 烧瓶，其中包含 1x KH 缓冲液，含有 1900 mL 去离子水、100 mL 20x 储备 KH 缓冲液、4.20 g NaHCO₃ （25 mM） 和 3.96 g 葡萄糖 （11 mM）。
   1. 将缓冲瓶置于 37 °C 水浴中，通过气石（滑入式入口过滤器）用碳化物（95% 氧气、5% 二氧化碳，流速设置为 2 L/min）对溶液进行气体化 5 分钟，然后加入 2.8 mL 的 1 M CaCl₂ （1.4 mM）。在实验开始前，继续将溶液鼓泡至少 1 小时。使用气石有助于缓冲液的均匀通气。
   2. 将少量 （~50 mL）....

讨论

鉴于心脏基线功能的敏感性，必须注意保持灌注装置清洁并与兼容的组件。例如，必须使用正确的 PVC 管。一些导管材料（如硅胶）会导致主动脉血流和收缩力降低，这可能是由于氧气通过导管流失所致。虽然市面上有孤立的工作大鼠心脏灌注回路，但其中大多数主要用于 Langendorff 灌注。通常，在 Langendoff 灌注模型中，可以通过将球囊导管插入左心室来获得功能测量，以.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit	ADInstruments	MLT1199	Data Acquisition
Bridge Amp	ADInstruments	FE221	Data Acquisition
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 thermometer	Hanna Instruments	HI98509	Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12	Thomas Scientific	2848Y40	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.	Thomas Scientific	8847T08	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.	Thomas Scientific	8847T02	Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure	Coherent Scientific	14121	Surgical Equipment
Closed Connector	Thomas Scientific	8847E25	Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24	Specialist Medical Supplies	S195	Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	To make Krebs Buffer
Dual Channel Console	ADInstruments	TS402	Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD	Coherent Scientific	14114	Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated	Met-App Australia Pty Ltd	1352	Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)	Thermoline Scientific	TU3	Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter	Thomas Scientific	8847V08	Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor	John Morris	1015164	Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved	Coherent Scientific	WPI-501748	Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight	Coherent Scientific	WPI-501252	Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS	John Morris	1014414	Mounting screws for pump heads
Open-sided connector	Thomas Scientific	8847E05	Rig Construction
Paraformadehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g	VWR Chemicals	26764.26	To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software	ADInstruments	ML826	Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK	Merck Millipore	SX0004701	Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK	Merck Millipore	XX1104707	Rig Construction
Single Buret Clamp	Thomas Scientific	8847T32	Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler)	Sigma-aldrich	59277	Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector	Thomas Scientific	8847E35	Rig Construction
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm	Merck Millipore	SX0004700	Rig Construction
syringes 1 mL box/100	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm	Met-App Australia Pty Ltd	1356	Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410	ADInstruments	TS410	Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades	Coherent Scientific	WPI-500-086	Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray	Thermoline Scientific	TLWB-30	Rig Construction