使用分离的工作大鼠心脏模型测试供体心脏保存策略

摘要

我们描述了一种 离体 分离的工作大鼠心脏方案，以测试供体心脏保存策略。本文描述了用于啮齿动物供体心脏静态冷藏的方案;然而，该方案也可用于循环死亡和脑死亡后捐献后获得的供体心脏。

摘要

优化供体心脏保存解决方案在减少器官提取、运输和移植过程中供体心脏缺血再灌注损伤方面发挥了关键作用。我们实验室以前的研究表明，在供体心脏保存溶液中添加三硝酸甘油酯和促红细胞生成素可以显着改善长时间冷藏后和循环死亡心脏后捐献后的心脏功能恢复。该补充方案已在澳大利亚、比利时和英国的移植单位临床使用中实施。在这里，我们概述了使用 离体 分离工作大鼠心脏 （IWRH） 灌注回路测试补充策略的方案。使用这种方法，可以在长期冷静态储存、脑死亡后捐献和循环死亡后捐献供体心脏保存的情况下测试补充策略。通过主动脉血流、冠状动脉血流、心输出量、脉压和心率测量的心脏功能恢复可用于确定特定的保留策略是否可以最大限度地减少供体心脏的缺血再灌注损伤。

引言

心脏移植的成功与否在很大程度上受到供体心脏保存方法的影响。供体心脏在整个器官提取、运输和移植过程中会受到缺血性损伤。通过选择合适的供体心脏保存策略，可以减轻供体器官的缺血性损伤程度。静态冷储存 （CSS） 仍然是最可行和最常见的供体心脏保存方法;然而，CSS 可能不一定是所有心脏捐献途径的最佳选择。例如，通过循环死亡后捐献 （DCD） 途径获得的心脏使用常温机器灌注进行维持和生存评估，而通过脑死亡后捐献 （DBD） 途径获得的心脏可以使用 CSS 或低温机器灌注进行保留。所用保存策略的另一个重要决定因素是心脏在器官获取和运输过程中遭受的热缺血（对于 DCD）或冷缺血（对于 DBD）的量。

许多中心使用心脏保存溶液的额外药物补充剂来提高缺血耐受性并改善移植后的心脏功能。我们实验室的啮齿动物研究表明，在供体心脏长期冷藏后，用促红细胞生成素和三硝酸甘油补充心脏麻痹能够显著改善心脏功能的恢复 ^1,2。这些研究随后发展到供体心脏保存的猪研究，并为导致促红细胞生成素和硝酸甘油酯掺入利用常温机器灌注的 DCD 途径获得的心脏心脏停搏溶液中提供了临床前基础 ^3,4,5。目前，澳大利亚移植病房也使用促红细胞生成素和三硝酸甘油补充剂，用于结合 CSS 的临床 DBD 心脏取回。下面概述的离体工作大鼠心脏 （IWRH） 灌注方案的总体目标是在实验室环境中测试供体心脏保存策略，并测试它们在再灌注后保留供体心脏功能的功效。所描述的分离工作大鼠心脏方案在我们的实验室内已经使用了二十多年，并已被证明在筛选可以改善供体心脏保存的潜在补充剂和/或策略方面非常有用 2,7,8,9。

研究方案

所有动物都按照国家健康与医学研究委员会（澳大利亚）的指导方针接受了人道照顾。所有动物程序均已获得 Garvan 医学研究所（澳大利亚悉尼）动物伦理委员会的批准。

1. Krebs-Henseleit （KH） 缓冲液的制备

1. 制备 2 L 含有 2.36 M NaCl、0.094 M KCl、0.024 M MgSO₄、0.024 M KH₂PO₄ 的 20x KH 缓冲液储备液。分装到 50 mL 试管中并储存在 -20 °C 下。
2. 实验前，准备两个 2 L Erlenmyer 烧瓶，其中包含 1x KH 缓冲液，含有 1900 mL 去离子水、100 mL 20x 储备 KH 缓冲液、4.20 g NaHCO₃ （25 mM） 和 3.96 g 葡萄糖 （11 mM）。
   1. 将缓冲瓶置于 37 °C 水浴中，通过气石（滑入式入口过滤器）用碳化物（95% 氧气、5% 二氧化碳，流速设置为 2 L/min）对溶液进行气体化 5 分钟，然后加入 2.8 mL 的 1 M CaCl₂ （1.4 mM）。在实验开始前，继续将溶液鼓泡至少 1 小时。使用气石有助于缓冲液的均匀通气。
   2. 将少量 （~50 mL） 缓冲液放入 -20 °C 的圆形金属培养皿中冷却并形成一层冰冻缓冲液。

2. 灌注回路的制备

1. 确保所有管道和玻璃器皿清洁，没有可见的生长/污染。
2. 根据 1 cm H₂O 相当于 1.36 mmHg 设置玻璃腔室的高度以对应于所需的灌注压力:Langendorff 到心脏 100 cm（约 75 mmHg），预负荷工作侧到心脏 15 cm（约 11 mmHg），心脏到后负荷腔室 100 cm（约 75 mmHg）。
3. 在心脏灌注前至少 10 分钟开始热水循环。
4. 将超细纤维过滤器 （1.2 μm） 放入过滤器支架中并紧紧固定。
5. 用 KH 缓冲液灌注回路，确保去除所有空气，并使用流量控制管路夹将 Langendorff 侧的流量（图 1A、B）调节至 ~50 mL/min。较慢的血流使主动脉插管变得容易，并防止心脏在打结前脱落。通过 T 形管接头在回路内放置温度计，以监测缓冲液在 ~37 °C 的温度。

3. 设置 Lab Chart（数据分析）软件

1. 在打开数据分析软件之前，请确保 Powerlab（数据采集系统）和流量计已打开并连接到计算机。
2. 打开一个新文件。
3. 通过选择 Settings 下拉菜单并选择 Channel Settings 来设置数据收集。选择 主动脉压、主动脉血流和 心率 （图 2A）。
4. 使用 图 2B 所示的设置设置每个通道。

4. 动物大鼠心脏分离的制备

注:用于冷静态储存的非 DBD 和非 DCD 心脏的大鼠心脏分离和灌注方法概述如下。无论使用哪种捐献方法，将心脏器械连接到灌注回路的方法都相对相似。DBD 和 DCD 大鼠心脏捐赠方案的差异主要发生在动物麻醉生效到从动物身上切除心脏的时间。

1. 称量动物，确保其重量为 >330 克。雄性大鼠的理想体重范围为 330-420 克。
2. 腹膜内注射氯胺酮 （80 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （10 mg/kg）。在没有踏板反射（脚趾捏反射）和眨眼反射的基础上，确保足够的手术麻醉平面。
3. 将动物置于仰卧位，用胶带固定四肢。通过鼻锥为动物施氧。
4. 在解剖站放置 KH 缓冲冰泥金属容器和一个装有冰的小金属容器。将 7.5 cm x 7.5 cm 的纱布浸泡在 KH 缓冲液中，然后将其放在装有冰块的容器上。
5. 一旦确认足够的手术麻醉平面，就刮掉手术切口部位的皮肤，并用优碘或 70% 酒精等无菌剂清洁皮肤。在腹部做一个侧切口（剖腹手术），将胃和肠移到一侧，以便进入左肾静脉。注射 1500 IU 肝素并对注射部位施加压力，直到出血停止。让肝素循环 1-2 分钟，然后继续取心。
6. 切开两侧的胸腔并切开横膈膜，打开胸腔。小心握住并抬起心肺块，同时沿着降主动脉切开，确保主动脉弓保持完整。这将允许足够的主动脉长度用于插管。
7. 在麻醉下通过切除心脏和肺对大鼠实施安乐死。将心肺块浸入 KH 缓冲冰泥中，以使心脏停止跳动。

5. 将心脏插管到离体的工作心脏灌注回路上

1. 将心肺块转移到冰上的纱布上。解剖主动脉周围多余的脂肪，修剪主动脉，留下 3-5 毫米的长度用于插管，并在肺动脉中做一个小切口 ~1-2 毫米。这将为冠状动脉流出物留出一条路径。
2. 将修剪过的心肺块（仍在冰上时）直接放在套管下方。使用流量控制管夹调节 Langendorff 侧的流量，以促进主动脉插管。小心地将主动脉插管到左插管上，用黑色夹子固定，然后用 2-0 丝缝合线系住。
3. 通过完全打开流量控制管夹来增加 Langendorff 灌注的流量。打开后载夹具。确保 Langendorff 腔室有连续的流出。开始使用软件监测心脏活动。
   注意:如果流量计显示屏上的主动脉流量值为 <10 mL/min，请确保肺动脉切开术具有足够的大小。低主动脉血流轨迹/值也可能表明主动脉插管插入得太远。
4. 调整心肺块，使肺的前表面面向操作者。用 2-0 丝缝合线系住左肺叶，切掉多余的左肺组织。用 2-0 丝缝合线将剩余的肺叶一次性打结并切割组织。旋转心脏，使被绑住的肺朝向背部。
5. 使用小 Vannas 剪刀，剪下左心耳的 2-3 毫米边缘，确保在心房中形成一个小开口。小心地将左心耳套管到左套管上，用黑色夹子固定，然后用 2-0 丝缝线系住。 图 3A 显示了两个套管的位置。
6. 调整心腔水套，使心脏位于心腔中心内。
7. 通过选择 Bridge Amp >> Zero 的主动脉压下拉菜单，在软件中将压力传感器打开到空气并将压力传感器归零。单击 OK。
8. 以 Langendorff 模式灌注心脏 10 分钟。确保 Langendoff 主动脉血流测量值在 10-20 mL/min（理想 20 mL/min）之间。
9. 在切换工作模式之前，请确保将 Langendorff KH 缓冲液储液罐中的气石（滑入式入口过滤器）置于正常工作的 KH 缓冲液储液罐中。
10. 通过关闭通向主动脉插管的大夹子并打开通向左心耳的气流，将心脏切换到工作模式。从工作灌注液打开三向水龙头引出。将公共回流管（将 KH 缓冲液带回储液槽）从 Langendorff 储液槽转移到工作储液槽。
11. 在工作模式下灌注心脏 15 分钟。理想情况下，在 15 分钟灌注结束时，主动脉血流值为 >30 mL/min。心脏稳定后，开始在数据分析软件中记录数据。
12. 在 1 分钟、5 分钟、10 分钟和 15 分钟测量冠状动脉流出物（冠状动脉血流）。
    注:冠状动脉流量值应在 10-20 mL/min 之间。冠状动脉血流大于 22 mL/min 通常表明漏源于解开的肺血管。心率应在 200-300 次/分之间。可以收集冠状动脉流出物用于组织损伤标志物（例如肌钙蛋白-I、乳酸脱氢酶释放）的下游分析。

6. 心脏停搏器用于心脏的冷静态储存

1. 用 50 mL 指定的心脏保存溶液（有或没有补充剂）填充心脏停搏室（位于 60 cm 的高度，产生约 40 mmHg 的灌注压）。
2. 降低水套并关闭工作模式侧的三向水龙头。
3. 通过关闭夹子来阻止流向左心房插管流动。
4. 打开流向主动脉插管的气流。
5. 从 Langendoff 侧和后载荷上关闭夹具。
6. 从心脏停搏管上打开夹子，从压力管中冲洗出 15 mL 心脏停搏。关闭压力线处的水龙头。
7. 让心脏通过主动脉插管冲洗心脏，并收集冠状动脉流出物。运行心脏停搏 3 分钟并记录心脏停搏的体积。
8. 停止在软件中记录数据并保存文件。
9. 3 分钟后，关闭心脏停搏夹和通向主动脉插管的蓝色小夹。
10. 将 bulldog 夹放在主动脉插管上，将第二个 bulldog 夹放在左侧插管上。断开心脏插管阻滞与电路的连接，并将其放入装有心脏停搏的烧杯中，放在冰盒中（图 3B、C）。
11. 将心脏存放在冰箱中 6 小时（或所需的冷藏时间）。

7. 静态冷藏后的心脏再灌注

1. 按照第 1 节准备 KH 缓冲液。
2. 按照第 2 节灌注灌注回路。
3. 打开保存的基线灌注文件。
4. 小心地从冰盒中取出心脏插管阻滞并将其固定在灌注回路上。在重新连接主动脉插管之前，使用装满 KH 缓冲液的钝端 18 G 注射器去除插管中的任何空气。首先连接主动脉插管，打开 Langendorff 侧的管夹，并确保后负荷管夹打开。
5. 重新连接左心房插管，确保在连接到灌注回路之前已从插管中去除空气。保持工作侧夹具关闭，直到需要从 Langendorff 切换到工作模式。
6. 以 Langendorff 模式灌注心脏 15 分钟。确保在 Langendorff 再灌注开始时开始记录数据。
7. 在切换到工作模式之前，将两个冒泡的石头放入 KH 缓冲液中，打开工作侧的 3 通水龙头，然后将公共回流管转移到工作储液器中。
8. 关闭白色 Langendorff 夹，打开白色工作侧夹，灌注心脏 30 分钟。在指定时间点测量和收集冠状动脉流出物以进行下游分析（例如，心脏损伤标志物）。确保停止-重新启动软件录制以启动新区段（或者添加注释）。
9. 在大约 15 分钟的工作模式再灌注时，关闭三向水龙头。
10. 再灌注结束时，保存数据文件，停止流经回路的血流，并断开心脏阻滞。收集左心室样本用于组织学处理和/或快速冷冻用于未来研究（例如，用于蛋白质印迹研究的蛋白质提取）。
11. 从过滤器支架上取下过滤器，从回路中排出缓冲液，然后用 5 L 蒸馏水冲洗两次。
    注意:虽然不是必需的，但将蒸馏水预热在水浴内的大容器中确实有帮助。

8. 功能恢复分析

1. 打开 LabChart 文件。
2. 突出显示录制至少 30 秒的区域，然后单击 Command > Add data selection（添加数据选择）或 Multiple add to data（多个添加到数据）。这会将所需的参数添加到软件中的 DataPad 文件中。
3. 选择 DataPad >窗口下拉菜单。
4. 突出显示 DataPad 中的恢复值并将其复制到电子表格中，以进行功能恢复分析。计算功能恢复占其各自基线值 ^1,6,7 的百分比。

结果

基线灌注的结果将决定初始实验（预储存）是否成功。Langendorff 模式期间显示的主动脉流量应在 14 - 22 mL/min 之间。由于主动脉的逆行灌注，Langendorff 流量在流量计上显示为负值。可接受的 Langendorff 迹线示例如图 4A 所示。

切换到工作模式后，一旦心脏稳定，主动脉流量应至少为 30 mL/min。血流最初激增至约 50 mL/min，然后降至约 2...

讨论

鉴于心脏基线功能的敏感性，必须注意保持灌注装置清洁并与兼容的组件。例如，必须使用正确的 PVC 管。一些导管材料（如硅胶）会导致主动脉血流和收缩力降低，这可能是由于氧气通过导管流失所致。虽然市面上有孤立的工作大鼠心脏灌注回路，但其中大多数主要用于 Langendorff 灌注。通常，在 Langendoff 灌注模型中，可以通过将球囊导管插入左心室来获得功能测量，以...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit	ADInstruments	MLT1199	Data Acquisition
Bridge Amp	ADInstruments	FE221	Data Acquisition
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 thermometer	Hanna Instruments	HI98509	Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12	Thomas Scientific	2848Y40	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.	Thomas Scientific	8847T08	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.	Thomas Scientific	8847T02	Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure	Coherent Scientific	14121	Surgical Equipment
Closed Connector	Thomas Scientific	8847E25	Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24	Specialist Medical Supplies	S195	Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	To make Krebs Buffer
Dual Channel Console	ADInstruments	TS402	Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD	Coherent Scientific	14114	Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated	Met-App Australia Pty Ltd	1352	Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)	Thermoline Scientific	TU3	Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter	Thomas Scientific	8847V08	Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor	John Morris	1015164	Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved	Coherent Scientific	WPI-501748	Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight	Coherent Scientific	WPI-501252	Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS	John Morris	1014414	Mounting screws for pump heads
Open-sided connector	Thomas Scientific	8847E05	Rig Construction
Paraformadehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g	VWR Chemicals	26764.26	To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software	ADInstruments	ML826	Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK	Merck Millipore	SX0004701	Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK	Merck Millipore	XX1104707	Rig Construction
Single Buret Clamp	Thomas Scientific	8847T32	Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler)	Sigma-aldrich	59277	Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector	Thomas Scientific	8847E35	Rig Construction
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm	Merck Millipore	SX0004700	Rig Construction
syringes 1 mL box/100	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm	Met-App Australia Pty Ltd	1356	Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410	ADInstruments	TS410	Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades	Coherent Scientific	WPI-500-086	Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray	Thermoline Scientific	TLWB-30	Rig Construction