Utilisation d’un modèle de cœur de rat isolé pour tester les stratégies de préservation du cœur d’un donneur

Résumé

Nous décrivons un protocole de cœur de rat de travail isolé ex vivo pour tester les stratégies de préservation du cœur du donneur. Cet article décrit le protocole d’utilisation dans l’entreposage frigorifique statique des cœurs de donneurs de rongeurs ; Cependant, le protocole peut également être utilisé pour les cœurs de donneurs obtenus après un don après une mort circulatoire et une mort cérébrale.

Résumé

L’optimisation des solutions de préservation du cœur du donneur a joué un rôle clé dans la réduction des lésions d’ischémie-reperfusion dans le cœur du donneur lors du prélèvement, du transport et de la transplantation d’organes. Des travaux antérieurs de notre laboratoire ont montré que l’ajout de trinitrate de glycéryle et d’érythropoïétine aux solutions de préservation du cœur du donneur pouvait améliorer considérablement la récupération fonctionnelle cardiaque après un stockage prolongé au froid et dans le don après une mort circulatoire cardiaque. Ce protocole de supplémentation a été mis en œuvre en utilisation clinique dans des unités de transplantation en Australie, en Belgique et au Royaume-Uni. Ici, nous décrivons un protocole pour tester des stratégies de supplémentation à l’aide d’un circuit de perfusion de cœur de rat de travail isolé ex vivo (IWRH). À l’aide de cette méthodologie, les stratégies de supplémentation peuvent être testées dans le contexte d’un stockage statique froid prolongé, d’un don après une mort cérébrale et d’un don après la mort circulatoire d’un donneur. La récupération fonctionnelle cardiaque, mesurée par le débit aortique, le débit coronarien, le débit cardiaque, la pression du pouls et la fréquence cardiaque, peut être utilisée pour déterminer si une stratégie de préservation particulière peut minimiser les lésions d’ischémie-reperfusion du cœur du donneur.

Introduction

Le succès d’une transplantation cardiaque peut être grandement influencé par la méthode de conservation utilisée pour le cœur du donneur. Les cœurs des donneurs sont soumis à des agressions ischémiques tout au long du processus de prélèvement, de transport et de transplantation d’organes. Le degré de lésions ischémiques de l’organe du donneur peut être atténué par le choix d’une stratégie appropriée de préservation du cœur du donneur. Le stockage statique à froid (CSS) reste la méthode la plus réalisable et la plus courante pour la préservation du cœur d’un donneur ; cependant, le CSS n’est pas nécessairement la meilleure option pour ....

Protocole

Tous les animaux ont reçu des soins sans cruauté conformément aux directives du National Health and Medical Research Council (Australie). Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale du Garvan Institute of Medical Research (Sydney, Australie).

1. Préparation du tampon Krebs-Henseleit (KH)

1. Préparer 2 L d’une solution mère 20x de tampon KH contenant 2,36 M de NaCl, 0,094 M de KCl, 0,024 M de MgSO₄, 0,024 M KH₂PO₄. Humidifier dans des tubes de 50 mL et conserver à -20 °C.
2. Avant l’expérience, prépar....

Résultats

Les résultats de la perfusion de base détermineront si l’expérience initiale (pré-stockage) a été couronnée de succès. Le débit aortique affiché en mode Langendorff doit être compris entre 14 et 22 mL/min. Le débit de Langendorff est affiché sous la forme d’une valeur négative sur le débitmètre en raison de la perfusion rétrograde de l’aorte. La figure 4A montre un exemple de trace de Langendorff acceptable.

Discussion

Étant donné la nature sensible de la fonction cardiaque de base, des précautions doivent être prises pour maintenir le dispositif de perfusion propre et avec des composants compatibles. Par exemple, il faut utiliser le bon tube en PVC. Certains matériaux de tubulaire, tels que le silicone, peuvent contribuer à réduire le flux aortique et la contractilité, ce qui peut être dû à une perte d’oxygène via le tube. Bien qu’il existe des circuits de perfusion cardiaque de rat fo.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit	ADInstruments	MLT1199	Data Acquisition
Bridge Amp	ADInstruments	FE221	Data Acquisition
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 thermometer	Hanna Instruments	HI98509	Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12	Thomas Scientific	2848Y40	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.	Thomas Scientific	8847T08	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.	Thomas Scientific	8847T02	Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure	Coherent Scientific	14121	Surgical Equipment
Closed Connector	Thomas Scientific	8847E25	Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24	Specialist Medical Supplies	S195	Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	To make Krebs Buffer
Dual Channel Console	ADInstruments	TS402	Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD	Coherent Scientific	14114	Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated	Met-App Australia Pty Ltd	1352	Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)	Thermoline Scientific	TU3	Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter	Thomas Scientific	8847V08	Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor	John Morris	1015164	Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved	Coherent Scientific	WPI-501748	Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight	Coherent Scientific	WPI-501252	Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS	John Morris	1014414	Mounting screws for pump heads
Open-sided connector	Thomas Scientific	8847E05	Rig Construction
Paraformadehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g	VWR Chemicals	26764.26	To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software	ADInstruments	ML826	Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK	Merck Millipore	SX0004701	Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK	Merck Millipore	XX1104707	Rig Construction
Single Buret Clamp	Thomas Scientific	8847T32	Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler)	Sigma-aldrich	59277	Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector	Thomas Scientific	8847E35	Rig Construction
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm	Merck Millipore	SX0004700	Rig Construction
syringes 1 mL box/100	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm	Met-App Australia Pty Ltd	1356	Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410	ADInstruments	TS410	Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades	Coherent Scientific	WPI-500-086	Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray	Thermoline Scientific	TLWB-30	Rig Construction