Utilisation d’un modèle de cœur de rat isolé pour tester les stratégies de préservation du cœur d’un donneur

Résumé

Nous décrivons un protocole de cœur de rat de travail isolé ex vivo pour tester les stratégies de préservation du cœur du donneur. Cet article décrit le protocole d’utilisation dans l’entreposage frigorifique statique des cœurs de donneurs de rongeurs ; Cependant, le protocole peut également être utilisé pour les cœurs de donneurs obtenus après un don après une mort circulatoire et une mort cérébrale.

Résumé

L’optimisation des solutions de préservation du cœur du donneur a joué un rôle clé dans la réduction des lésions d’ischémie-reperfusion dans le cœur du donneur lors du prélèvement, du transport et de la transplantation d’organes. Des travaux antérieurs de notre laboratoire ont montré que l’ajout de trinitrate de glycéryle et d’érythropoïétine aux solutions de préservation du cœur du donneur pouvait améliorer considérablement la récupération fonctionnelle cardiaque après un stockage prolongé au froid et dans le don après une mort circulatoire cardiaque. Ce protocole de supplémentation a été mis en œuvre en utilisation clinique dans des unités de transplantation en Australie, en Belgique et au Royaume-Uni. Ici, nous décrivons un protocole pour tester des stratégies de supplémentation à l’aide d’un circuit de perfusion de cœur de rat de travail isolé ex vivo (IWRH). À l’aide de cette méthodologie, les stratégies de supplémentation peuvent être testées dans le contexte d’un stockage statique froid prolongé, d’un don après une mort cérébrale et d’un don après la mort circulatoire d’un donneur. La récupération fonctionnelle cardiaque, mesurée par le débit aortique, le débit coronarien, le débit cardiaque, la pression du pouls et la fréquence cardiaque, peut être utilisée pour déterminer si une stratégie de préservation particulière peut minimiser les lésions d’ischémie-reperfusion du cœur du donneur.

Introduction

Le succès d’une transplantation cardiaque peut être grandement influencé par la méthode de conservation utilisée pour le cœur du donneur. Les cœurs des donneurs sont soumis à des agressions ischémiques tout au long du processus de prélèvement, de transport et de transplantation d’organes. Le degré de lésions ischémiques de l’organe du donneur peut être atténué par le choix d’une stratégie appropriée de préservation du cœur du donneur. Le stockage statique à froid (CSS) reste la méthode la plus réalisable et la plus courante pour la préservation du cœur d’un donneur ; cependant, le CSS n’est pas nécessairement la meilleure option pour toutes les voies de don de cœur. Par exemple, les cœurs obtenus par la voie du don après la mort circulatoire (DCD) sont maintenus et évalués pour leur viabilité à l’aide de la perfusion mécanique normothermique, tandis que les cœurs obtenus par la voie du don après la mort cérébrale (DBD) peuvent être préservés à l’aide de la CSS ou de la perfusion par machine hypothermique. Un autre déterminant important de la stratégie de préservation utilisée est la quantité d’ischémie chaude (pour le TDC) ou d’ischémie froide (pour le DBD) à laquelle le cœur est soumis lors du prélèvement et du transport des organes.

De nombreux centres utilisent une supplémentation pharmacologique supplémentaire de la solution de préservation cardiaque pour augmenter la tolérance ischémique et améliorer la fonction cardiaque post-greffe. Des études sur des rongeurs de notre laboratoire ont montré que la supplémentation de la cardioplégie avec de l’érythropoïétine et du trinitrate de glycéryle était capable d’améliorer considérablement la récupération fonctionnelle cardiaque après un stockage prolongé au froid du cœur du donneur ^1,2. Ces études ont ensuite évolué vers des études porcines sur la préservation du cœur d’un donneur et ont fourni les bases précliniques qui ont conduit à l’incorporation de l’érythropoïétine et du trinitrate de glycéryle dans la solution de cardioplégie des cœurs obtenue par une voie DCD en utilisant la perfusion de machine normothermique ^3,4,5. À l’heure actuelle, la supplémentation en érythropoïétine et en trinitrate de glycéryle est également utilisée dans les unités de transplantation australiennes pour les prélèvements cardiaques cliniques de DBD intégrant du CSS. L’objectif global du protocole de perfusion du cœur de rat de travail isolé (IWRH) décrit ci-dessous est de tester les stratégies de préservation du cœur du donneur en laboratoire et de tester leur efficacité pour préserver la fonction cardiaque du donneur après la reperfusion. Le protocole de travail isolé du cœur de rat décrit est utilisé depuis plus de deux décennies au sein de notre laboratoire et s’est avéré extrêmement utile dans le dépistage de suppléments et/ou de stratégies potentiels pouvant améliorer la préservation du cœur du donneur 2,7,8,9.

Protocole

Tous les animaux ont reçu des soins sans cruauté conformément aux directives du National Health and Medical Research Council (Australie). Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale du Garvan Institute of Medical Research (Sydney, Australie).

1. Préparation du tampon Krebs-Henseleit (KH)

1. Préparer 2 L d’une solution mère 20x de tampon KH contenant 2,36 M de NaCl, 0,094 M de KCl, 0,024 M de MgSO₄, 0,024 M KH₂PO₄. Humidifier dans des tubes de 50 mL et conserver à -20 °C.
2. Avant l’expérience, préparez deux flacons Erlenmyer de 2 L contenant 1 tampon KH contenant 1900 ml d’eau déminéralisée, 100 ml de tampon KH 20 kg, 4,20 g de NaHCO₃ (25 mM) et 3,96 g de glucose (11 mM).
   1. Placer les ballons tampons dans un bain-marie à 37 °C et gazer la solution avec du carbogène (95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone, débit réglé à 2 L/min) à l’aide de pierres à air (filtre d’entrée à enfiler) pendant 5 min, puis ajouter 2,8 mL de 1 M de CaCl₂ (1,4 mM). Continuez à faire bouillonner la solution pendant au moins 1 h avant le début de l’expérience. L’utilisation d’une pierre à air aide à l’aération uniforme de la zone tampon.
   2. Placez un petit volume (~50 ml) de tampon dans un plat rond en métal à -20 °C pour refroidir et former une couche de tampon glacé.

2. Préparation du circuit de perfusion

1. Assurez-vous que tous les tubes et la verrerie sont propres, sans croissance ou contamination visible.
2. Régler les hauteurs des chambres en verre pour correspondre aux pressions de perfusion requises sur la base de 1 cm H₂O équivalant à 1,36 mmHg : Langendorff-cœur 100 cm (environ 75 mmHg), précharge latérale 15 cm (environ 11 mmHg), chambre cœur-cœur 100 cm (environ 75 mmHg).
3. Commencer la circulation de l’eau chaude autour du circuit au moins 10 minutes avant la perfusion cardiaque.
4. Placez les filtres en microfibre (1,2 μm) dans les porte-filtres et fixez-les hermétiquement.
5. Amorcez le circuit avec un tampon KH, en vous assurant que tout l’air est éliminé, et utilisez une pince de tube de contrôle de débit pour ajuster le débit du côté Langendorff (Figure 1A, B) à ~50 mL/min. Le débit plus lent facilite la canulation aortique et empêche le cœur d’être délogé avant le liage. Placez un thermomètre dans le circuit via un connecteur de tube en forme de T pour surveiller la température du tampon à ~37 °C.

3. Mise en place du logiciel Lab Chart (analyse de données)

1. Assurez-vous que le Powerlab (système d’acquisition de données) et le débitmètre sont allumés et connectés à l’ordinateur avant d’ouvrir le logiciel d’analyse de données.
2. Ouvrez un nouveau fichier.
3. Configurez la collecte de données en sélectionnant le menu déroulant Paramètres et en sélectionnant Paramètres du canal. Sélectionnez la pression aortique, le débit aortique et la fréquence cardiaque (Figure 2A).
4. Configurez chaque canal avec les paramètres indiqués à la Figure 2B.

4. Préparation de l’animal à l’isolement du cœur du rat

REMARQUE : La méthodologie d’isolement et de perfusion du cœur de rat pour les cœurs non DBD et non DCD pour l’entreposage statique à froid est décrite ci-dessous. Les méthodes d’instrumentation cardiaque sur le circuit de perfusion sont relativement similaires, quelle que soit la méthode de don utilisée. Les différences dans le protocole pour le don de cœur de rat DBD et DCD se produisent principalement à partir du moment où l’anesthésie animale a pris effet jusqu’au moment où le cœur est excisé de l’animal.

1. Pesez l’animal en vous assurant qu’il pèse > 330 g. La fourchette de poids idéale pour les rats mâles est de 330 à 420 g.
2. Administrer une injection intrapéritonéale de kétamine (80 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg). Assurer un plan chirurgical adéquat de l’anesthésie en fonction de l’absence de réflexe de pédale (réflexe de pincement des orteils) et de réflexe de clignement des yeux.
3. Placez l’animal en position couchée, en fixant les membres avec du ruban adhésif. Administrez de l’oxygène à l’animal via un cône nasal.
4. Disposez du tampon KH, d’un récipient en métal pour la glace fondue et d’un petit récipient en métal avec de la glace au poste de dissection. Trempez une gaze de 7,5 cm x 7,5 cm dans un tampon KH et placez-la sur le récipient avec de la glace.
5. Une fois que le plan chirurgical adéquat de l’anesthésie est confirmé, rasez la peau au site d’incision chirurgicale et nettoyez la peau avec des produits aseptiques tels que la bétadine ou l’alcool à 70%. Faites une incision latérale à travers l’abdomen (laparotomie) et déplacez l’estomac et les intestins sur le côté pour permettre l’accès à la veine rénale gauche. Injectez 1500 UI d’héparine et appliquez une pression sur le site d’injection jusqu’à ce que le saignement cesse. Attendez 1 à 2 minutes pour que l’héparine circule avant de poursuivre la récupération cardiaque.
6. Ouvrez la cavité thoracique en coupant à travers la cage thoracique de chaque côté et en coupant à travers le diaphragme. Tenez et soulevez soigneusement le bloc cœur-poumon tout en coupant le long de l’aorte descendante, en vous assurant que l’arc aortique reste intact. Cela permettra à l’aorte de rester suffisamment longue pour la canulation.
7. Le rat est euthanasié par l’ablation du cœur et des poumons sous anesthésie. Immergez le bloc cœur-poumon dans la gadoue de glace tampon KH pour permettre au cœur de s’arrêter.

5. Canulation du cœur sur le circuit de perfusion du cœur de travail isolé

1. Transférez le bloc cœur-poumon dans une gaze sur de la glace. Disséquez l’excès de graisse autour de l’aorte, coupez l’aorte pour laisser une longueur de 3 à 5 mm pour la canulation et faites une petite incision de ~ 1 à 2 mm dans l’artère pulmonaire. Cela permettra de tracer un chemin pour l’effluent coronaire.
2. Placez le bloc cœur-poumon coupé (encore sur de la glace) directement sous les canules. Ajustez le débit du côté Langendorff à l’aide d’une pince de tube de contrôle de débit pour faciliter la canulation aortique. Canulez soigneusement l’aorte sur la canule gauche, maintenez-la avec une pince noire et attachez-la avec une suture en soie 2-0.
3. Augmentez le débit de la perfusion Langendorff en ouvrant complètement la pince de la tubulure de contrôle de débit. Ouvrez la pince de postcharge. Assurez-vous qu’il y a un écoulement continu de la chambre Langendorff. Commencez à surveiller l’activité cardiaque à l’aide d’un logiciel.
   REMARQUE : si la valeur du débit aortique sur l’affichage du débitmètre est de <10 mL / min, assurez-vous que l’artériotomie pulmonaire est de taille suffisante. Une trace/valeur de flux aortique faible peut également indiquer que la canule aortique a été insérée trop loin.
4. Ajustez le bloc cœur-poumon de manière à ce que la surface antérieure des poumons soit face à l’opérateur. Attachez le lobe pulmonaire gauche avec une suture en soie 2-0 et coupez l’excès de tissu pulmonaire gauche. Attachez les lobes pulmonaires restants en un seul coup avec une suture en soie 2-0 et coupez le tissu. Faites pivoter le cœur de manière à ce que les poumons attachés soient vers l’arrière.
5. À l’aide de petits ciseaux Vannas, coupez un bord de 2 à 3 mm de l’appendice auriculaire gauche, en veillant à ce qu’une petite ouverture dans les oreillettes soit obtenue. Canulez soigneusement l’appendice auriculaire gauche sur la canule gauche, maintenez-le avec une pince noire et attachez-le avec une suture en soie 2-0. La figure 3A montre l’emplacement des deux canules.
6. Ajustez l’enveloppe d’eau de la chambre cardiaque de manière à ce que le cœur se trouve au centre de la chambre.
7. Ouvrez le transducteur de pression à l’air et mettez-le à zéro dans le logiciel en sélectionnant le menu déroulant Pression aortique > Bridge Amp > Zero. Cliquez sur OK.
8. Perfuser le cœur en mode Langendorff pendant 10 min. Assurez-vous que le débit aortique de Langendoff mesure entre 10 et 20 ml/min (idéal : 20 ml/min).
9. Avant de changer de mode de fonctionnement, assurez-vous que la pierre à air (filtre d’entrée à enfiler) du réservoir tampon Langendorff KH est placée dans le réservoir tampon KH de travail.
10. Mettez le cœur en mode de fonctionnement en fermant la grande pince menant à la canule aortique et en ouvrant le flux menant à l’appendice auriculaire gauche. Ouvrez le robinet à trois voies menant au perfusat de travail. Transférez la tubulure de retour commune (ramenant le tampon KH dans le réservoir) du réservoir Langendorff vers le réservoir de travail.
11. Perfuser le cœur en mode de travail pendant 15 min. Les valeurs de débit aortique doivent idéalement être de >30 mL/min à la fin de la perfusion de 15 min. Une fois que le cœur s’est stabilisé, commencez à enregistrer les données dans un logiciel d’analyse de données.
12. Mesurez l’effluent coronaire (débit coronaire) à 1 min, 5 min, 10 min et 15 min.
    REMARQUE : Les valeurs de débit coronaire doivent être comprises entre 10 et 20 mL/min. Un débit coronaire supérieur à 22 mL/min indique généralement une fuite provenant d’un vaisseau pulmonaire non attaché. La fréquence cardiaque doit être comprise entre 200 et 300 bpm. Les effluents coronaires peuvent être prélevés pour l’analyse en aval des marqueurs de lésions tissulaires (p. ex., troponine I, libération de lactate déshydrogénase).

6. Administration de la cardioplégie pour le stockage statique froid du cœur

1. Remplissez la chambre de cardioplégie (positionnée à une hauteur de 60 cm pour produire une pression de perfusion d’environ 40 mmHg) avec 50 ml de solution de préservation cardiaque désignée (avec ou sans supplémentation).
2. Abaissez la chemise d’eau et fermez le robinet à trois voies du côté du mode de fonctionnement.
3. Arrêtez l’écoulement vers la canule auriculaire gauche en fermant la pince.
4. Ouvrez le flux vers la canule aortique.
5. Fermez la pince du côté Langendoff et sur la postcharge.
6. Ouvrez la pince à partir de la ligne de cardioplégie et évacuez 15 ml de cardioplégie de la ligne de pression. Fermez le robinet au niveau de la conduite de pression.
7. Laissez le cœur être rincé avec la cardioplégie via la canule aortique et collectez l’effluent coronaire. Exécutez cardioplégie pendant 3 minutes et enregistrez le volume de cardioplégie administré.
8. Arrêtez d’enregistrer les données dans le logiciel et enregistrez le fichier.
9. Au bout de 3 min, refermer la pince de cardioplégie et la petite pince bleue menant à la canule aortique.
10. Placez une pince bouledogue sur la canule aortique et une deuxième pince bouledogue sur la canule gauche. Débranchez le bloc canule cardiaque du circuit et placez-le dans un bécher contenant la cardioplégie dans une glacière (Figure 3B, C).
11. Conservez le cœur au réfrigérateur pendant 6 h (ou le temps de conservation au froid souhaité).

7. Reperfusion cardiaque après un stockage statique à froid

1. Préparez le tampon KH conformément à la section 1.
2. Amorcez le circuit de perfusion conformément à la section 2.
3. Ouvrez le fichier enregistré à partir de la perfusion de base.
4. Retirez avec précaution le bloc de canule cardiaque de la glacière et fixez-le sur le circuit de perfusion. Avant de reconnecter la canule aortique, utilisez une seringue à bout émoussé de 18 G remplie d’un tampon KH pour évacuer l’air de la canule. Connectez d’abord la canule aortique, ouvrez la pince de tubulure du côté de Langendorff et assurez-vous que la pince de tubulure de postcharge est ouverte.
5. Rebranchez la canule auriculaire gauche, en vous assurant que l’air a été évacué de la canule avant de la connecter au circuit de perfusion. Gardez la pince côté travail fermée jusqu’à ce qu’il soit temps de passer du mode Langendorff au mode de travail.
6. Perfuser le cœur en mode Langendorff pendant 15 min. Assurez-vous de commencer à enregistrer les données au début de la reperfusion de Langendorff.
7. Avant de passer en mode de travail, placez les deux pierres bouillonnantes dans le tampon KH, ouvrez le robinet à 3 voies du côté de travail et transférez le tube de retour commun dans le réservoir de travail.
8. Fermez la pince Langendorff blanche, ouvrez la pince blanche du côté ouvrant et perfuser le cœur pendant 30 min. Mesurer et recueillir les effluents coronaires à des moments précis pour l’analyse en aval (p. ex., marqueurs de lésions cardiaques). Assurez-vous d’arrêter-redémarrer l’enregistrement du logiciel pour démarrer un nouveau segment (ou alternativement, ajoutez un commentaire).
9. À environ 15 minutes de reperfusion en mode de travail, fermez le robinet à trois voies.
10. À la fin de la reperfusion, enregistrez le fichier de données, arrêtez le flux dans le circuit et déconnectez le bloc cardiaque. Prélever des échantillons du ventricule gauche pour un traitement histologique et/ou les congeler pour des études ultérieures (p. ex., extraction de protéines pour les études par transfert Western).
11. Retirez les filtres des porte-filtres, vidangez le tampon du circuit et rincez deux fois avec 5 L d’eau distillée.
    REMARQUE : Bien que cela ne soit pas nécessaire, il est utile de préchauffer l’eau distillée dans un grand récipient à l’intérieur du bain-marie.

8. Analyse de la récupération fonctionnelle

1. Ouvrez le fichier LabChart.
2. Mettez en surbrillance une zone d’enregistrement d’au moins 30 s, puis cliquez sur Commande > Ajouter une sélection de données OU Ajouter plusieurs fois aux données. Cela ajoutera les paramètres souhaités à un fichier DataPad dans le logiciel.
3. Sélectionnez le menu déroulant Fenêtre > DataPad.
4. Mettez en surbrillance et copiez les valeurs de récupération du DataPad dans une feuille de calcul pour l’analyse de la récupération fonctionnelle. Calculer la récupération fonctionnelle en pourcentage de sa valeur de référence respective ^1,6,7.

Résultats

Les résultats de la perfusion de base détermineront si l’expérience initiale (pré-stockage) a été couronnée de succès. Le débit aortique affiché en mode Langendorff doit être compris entre 14 et 22 mL/min. Le débit de Langendorff est affiché sous la forme d’une valeur négative sur le débitmètre en raison de la perfusion rétrograde de l’aorte. La figure 4A montre un exemple de trace de Langendorff acceptable.

Discussion

Étant donné la nature sensible de la fonction cardiaque de base, des précautions doivent être prises pour maintenir le dispositif de perfusion propre et avec des composants compatibles. Par exemple, il faut utiliser le bon tube en PVC. Certains matériaux de tubulaire, tels que le silicone, peuvent contribuer à réduire le flux aortique et la contractilité, ce qui peut être dû à une perte d’oxygène via le tube. Bien qu’il existe des circuits de perfusion cardiaque de rat fo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit	ADInstruments	MLT1199	Data Acquisition
Bridge Amp	ADInstruments	FE221	Data Acquisition
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 thermometer	Hanna Instruments	HI98509	Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12	Thomas Scientific	2848Y40	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.	Thomas Scientific	8847T08	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.	Thomas Scientific	8847T02	Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure	Coherent Scientific	14121	Surgical Equipment
Closed Connector	Thomas Scientific	8847E25	Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24	Specialist Medical Supplies	S195	Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	To make Krebs Buffer
Dual Channel Console	ADInstruments	TS402	Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD	Coherent Scientific	14114	Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated	Met-App Australia Pty Ltd	1352	Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)	Thermoline Scientific	TU3	Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter	Thomas Scientific	8847V08	Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor	John Morris	1015164	Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved	Coherent Scientific	WPI-501748	Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight	Coherent Scientific	WPI-501252	Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS	John Morris	1014414	Mounting screws for pump heads
Open-sided connector	Thomas Scientific	8847E05	Rig Construction
Paraformadehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g	VWR Chemicals	26764.26	To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software	ADInstruments	ML826	Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK	Merck Millipore	SX0004701	Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK	Merck Millipore	XX1104707	Rig Construction
Single Buret Clamp	Thomas Scientific	8847T32	Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler)	Sigma-aldrich	59277	Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector	Thomas Scientific	8847E35	Rig Construction
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm	Merck Millipore	SX0004700	Rig Construction
syringes 1 mL box/100	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm	Met-App Australia Pty Ltd	1356	Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410	ADInstruments	TS410	Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades	Coherent Scientific	WPI-500-086	Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray	Thermoline Scientific	TLWB-30	Rig Construction