Uso de un modelo aislado de corazón de rata funcional para probar estrategias de preservación del corazón de un donante

Resumen

Describimos un protocolo de corazón de rata aislado ex vivo para probar estrategias de preservación del corazón de donantes. En este trabajo se describe el protocolo para su uso en el almacenamiento estático en frío de corazones de donantes de roedores; Sin embargo, el protocolo también se puede utilizar para corazones de donantes obtenidos después de la donación después de la muerte circulatoria y la muerte encefálica.

Resumen

La optimización de las soluciones de preservación del corazón de los donantes ha desempeñado un papel clave en la reducción de las lesiones por isquemia-reperfusión en los corazones de los donantes durante la extracción, el transporte y el trasplante de órganos. Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron que la adición de trinitrato de glicerilo y eritropoyetina a las soluciones de preservación cardíaca de donantes podría mejorar significativamente la recuperación funcional cardíaca después de un almacenamiento prolongado en frío y en la donación después de la muerte circulatoria de los corazones. Este protocolo de suplementación se ha implementado en uso clínico en unidades de trasplante de Australia, Bélgica y el Reino Unido. Aquí, describimos un protocolo para probar estrategias de suplementación utilizando un circuito de perfusión de corazón de rata de trabajo aislado ex vivo (IWRH). Con esta metodología, las estrategias de suplementación se pueden probar en el contexto del almacenamiento estático prolongado en frío, la donación después de la muerte encefálica y la donación después de la muerte circulatoria de la preservación del corazón del donante. La recuperación funcional cardíaca, medida por el flujo aórtico, el flujo coronario, el gasto cardíaco, la presión del pulso y la frecuencia cardíaca, se puede utilizar para determinar si una estrategia de preservación particular puede minimizar la lesión por isquemia-reperfusión del corazón del donante.

Introducción

El éxito de un trasplante de corazón puede verse influenciado en gran medida por el método de preservación utilizado para el corazón del donante. Los corazones de los donantes son sometidos a lesiones isquémicas durante todo el proceso de extracción, transporte y trasplante de órganos. El grado de daño isquémico en el órgano del donante puede mitigarse mediante la selección de una estrategia adecuada de preservación del corazón del donante. El almacenamiento estático en frío (CSS) sigue siendo el método más factible y común para la preservación del corazón del donante; sin embargo, es posible que CSS no sea necesariamente la mejor opc....

Protocolo

Todos los animales recibieron atención humanitaria de acuerdo con las directrices del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (Australia). Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto Garvan de Investigación Médica (Sydney, Australia).

1. Preparación del tampón Krebs-Henseleit (KH)

1. Prepare 2 L de una solución madre 20x de tampón KH que contenga 2,36 M de NaCl, 0,094 M de KCl, 0,024 M de MgSO₄, 0,024 M de KH₂PO₄. Aliquotar en tubos de 50 mL y almacenar a -20 °C.
2. Antes del exper....

Discusión

Dada la naturaleza sensible de la función basal del corazón, se debe tener cuidado de mantener el equipo de perfusión limpio y con componentes compatibles. Por ejemplo, se debe utilizar el tubo de PVC correcto. Algunos materiales de los tubos, como la silicona, pueden contribuir a reducir el flujo aórtico y la contractilidad, lo que puede deberse a la pérdida de oxígeno a través del tubo. Si bien existen circuitos aislados de perfusión cardíaca de rata disponibles comercialmente.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit	ADInstruments	MLT1199	Data Acquisition
Bridge Amp	ADInstruments	FE221	Data Acquisition
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 thermometer	Hanna Instruments	HI98509	Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12	Thomas Scientific	2848Y40	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.	Thomas Scientific	8847T08	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.	Thomas Scientific	8847T02	Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure	Coherent Scientific	14121	Surgical Equipment
Closed Connector	Thomas Scientific	8847E25	Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24	Specialist Medical Supplies	S195	Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	To make Krebs Buffer
Dual Channel Console	ADInstruments	TS402	Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD	Coherent Scientific	14114	Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated	Met-App Australia Pty Ltd	1352	Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)	Thermoline Scientific	TU3	Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter	Thomas Scientific	8847V08	Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor	John Morris	1015164	Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved	Coherent Scientific	WPI-501748	Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight	Coherent Scientific	WPI-501252	Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS	John Morris	1014414	Mounting screws for pump heads
Open-sided connector	Thomas Scientific	8847E05	Rig Construction
Paraformadehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g	VWR Chemicals	26764.26	To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software	ADInstruments	ML826	Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK	Merck Millipore	SX0004701	Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK	Merck Millipore	XX1104707	Rig Construction
Single Buret Clamp	Thomas Scientific	8847T32	Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler)	Sigma-aldrich	59277	Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector	Thomas Scientific	8847E35	Rig Construction
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm	Merck Millipore	SX0004700	Rig Construction
syringes 1 mL box/100	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm	Met-App Australia Pty Ltd	1356	Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410	ADInstruments	TS410	Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades	Coherent Scientific	WPI-500-086	Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray	Thermoline Scientific	TLWB-30	Rig Construction