Uso de un modelo aislado de corazón de rata funcional para probar estrategias de preservación del corazón de un donante

Resumen

Describimos un protocolo de corazón de rata aislado ex vivo para probar estrategias de preservación del corazón de donantes. En este trabajo se describe el protocolo para su uso en el almacenamiento estático en frío de corazones de donantes de roedores; Sin embargo, el protocolo también se puede utilizar para corazones de donantes obtenidos después de la donación después de la muerte circulatoria y la muerte encefálica.

Resumen

La optimización de las soluciones de preservación del corazón de los donantes ha desempeñado un papel clave en la reducción de las lesiones por isquemia-reperfusión en los corazones de los donantes durante la extracción, el transporte y el trasplante de órganos. Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron que la adición de trinitrato de glicerilo y eritropoyetina a las soluciones de preservación cardíaca de donantes podría mejorar significativamente la recuperación funcional cardíaca después de un almacenamiento prolongado en frío y en la donación después de la muerte circulatoria de los corazones. Este protocolo de suplementación se ha implementado en uso clínico en unidades de trasplante de Australia, Bélgica y el Reino Unido. Aquí, describimos un protocolo para probar estrategias de suplementación utilizando un circuito de perfusión de corazón de rata de trabajo aislado ex vivo (IWRH). Con esta metodología, las estrategias de suplementación se pueden probar en el contexto del almacenamiento estático prolongado en frío, la donación después de la muerte encefálica y la donación después de la muerte circulatoria de la preservación del corazón del donante. La recuperación funcional cardíaca, medida por el flujo aórtico, el flujo coronario, el gasto cardíaco, la presión del pulso y la frecuencia cardíaca, se puede utilizar para determinar si una estrategia de preservación particular puede minimizar la lesión por isquemia-reperfusión del corazón del donante.

Introducción

El éxito de un trasplante de corazón puede verse influenciado en gran medida por el método de preservación utilizado para el corazón del donante. Los corazones de los donantes son sometidos a lesiones isquémicas durante todo el proceso de extracción, transporte y trasplante de órganos. El grado de daño isquémico en el órgano del donante puede mitigarse mediante la selección de una estrategia adecuada de preservación del corazón del donante. El almacenamiento estático en frío (CSS) sigue siendo el método más factible y común para la preservación del corazón del donante; sin embargo, es posible que CSS no sea necesariamente la mejor opción para todas las vías de donación de corazón. Por ejemplo, los corazones obtenidos a través de la vía de donación después de la muerte circulatoria (DCD) se mantienen y se evalúa su viabilidad utilizando la perfusión normotérmica en máquina, mientras que los corazones obtenidos a través de la vía de donación después de la muerte encefálica (DBD) se pueden preservar utilizando CSS o perfusión con máquina hipotérmica. Otro factor determinante importante para la estrategia de preservación utilizada es la cantidad de isquemia caliente (para la DCD) o isquemia fría (para la DBD) a la que se somete el corazón durante la obtención y el transporte del órgano.

Muchos centros utilizan suplementos farmacológicos adicionales de la solución de preservación cardíaca para aumentar la tolerancia isquémica y mejorar la función cardíaca después del trasplante. Los estudios en roedores de nuestro laboratorio demostraron que la suplementación de la cardioplejia con eritropoyetina y trinitrato de glicerilo fue capaz de mejorar significativamente la recuperación funcional cardíaca después de un almacenamiento prolongado en frío del corazón del donante ^1,2. Estos estudios luego progresaron a estudios porcinos de preservación del corazón de donantes y proporcionaron la base preclínica que condujo a la incorporación de eritropoyetina y trinitrato de glicerilo en la solución de cardioplejia de corazones obtenidos a través de una vía DCD utilizando perfusión con máquina normotérmica ^3,4,5. En la actualidad, la suplementación con eritropoyetina y trinitrato de glicerilo también se utiliza en las unidades de trasplante australianas para las recuperaciones cardíacas clínicas de DBD que incorporan CSS. El objetivo general del protocolo de perfusión de corazón de rata trabajador aislado (IWRH, por sus siglas en inglés) que se describe a continuación es probar las estrategias de preservación del corazón del donante en un entorno de laboratorio y probar su eficacia para preservar la función cardíaca del donante después de la reperfusión. El protocolo de corazón de rata de trabajo aislado descrito se ha utilizado durante más de dos décadas en nuestro laboratorio y ha demostrado ser extremadamente útil en la detección de posibles suplementos y/o estrategias que pueden mejorar la preservación del corazón del donante 2,7,8,9.

Protocolo

Todos los animales recibieron atención humanitaria de acuerdo con las directrices del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (Australia). Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto Garvan de Investigación Médica (Sydney, Australia).

1. Preparación del tampón Krebs-Henseleit (KH)

1. Prepare 2 L de una solución madre 20x de tampón KH que contenga 2,36 M de NaCl, 0,094 M de KCl, 0,024 M de MgSO₄, 0,024 M de KH₂PO₄. Aliquotar en tubos de 50 mL y almacenar a -20 °C.
2. Antes del experimento, prepare dos matraces Erlenmyer de 2 L de 1x tampón KH que contenga 1900 mL de agua desionizada, 100 mL de 20x tampón KH de stock, 4,20 g de NaHCO₃ (25 mM) y 3,96 g de glucosa (11 mM).
   1. Coloque los matraces tampón en un baño de agua a 37 °C y gasifique la solución con carbógeno (95% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono, caudal ajustado a 2 L/min) a través de piedras difusoras (filtro de entrada deslizante) durante 5 min, luego agregue 2,8 mL de 1 M CaCl₂ (1,4 mM). Continúe burbujeando la solución durante al menos 1 hora antes del inicio del experimento. El uso de una piedra difusora ayuda a una aireación uniforme del tampón.
   2. Coloque un pequeño volumen (~50 mL) de tampón en un plato redondo de metal a -20 °C para enfriar y formar una capa de tampón helado.

2. Preparación del circuito de perfusión

1. Asegúrese de que todos los tubos y cristalería estén limpios y sin crecimiento o contaminación visibles.
2. Ajuste las alturas de las cámaras de vidrio para que correspondan a las presiones de perfusión requeridas basadas en 1 cm H₂O que sean equivalentes a 1,36 mmHg: Langendorff al corazón 100 cm (aproximadamente 75 mmHg), trabajo de precarga de lado al corazón 15 cm (aproximadamente 11 mmHg), cámara del corazón a la poscarga 100 cm (aproximadamente 75 mmHg).
3. Inicie la circulación de agua caliente alrededor del circuito al menos 10 minutos antes de la perfusión cardíaca.
4. Coloque los filtros de microfibra (1,2 μm) en los portafiltros y asegúrelos firmemente.
5. Prepare el circuito con tampón KH, asegurándose de que se elimine todo el aire, y use una abrazadera de tubería de control de flujo para ajustar el flujo en el lado de Langendorff (Figura 1A, B) a ~ 50 mL / min. El flujo más lento facilita la canulación aórtica y evita que el corazón se desplace antes de la ligadura. Coloque un termómetro dentro del circuito a través de un conector de tubo en forma de T para controlar la temperatura del tampón a ~37 °C.

3. Configuración del software Lab Chart (análisis de datos)

1. Asegúrese de que Powerlab (sistema de adquisición de datos) y el caudalímetro estén encendidos y conectados a la computadora antes de abrir el software de análisis de datos.
2. Abra un nuevo archivo.
3. Configure la recopilación de datos seleccionando el menú desplegable Configuración y seleccionando Configuración del canal. Seleccione para presión aórtica, flujo aórtico y frecuencia cardíaca (Figura 2A).
4. Configure cada canal con la configuración que se muestra en la Figura 2B.

4. Preparación del animal para el aislamiento del corazón de rata

NOTA: A continuación se describe la metodología para el aislamiento y la perfusión del corazón de rata para el almacenamiento estático en frío y sin DBD. Los métodos para la instrumentación del corazón en el circuito de perfusión son relativamente similares, independientemente del método de donación que se utilice. Las diferencias en el protocolo para la donación de corazón de rata DBD y DCD ocurren principalmente desde el momento en que la anestesia animal ha hecho efecto hasta el momento en que se extirpa el corazón del animal.

1. Pesar al animal, asegurándose de que su peso sea de >330 g. El rango de peso ideal para ratas macho es de 330-420 g.
2. Administrar una inyección intraperitoneal de ketamina (80 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg). Asegurar un plano quirúrgico adecuado de anestesia basado en la ausencia de un reflejo de pedal (reflejo de pellizco de los pies) y reflejo de parpadeo.
3. Coloque al animal en posición supina, asegurando las extremidades con cinta adhesiva. Administre oxígeno al animal a través de un cono nasal.
4. Tenga el contenedor metálico de aguanieve tampón KH y un pequeño recipiente metálico con hielo en la estación de disección. Remoja una gasa de 7,5 cm x 7,5 cm en un tampón KH y colócala en el recipiente con hielo.
5. Una vez que se confirma el plano quirúrgico adecuado de anestesia, raspe la piel en el sitio de la incisión quirúrgica y limpie la piel con aséptico como betadine o alcohol al 70%. Haga una incisión lateral a través del abdomen (laparotomía) y mueva el estómago y los intestinos hacia un lado para permitir el acceso a la vena renal izquierda. Inyecte 1500 UI de heparina y aplique presión en el lugar de la inyección hasta que se detenga el sangrado. Espere de 1 a 2 minutos para que la heparina circule antes de continuar con la extracción del corazón.
6. Abra la cavidad torácica cortando a través de la caja torácica a cada lado y cortando a través del diafragma. Sostenga y levante con cuidado el bloque corazón-pulmón mientras corta a lo largo de la aorta descendente, asegurándose de que el arco aórtico permanezca intacto. Esto permitirá que quede suficiente longitud de aorta para la canulación.
7. La rata es sacrificada mediante la extirpación del corazón y los pulmones mientras está bajo anestesia. Sumerja el bloque corazón-pulmón en el aguanieve de hielo amortiguador KH para permitir que el corazón se detenga.

5. Canulación del corazón en el circuito de perfusión cardíaca de funcionamiento aislado

1. Transfiera el bloque corazón-pulmón a una gasa con hielo. Diseccione el exceso de grasa alrededor de la aorta, recorte la aorta para dejar una longitud de 3-5 mm para la canulación y haga una pequeña incisión de ~ 1-2 mm en la arteria pulmonar. Esto permitirá un camino para el efluente coronario.
2. Coloque el bloque corazón-pulmón recortado (mientras aún está en hielo) directamente debajo de las cánulas. Ajuste el flujo desde el lado de Langendorff utilizando una pinza de tubo de control de flujo para facilitar la canulación aórtica. Cánula cuidadosamente la aorta en la cánula izquierda, sujétala con una pinza negra y átala con una sutura de seda 2-0.
3. Aumente el caudal de la perfusión de Langendorff abriendo completamente la abrazadera del tubo de control de flujo. Abra la abrazadera de poscarga. Asegúrese de que haya un flujo continuo desde la cámara de Langendorff. Comience a monitorear la actividad cardíaca con software.
   NOTA: si el valor del flujo aórtico en la pantalla del caudalímetro es de <10 mL/min, asegúrese de que la arteriotomía pulmonar tenga un tamaño suficiente. Un traza/valor de flujo aórtico bajo también podría indicar que la cánula aórtica se ha insertado demasiado.
4. Ajuste el bloque corazón-pulmón de modo que la superficie anterior de los pulmones quede orientada hacia el operador. Ate el lóbulo pulmonar izquierdo con una sutura de seda 2-0 y corte el exceso de tejido pulmonar izquierdo. Ate los lóbulos pulmonares restantes en un solo barrido con una sutura de seda 2-0 y corte el tejido. Gire el corazón de modo que los pulmones atados estén hacia atrás.
5. Con unas tijeras Vannas pequeñas, corte un borde de 2-3 mm del apéndice auricular izquierdo, asegurándose de que se logre una pequeña abertura en las aurículas. Cánula cuidadosamente el apéndice auricular izquierdo a la cánula izquierda, sujételo con una pinza negra y átelo con una sutura de seda 2-0. La figura 3A muestra la ubicación de ambas cánulas.
6. Ajuste la camisa de agua de la cámara cardíaca de modo que el corazón quede dentro del centro de la cámara.
7. Abra el transductor de presión al aire y ponga a cero el transductor de presión en el software seleccionando el menú desplegable Presión aórtica > Bridge Amp > Zero. Haga clic en Aceptar.
8. Perfunde el corazón en modo Langendorff durante 10 min. Asegúrese de que el flujo aórtico de Langendoff mida entre 10 y 20 mL/min (lo ideal es 20 mL/min).
9. Antes de cambiar el modo de trabajo, asegúrese de que la piedra difusora (filtro de entrada deslizante) del depósito tampón KH de Langendorff esté colocada en el depósito tampón KH en funcionamiento.
10. Ponga el corazón en modo de funcionamiento cerrando la pinza grande que conduce a la cánula aórtica y abriendo el flujo que conduce al apéndice auricular izquierdo. Grifo abierto de tres vías que conduce desde la perfusión de trabajo. Transfiera el tubo de retorno común (llevando el tampón KH de vuelta al depósito) desde el depósito de Langendorff hasta el depósito de trabajo.
11. Perfunde el corazón en modo de trabajo durante 15 min. Lo ideal es que los valores de flujo aórtico sean de >30 mL/min al final de la perfusión de 15 min. Una vez que el corazón se haya estabilizado, comience a registrar datos en un software de análisis de datos.
12. Mida el efluente coronario (flujo coronario) a 1 min, 5 min, 10 min y 15 min.
    NOTA: Los valores de flujo coronario deben estar entre 10-20 mL/min. El flujo coronario superior a 22 mL/min generalmente indica una fuga que se origina en un vaso pulmonar desligado. La frecuencia cardíaca debe estar entre 200 y 300 lpm. El efluente coronario se puede recolectar para el análisis posterior de marcadores de lesión tisular (p. ej., troponina-I, liberación de lactato deshidrogenasa).

6. Administración de cardioplejia para el almacenamiento estático en frío del corazón

1. Llene la cámara de cardioplejia (colocada a una altura de 60 cm para producir una presión de perfusión de aproximadamente 40 mmHg) con 50 mL de solución de preservación cardíaca designada (con o sin suplementación).
2. Baje la camisa de agua y cierre el grifo de tres vías en el lado del modo de trabajo.
3. Detenga el flujo hacia la cánula auricular izquierda cerrando la pinza.
4. Abrir el flujo a la cánula aórtica.
5. Cierre la abrazadera desde el lado de Langendoff y en la carga posterior.
6. Abra la pinza desde la línea de cardioplejia y enjuague 15 ml de cardioplejia de la línea de presión. Cierre el grifo en la línea de presión.
7. Permitir que el corazón se lave con cardioplejia a través de la cánula aórtica y recoger el efluente coronario. Ejecute cardioplejia durante 3 minutos y registre el volumen de cardioplejia administrada.
8. Detenga la grabación de datos en el software y guarde el archivo.
9. Después de 3 minutos, cierre la pinza para cardioplejia y la pequeña pinza azul que conduce a la cánula aórtica.
10. Coloque una pinza de bulldog en la cánula aórtica y una segunda pinza de bulldog en la cánula izquierda. Desconecte el bloque de cánula cardíaca del circuito y colóquelo en un vaso de precipitados que contenga cardioplejia en una caja de hielo (Figura 3B, C).
11. Guarde el corazón en la nevera durante 6 h (o el tiempo de almacenamiento en frío deseado).

7. Reperfusión cardíaca después del almacenamiento estático en frío

1. Prepare el tampón KH según la sección 1.
2. Cebe el circuito de perfusión como se indica en la sección 2.
3. Abra el archivo guardado desde la perfusión de línea base.
4. Retire con cuidado el bloque de cánula cardíaca de la caja de hielo y asegúrelo al circuito de perfusión. Antes de volver a conectar la cánula aórtica, use una jeringa de 18 G de extremo romo llena de tampón KH para eliminar el aire de la cánula. Conecte primero la cánula aórtica, abra la pinza de tubo en el lado de Langendorff y asegúrese de que la pinza de tubo de poscarga esté abierta.
5. Vuelva a conectar la cánula auricular izquierda, asegurándose de que se haya eliminado el aire de la cánula antes de conectarla al circuito de perfusión. Mantenga la abrazadera del lado de trabajo cerrada hasta que sea el momento de cambiar del modo de trabajo de Langendorff.
6. Perfunde el corazón en modo Langendorff durante 15 min. Asegúrese de iniciar el registro de datos al inicio de la reperfusión de Langendorff.
7. Antes de cambiar al modo de trabajo, coloque ambas piedras burbujeantes en el tampón KH, abra el grifo de 3 vías en el lado de trabajo y transfiera el tubo de retorno común al depósito de trabajo.
8. Cierre la pinza Langendorff blanca, abra la pinza blanca del lado de trabajo y perfunda el corazón durante 30 min. Mida y recoja el efluente coronario en puntos de tiempo designados para el análisis posterior (p. ej., marcadores de lesiones cardíacas). Asegúrese de detener y reiniciar la grabación de software para iniciar un nuevo segmento (o, alternativamente, agregue un comentario).
9. Aproximadamente a los 15 minutos del modo de trabajo de reperfusión, cierre el grifo de tres vías.
10. Al final de la reperfusión, guarde el archivo de datos, detenga el flujo a través del circuito y desconecte el bloqueo cardíaco. Recolectar muestras del ventrículo izquierdo para el procesamiento histológico y/o congelarlas para estudios futuros (p. ej., extracción de proteínas para estudios de Western blot).
11. Retire los filtros de los portafiltros, drene el tampón del circuito y enjuague dos veces con 5 L de agua destilada.
    NOTA: Aunque no es necesario, ayuda precalentar el agua destilada en un recipiente grande dentro del baño de agua.

8. Análisis de la recuperación funcional

1. Abra el archivo LabChart.
2. Resalte una región de al menos 30 s de grabación y, a continuación, haga clic en Comando > Agregar selección de datos O Agregar varias veces a los datos. Esto agregará los parámetros deseados a un archivo DataPad dentro del software.
3. Seleccione el menú desplegable Ventana > DataPad.
4. Resalte y copie los valores de recuperación del DataPad en una hoja de cálculo para el análisis de recuperación funcional. Calcule la recuperación funcional como un porcentaje de su respectivo valor de referencia ^1,6,7.

Resultados

Los resultados de la perfusión basal determinarán si el experimento inicial (prealmacenamiento) fue exitoso. El flujo aórtico mostrado durante el modo de Langendorff debe estar entre 14 y 22 mL/min. El flujo de Langendorff se muestra como un valor negativo en el caudalímetro debido a la perfusión retrógrada de la aorta. En la Figura 4A se muestra un ejemplo de una traza de Langendorff aceptable.

Una vez que se cambia al modo...

Discusión

Dada la naturaleza sensible de la función basal del corazón, se debe tener cuidado de mantener el equipo de perfusión limpio y con componentes compatibles. Por ejemplo, se debe utilizar el tubo de PVC correcto. Algunos materiales de los tubos, como la silicona, pueden contribuir a reducir el flujo aórtico y la contractilidad, lo que puede deberse a la pérdida de oxígeno a través del tubo. Si bien existen circuitos aislados de perfusión cardíaca de rata disponibles comercialmente...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit	ADInstruments	MLT1199	Data Acquisition
Bridge Amp	ADInstruments	FE221	Data Acquisition
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 thermometer	Hanna Instruments	HI98509	Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12	Thomas Scientific	2848Y40	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.	Thomas Scientific	8847T08	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.	Thomas Scientific	8847T02	Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure	Coherent Scientific	14121	Surgical Equipment
Closed Connector	Thomas Scientific	8847E25	Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24	Specialist Medical Supplies	S195	Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	To make Krebs Buffer
Dual Channel Console	ADInstruments	TS402	Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD	Coherent Scientific	14114	Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated	Met-App Australia Pty Ltd	1352	Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)	Thermoline Scientific	TU3	Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter	Thomas Scientific	8847V08	Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor	John Morris	1015164	Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved	Coherent Scientific	WPI-501748	Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight	Coherent Scientific	WPI-501252	Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS	John Morris	1014414	Mounting screws for pump heads
Open-sided connector	Thomas Scientific	8847E05	Rig Construction
Paraformadehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g	VWR Chemicals	26764.26	To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software	ADInstruments	ML826	Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK	Merck Millipore	SX0004701	Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK	Merck Millipore	XX1104707	Rig Construction
Single Buret Clamp	Thomas Scientific	8847T32	Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler)	Sigma-aldrich	59277	Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector	Thomas Scientific	8847E35	Rig Construction
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm	Merck Millipore	SX0004700	Rig Construction
syringes 1 mL box/100	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm	Met-App Australia Pty Ltd	1356	Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410	ADInstruments	TS410	Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades	Coherent Scientific	WPI-500-086	Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray	Thermoline Scientific	TLWB-30	Rig Construction