Использование изолированной модели рабочего сердца крысы для тестирования стратегий сохранения донорского сердца

Резюме

Мы описываем протокол ex vivo изолированного рабочего сердца крысы для тестирования стратегий сохранения сердца донора. В данной статье описан протокол использования в статическом холодильном хранении донорских сердец грызунов; Тем не менее, протокол также может быть использован для донорских сердец, полученных после донорства после смерти кровообращения и мозга.

Аннотация

Оптимизация решений по сохранению донорского сердца сыграла ключевую роль в снижении ишемии-реперфузионного повреждения в сердцах доноров во время извлечения, транспортировки и трансплантации органов. Предыдущая работа нашей лаборатории показала, что добавление глицерилтринитрата и эритропоэтина в решения для сохранения сердца донора может значительно улучшить функциональное восстановление сердца после длительного хранения в холоде и при донорстве после сердечно-сосудистой смерти. Этот протокол приема добавок был внедрен в клиническую практику в трансплантационных отделениях в Австралии, Бельгии и Великобритании. В этой статье мы описываем протокол тестирования стратегий приема добавок с использованием изолированного контура перфузии рабочего сердца крысы (IWRH) ex vivo . Используя эту методологию, стратегии приема добавок могут быть протестированы в контексте длительного хранения статического электричества на холоде, донорства после смерти мозга и донорского сердца после сердечной смерти. Функциональное восстановление сердца, измеряемое аортальным потоком, коронарным кровотоком, сердечным выбросом, пульсовым давлением и частотой сердечных сокращений, может быть использовано для определения того, может ли конкретная стратегия сохранения свести к минимуму ишемическое реперфузионное повреждение донорского сердца.

Введение

На успех пересадки сердца в значительной степени может повлиять метод консервации, используемый для донорского сердца. Донорские сердца подвергаются ишемическим повреждениям на протяжении всего процесса извлечения, транспортировки и трансплантации органов. Степень ишемического повреждения донорского органа может быть снижена путем выбора подходящей стратегии сохранения донорского сердца. Холодное статическое хранение (CSS) остается наиболее целесообразным и распространенным методом сохранения сердца донора; однако CSS не обязательно может быть лучшим вариантом для всех путей донорства сердца. Например, сердца, полученные по пути донорства после смерти от кровообращения (DCD), поддерживаются и оцениваются на жизнеспособность с помощью нормотермической машинной перфузии, в то время как сердца, полученные по пути донорства после смерти мозга (DBD), могут быть сохранены с помощью CSS или гипотермической машинной перфузии. Другим важным фактором, определяющим используемую стратегию сохранения, является количество теплой ишемии (при ДКБ) или холодной ишемии (при ДБД), которым подвергается сердце во время забора и транспортировки органов.

Многие центры используют дополнительные фармакологические добавки раствора для сохранения сердца для повышения толерантности к ишемии и улучшения функции сердца после трансплантации. Исследования на грызунах, проведенные в нашей лаборатории, показали, что добавки кардиоплегии эритропоэтином и глицерилтринитратом способны значительно улучшить функциональное восстановление сердца после длительного хранения донорского сердца^в холоде ^1,2. Эти исследования затем перешли в исследования сохранения донорского сердца на свиньях и обеспечили доклиническую основу, которая привела к включению эритропоэтина и глицерилтринитрата в раствор кардиоплегии сердца, полученный через DCD-путь с использованием нормотермической машинной перфузии ^3,4,5. В настоящее время добавки эритропоэтина и глицерилтринитрата также используются в австралийских трансплантационных отделениях для клинического извлечения сердца DBD с использованием CSS. Общая цель протокола перфузии изолированного рабочего сердца крысы (IWRH), описанного ниже, заключается в том, чтобы проверить стратегии сохранения донорского сердца в лабораторных условиях и проверить их эффективность для сохранения функции донорского сердца после реперфузии. Описанный протокол изолированного рабочего сердца крысы использовался в течение более двух десятилетий в нашей лаборатории и оказался чрезвычайно полезным для скрининга потенциальных добавок и/или стратегий, которые могут улучшить сохранение донорского сердца 2,7,8,9.

протокол

Все животные получили гуманный уход в соответствии с рекомендациями Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (Австралия). Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике животных Института медицинских исследований Гарвана (Сидней, Австралия).

1. Приготовление буфера Krebs-Henseleit (KH)

1. Приготовьте 2 л 20-кратного стокового раствора буфера KH, содержащего 2,36 М NaCl, 0,094 М KCl, 0,024 М MgSO₄, 0,024 М KH₂PO₄. Аликвот в пробирки объемом 50 мл и хранить при температуре -20 °C.
2. Перед началом эксперимента приготовьте две колбы Эрленмайера объемом 2 л 1x KH буфера, содержащего 1900 мл деионизированной воды, 100 мл 20x стокового буфера KH, 4,20 г NaHCO₃ (25 мМ) и 3,96 г глюкозы (11 мМ).
   1. Поместите буферные колбы в водяную баню при температуре 37 °C и отравите раствор карбогеном (95% кислорода, 5% углекислого газа, расход 2 л/мин) с помощью воздушных камней (входной фильтр) в течение 5 минут, затем добавьте 2,8 мл 1 М CaCl₂ (1,4 мМ). Продолжайте барботирование раствора в течение как минимум 1 ч до начала эксперимента. Использование воздушного камня способствует равномерной аэрации буфера.
   2. Поместите небольшой объем (~50 мл) буфера в круглую металлическую посуду при температуре -20 °C, чтобы он охладился и образовал слой ледяного буфера.

2. Подготовка контура перфузии

1. Убедитесь, что все трубки и стеклянная посуда чистые, без видимого роста / загрязнения.
2. Установите высоту стеклянных камер в соответствии с требуемым перфузионным давлением из расчета 1 см_Н2О, что эквивалентно 1,36 мм рт.ст.: Лангендорф к сердцу 100 см (приблизительно 75 мм рт.ст.), рабочая сторона к сердцу с предварительной нагрузкой 15 см (приблизительно 11 мм рт.ст.), камера от сердца до вспомогательной нагрузки 100 см (приблизительно 75 мм рт.ст.).
3. Начните циркуляцию горячей воды вокруг контура не менее чем за 10 минут до перфузии сердца.
4. Поместите фильтры из микрофибры (1,2 мкм) в держатели фильтров и плотно зафиксируйте их.
5. Загрунтуйте контур буфером KH, убедившись, что весь воздух удален, и используйте зажим для трубки с регулированием потока для регулировки потока для регулировки расхода со стороны Лангендорфа (рис. 1A, B) до ~50 мл/мин. Более медленный поток облегчает канюляцию аорты и предотвращает смещение сердца перед перевязкой. Поместите термометр в контур с помощью Т-образного трубочного соединителя, чтобы контролировать температуру буфера на уровне ~37 °C.

3. Настройка программного обеспечения Lab Chart (анализ данных)

1. Перед открытием программного обеспечения для анализа данных убедитесь, что Powerlab (система сбора данных) и расходомер включены и подключены к компьютеру.
2. Откройте новый файл.
3. Настройте сбор данных, выбрав раскрывающееся меню Настройки и выбрав Настройки канала. Выберите давление в аорте, поток в аорте и частоту сердечных сокращений (рисунок 2A).
4. Настройте каждый канал в соответствии с настройками, показанными на рисунке 2B.

4. Подготовка животного к изоляции сердца крысы

ПРИМЕЧАНИЕ: Методология изоляции и перфузии сердца крысы для сердец без DBD и без DCD для холодного статического хранения изложена ниже. Методы включения сердца в контур перфузии относительно схожи независимо от того, какой метод донорства используется. Различия в протоколе донорства сердца крыс с помощью DBD и DCD в первую очередь проявляются с момента начала действия анестезии на животном до момента удаления сердца у животного.

1. Взвесьте животное, следя за тем, чтобы его вес составлял >330 г. Идеальный диапазон веса для самцов крыс составляет 330-420 г.
2. Введите внутрибрюшинную инъекцию кетамина (80 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Обеспечить адекватную хирургическую плоскость анестезии на основе отсутствия педального рефлекса (рефлекса пальцев ног) и рефлекса моргания глаз.
3. Расположите животное в лежачем положении, закрепив конечности скотчем. Подавайте кислород животному через носовой конус.
4. Имейте буферный металлический контейнер для льда и слякоти KH и небольшой металлический контейнер со льдом на станции вскрытия. Смочите марлю размером 7,5 см х 7,5 см в буфере КН и положите ее на емкость со льдом.
5. Как только будет подтверждена адекватная хирургическая плоскость анестезии, побрейте кожу в месте хирургического разреза и очистите кожу асептическими средствами, такими как бетадин или 70% спирт. Сделайте боковой разрез поперек брюшной полости (лапаротомия) и сдвиньте желудок и кишечник в сторону, чтобы обеспечить доступ к левой почечной вене. Введите 1500 МЕ гепарина и надавите на место инъекции до тех пор, пока кровотечение не остановится. Подождите 1-2 минуты для циркуляции гепарина, прежде чем продолжить забор сердца.
6. Откройте грудную полость, разрезав грудную клетку с любой стороны и разрезав диафрагму. Осторожно удерживайте и поднимайте блок сердца-легких во время разрезания вдоль нисходящей аорты, следя за тем, чтобы дуга аорты оставалась неповрежденной. Это позволит сохранить достаточную длину аорты для канюляции.
7. Крысу усыпляют путем удаления сердца и легких, пока она находится под наркозом. Погрузите блок сердца и легких в буферную ледяную жижу KH, чтобы позволить сердцу остановиться.

5. Канюлирование сердца на изолированный рабочий контур перфузии сердца

1. Перенесите блок сердца и легких в марлю на льду. Рассеките лишний жир вокруг аорты, обрежьте аорту так, чтобы оставить длину 3-5 мм для канюляции, и сделайте небольшой разрез ~1-2 мм в легочной артерии. Это позволит проложить путь для коронарного стока.
2. Поместите обрезанный блок сердца и легких (еще находясь на льду) прямо под канюли. Отрегулируйте поток со стороны Лангендорфа с помощью зажима для трубки с контролем потока, чтобы облегчить канюляцию аорты. Осторожно наденьте аорту на левую канюлю, удерживайте ее черным зажимом и завяжите шелковым швом 2-0.
3. Увеличьте расход за счет перфузии Лангендорфа, полностью открыв зажим трубки для регулирования потока. Откройте зажим для последующей нагрузки. Обеспечьте непрерывный поток из камеры Лангендорфа. Начните следить за сердечной деятельностью с помощью программного обеспечения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: если значение аортального потока на дисплее флоуметра составляет <10 мл/мин, убедитесь, что легочная артериотомия имеет достаточный размер. Низкий след/значение аортального потока также может указывать на то, что аортальная канюля была вставлена слишком далеко.
4. Отрегулируйте блок сердца и легких так, чтобы передняя поверхность легких была обращена к оператору. Перевяжите левую долю легкого шелковым швом 2-0 и отрежьте лишнюю левую легочную ткань. Завяжите оставшиеся доли легких одним махом шелковым швом 2-0 и разрежьте ткань. Поверните сердце так, чтобы перевязанные легкие были направлены к задней части.
5. С помощью маленьких ножниц Ваннас отрежьте край левого предсердного придатка на 2-3 мм, следя за тем, чтобы было достигнуто небольшое отверстие в предсердии. Осторожно канюлейте ушок левого предсердия к левой канюле, зажмите его черным зажимом и завяжите шелковым швом 2-0. На рисунке 3А показано расположение обеих канюль.
6. Отрегулируйте водяную рубашку камеры сердца так, чтобы сердце находилось в центре камеры.
7. Откройте датчик давления на воздух и обнулите датчик давления в программном обеспечении, выбрав раскрывающееся меню «Давление в аорте» > Bridge Amp > Zero. Нажмите OK.
8. Перфузируйте сердце в режиме Лангендорфа в течение 10 минут. Убедитесь, что скорость потока в аорте по Лангендоффу измеряется в пределах 10-20 мл/мин (идеальный показатель 20 мл/мин).
9. Перед переключением рабочего режима убедитесь, что воздушный камень (надвижной входной фильтр) из буферного резервуара Langendorff KH находится в рабочем буферном резервуаре KH.
10. Переключите сердце в рабочий режим, закрыв большой зажим, ведущий к аортальной канюле, и открыв поток, ведущий к ушку левого предсердия. Откройте трехходовой кран, ведущий от рабочего перфузата. Перенесите общую возвратную трубку (отводящую буфер KH обратно в резервуар) из резервуара Лангендорфа в рабочий резервуар.
11. Перфузируйте сердце в рабочем режиме в течение 15 мин. Значения потока в аорте в идеале должны составлять >30 мл/мин в конце 15-минутной перфузии. Как только состояние сердца стабилизируется, начните записывать данные в программное обеспечение для анализа данных.
12. Измеряйте коронарный сток (коронарный поток) через 1 мин, 5 мин, 10 мин и 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения коронарного кровотока должны быть в пределах 10-20 мл/мин. Коронарный кровоток более 22 мл/мин обычно указывает на утечку, происходящую из неперевязанного легочного сосуда. Частота сердечных сокращений должна быть в пределах 200-300 уд/мин. Коронарные стоки могут быть собраны для последующего анализа маркеров повреждения тканей (например, тропонина-I, высвобождения лактатдегидрогеназы).

6. Введение кардиоплегии для холодового статического хранения сердца

1. Заполните камеру кардиоплегии (расположенную на высоте 60 см для обеспечения перфузионного давления около 40 мм рт.ст.) 50 мл специального раствора для сохранения сердца (с добавкой или без нее).
2. Опустите водяную рубашку и закройте трехсторонний кран со стороны режима работы.
3. Остановите поток в направлении левой предсердной канюли, закрыв зажим.
4. Откройте поток к канюле аорты.
5. Закройте хомут со стороны Лангендоффа и на концевой нагрузке.
6. Откройте зажим от линии кардиоплегии и смойте 15 мл кардиоплегии из линии давления. Закройте кран на напорной линии.
7. Дайте сердцу промыться с помощью кардиоплегии через аортальную канюлю и соберите коронарные стоки. Запустите кардиоплегию в течение 3 минут и запишите объем введенной кардиоплегии.
8. Остановите запись данных в программном обеспечении и сохраните файл.
9. Через 3 минуты закройте кардиоплегический зажим и маленький синий зажим, ведущий к аортальной канюле.
10. Поместите бульдожий зажим на аортальную канюлю и второй бульдожий зажим на левую канюлю. Отсоедините блок сердечной канюли от цепи и поместите его в стакан с кардиоплегией в холодильнике (рис. 3B, C).
11. Храните сердце в холодильнике в течение 6 часов (или желаемого времени хранения в холодильнике).

7. Реперфузия сердца после хранения холодного статического электричества

1. Подготовьте буфер KH в соответствии с разделом 1.
2. Подготовьте контур перфузии в соответствии с разделом 2.
3. Откройте сохраненный файл из базовой перфузии.
4. Осторожно извлеките блок сердечной канюли из холодильника и закрепите его на контуре перфузии. Перед повторным подключением аортальной канюли используйте шприц с тупым концом 18 G, наполненный буфером KH, чтобы удалить воздух из канюли. Сначала подсоедините канюлю аорты, откройте зажим трубки со стороны Лангендорфа и убедитесь, что зажим трубки после нагрузки открыт.
5. Повторно подключите канюлю левого предсердия, убедившись, что воздух был удален из канюли перед подключением к контуру перфузии. Держите зажим рабочей стороны закрытым до тех пор, пока не придет время переключиться с Лангендорфа на рабочий режим.
6. Перфузируйте сердце в режиме Лангендорфа в течение 15 мин. Обязательно начните запись данных в начале реперфузии Лангендорфа.
7. Перед переходом в рабочий режим поместите оба пузырьковых камня в буфер KH, откройте 3-ходовой кран с рабочей стороны и перенесите общие возвратные трубки в рабочий резервуар.
8. Закройте белый зажим Лангендорфа, откройте белый рабочий боковой зажим и перфузируйте сердце на 30 минут. Измеряйте и собирайте коронарные стоки в определенные моменты времени для последующего анализа (например, маркеры сердечного повреждения). Обязательно остановите или перезапустите запись программного обеспечения, чтобы начать новый сегмент (или добавьте комментарий).
9. Примерно через 15 минут работы реперфузии закройте трехсторонний кран.
10. По окончании реперфузии сохраните файл с данными, остановите поток по цепи и отсоедините сердечную блокаду. Соберите образцы левого желудочка для гистологической обработки и/или заморозьте их для будущих исследований (например, экстракция белка для исследований вестерн-блоттинга).
11. Снимите фильтры с держателей фильтров, слейте воду из буфера из контура и дважды промойте 5 л дистиллированной воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это и не обязательно, полезно предварительно подогреть дистиллированную воду в большой емкости на водяной бане.

8. Анализ функционального восстановления

1. Откройте файл LabChart.
2. Выделите область записи продолжительностью не менее 30 с, затем нажмите «Команда» > «Добавить выбор данных» ИЛИ «Многократное добавление к данным». Это добавит желаемые параметры в файл DataPad в программном обеспечении.
3. Выберите выпадающее меню «Окно » > DataPad.
4. Выделите и скопируйте значения восстановления из DataPad в электронную таблицу для функционального анализа восстановления. Рассчитайте функциональное восстановление в процентах от соответствующего базового значения ^1,6,7.

Результаты

Результаты исходной перфузии определят, был ли первоначальный эксперимент (предварительное хранение) успешным. Отток в аорте, отображаемый в режиме Лангендорфа, должен составлять от 14 до 22 мл/мин. Поток Лангендорфа отображается на расходомере в виде отрицательного з?...

Обсуждение

Учитывая чувствительный характер базовой функции сердца, необходимо позаботиться о том, чтобы перфузионная установка содержалась в чистоте и с совместимыми компонентами. Например, необходимо использовать правильную трубку из ПВХ. Некоторые материалы трубок, такие ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit	ADInstruments	MLT1199	Data Acquisition
Bridge Amp	ADInstruments	FE221	Data Acquisition
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 thermometer	Hanna Instruments	HI98509	Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12	Thomas Scientific	2848Y40	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.	Thomas Scientific	8847T08	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.	Thomas Scientific	8847T02	Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure	Coherent Scientific	14121	Surgical Equipment
Closed Connector	Thomas Scientific	8847E25	Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24	Specialist Medical Supplies	S195	Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	To make Krebs Buffer
Dual Channel Console	ADInstruments	TS402	Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD	Coherent Scientific	14114	Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated	Met-App Australia Pty Ltd	1352	Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)	Thermoline Scientific	TU3	Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter	Thomas Scientific	8847V08	Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor	John Morris	1015164	Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved	Coherent Scientific	WPI-501748	Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight	Coherent Scientific	WPI-501252	Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS	John Morris	1014414	Mounting screws for pump heads
Open-sided connector	Thomas Scientific	8847E05	Rig Construction
Paraformadehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g	VWR Chemicals	26764.26	To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software	ADInstruments	ML826	Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK	Merck Millipore	SX0004701	Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK	Merck Millipore	XX1104707	Rig Construction
Single Buret Clamp	Thomas Scientific	8847T32	Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler)	Sigma-aldrich	59277	Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector	Thomas Scientific	8847E35	Rig Construction
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm	Merck Millipore	SX0004700	Rig Construction
syringes 1 mL box/100	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm	Met-App Australia Pty Ltd	1356	Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410	ADInstruments	TS410	Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades	Coherent Scientific	WPI-500-086	Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray	Thermoline Scientific	TLWB-30	Rig Construction