שימוש במודל לב חולדה עובד מבודד לבדיקת אסטרטגיות שימור לב של תורם

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לב של חולדה עובדת מבודד ex vivo כדי לבחון אסטרטגיות שימור לב של תורם. מאמר זה מתאר את פרוטוקול השימוש באחסון קר סטטי של לבבות תורמי מכרסמים; עם זאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול גם עבור לבבות תורמים המתקבלים לאחר תרומה לאחר מוות במחזור הדם ומוות מוחי.

Abstract

אופטימיזציה של פתרונות שימור לב תורם שיחקה תפקיד מפתח בהפחתת פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה בלבבות התורם במהלך שאיבת איברים, הובלה והשתלה. עבודות קודמות מהמעבדה שלנו הראו כי תוספת של גליצריל טריניטרט ואריתרופויאטין לתמיסות שימור לב תורם יכולה לשפר באופן משמעותי את התאוששות תפקוד הלב לאחר אחסון קר ממושך ובתרומה לאחר מוות לבבות במחזור הדם. פרוטוקול תוספת זה יושם בשימוש קליני ביחידות השתלות ברחבי אוסטרליה, בלגיה ובריטניה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקת אסטרטגיות תוספי תזונה באמצעות מעגל זילוח לב חולדה עובד מבודד ex vivo (IWRH). באמצעות מתודולוגיה זו, ניתן לבחון אסטרטגיות תוספים בהקשר של אחסון סטטי קר ממושך, תרומה לאחר מוות מוחי ותרומה לאחר מוות במחזור הדם שימור לב מתורם. התאוששות תפקודית לבבית, הנמדדת על ידי זרימת אבי העורקים, זרימה כלילית, תפוקת לב, לחץ דופק וקצב לב, יכולה לשמש כדי לקבוע אם אסטרטגיית שימור מסוימת יכולה למזער פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה של הלב התורם.

Introduction

ההצלחה של השתלת לב יכולה להיות מושפעת מאוד משיטת השימור המשמשת את הלב התורם. לבבות תורמים חשופים לעלבונות איסכמיים לאורך כל תהליך שאיבת האיברים, הובלתם והשתלתם. ניתן למתן את מידת הנזק האיסכמי לאיבר התורם על ידי בחירת אסטרטגיית שימור לב תורם מתאימה. אחסון סטטי קר (CSS) נותר השיטה המעשית והנפוצה ביותר לשימור לב תורם; עם זאת, CSS לא בהכרח יכול להיות האפשרות הטובה ביותר עבור כל מסלולי תרומת הלב. לדוגמה, לבבות שנרכשו באמצעות מסלול התרומה לאחר מוות במחזור הדם (DCD) נשמרים ומוערכים כדאיותם באמצעות זילוח מכונה נורמותרמי, בעוד שלבבות שנרכשו באמצעות מסלול תרומה לאחר מוות מוחי (DBD) יכולים להישמר באמצעות CSS או זילוח מכונה היפותרמית. גורם חשוב נוסף לאסטרטגיית השימור בה נעשה שימוש הוא כמות האיסכמיה החמה (עבור DCD) או איסכמיה קרה (עבור DBD) שהלב נתון לה במהלך רכישת איברים והובלה.

מרכזים רבים משתמשים בתוספים פרמקולוגיים נוספים של תמיסת שימור הלב כדי להגביר את הסבילות האיסכמית ולשפר את תפקוד הלב לאחר ההשתלה. מחקרי מכרסמים מהמעבדה שלנו הראו כי תוספת של cardioplegia עם אריתרופויאטין ו glyceryl trinitrate היה מסוגל לשפר באופן משמעותי את התאוששות תפקוד הלב לאחר אחסון קר ממושך של הלב התורם ^1,2. מחקרים אלה התקדמו לאחר מכן למחקרים חזיריים של שימור לב תורם וסיפקו את הבסיס הפרה-קליני שהוביל לשילוב של אריתרופויאטין וגליצריל טריניטרט בתמיסת הקרדיופלגיה של הלבבות שנרכשה באמצעות מסלול DCD תוך שימוש בזילוח מכונה נורמותרמית ^3,4,5. כיום, תוספי אריתרופויאטין וגליצריל טריניטרט משמשים גם ביחידות השתלות אוסטרליות לשאיבת לב DBD קלינית המשלבת CSS. המטרה הכוללת של פרוטוקול הזלוף של לב חולדה עובד מבודד (IWRH) המתואר להלן היא לבחון אסטרטגיות שימור לב תורם בתנאי מעבדה ולבדוק את יעילותן לשימור תפקוד הלב התורם לאחר רפרפוזיה. פרוטוקול לב החולדה המבודד המתואר נמצא בשימוש כבר למעלה משני עשורים במעבדה שלנו והוכח כיעיל ביותר בסינון תוספי מזון פוטנציאליים ו / או אסטרטגיות שיכולות לשפר את שימור לב התורם 2,7,8,9.

Protocol

כל בעלי החיים קיבלו טיפול הומני בהתאם להנחיות המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (אוסטרליה). כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של מכון גארוואן למחקר רפואי (סידני, אוסטרליה).

1. הכנת חיץ קרבס-הנסלייט (KH)

1. הכן 2 ליטר של תמיסת מלאי 20x של מאגר KH המכיל 2.36 M NaCl, 0.094 M KCl, 0.024 M MgSO₄, 0.024 M KH₂PO₄. Aliquot לתוך צינורות 50 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C.
2. לפני הניסוי, הכינו שתי צלוחיות 2 ליטר Erlenmyer של חיץ 1x KH המכיל 1900 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה, 100 מ"ל של 20x מאגר KH, 4.20 גרם של NaHCO₃ (25 מילימול) ו-3.96 גרם גלוקוז (11 מילימול).
   1. הניחו את צלוחיות החיץ באמבט מים בטמפרטורה של 37°C וגזו את התמיסה עם קרבוגן (95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני, קצב זרימה מוגדר ל-2 ליטר/דקה) דרך אבני אוויר (מסנן כניסה מחליק) למשך 5 דקות, ולאחר מכן הוסיפו 2.8 מ"ל של 1 M CaCl₂ (1.4 mM). המשיכו לבעבע את התמיסה לפחות שעה לפני תחילת הניסוי. שימוש באבן אוויר מסייע לאוורור אחיד של החיץ.
   2. מניחים נפח קטן (~ 50 מ"ל) של חיץ לתוך צלחת מתכת עגולה ב -20 ° C כדי להתקרר וליצור שכבה של חיץ קר.

2. הכנת מעגל זילוח

1. יש לוודא שכל הצינורות וכלי הזכוכית נקיים ללא גידול/זיהום נראים לעין.
2. הגדר גבהים של תאי זכוכית כך שיתאימו ללחצי הזילוח הנדרשים בהתבסס על 1 ס"מ H₂O שווה ערך ל- 1.36 מ"מ כספית: Langendorff-to-heart 100 ס"מ (כ- 75 מ"מ כספית), לפני עומס עבודה מצד ללב 15 ס"מ (כ- 11 מ"מ כספית), תא עומס מלב לחלל 100 ס"מ (כ- 75 מ"מ כספית).
3. התחל את זרימת המים החמים סביב המעגל לפחות 10 דקות לפני זילוח הלב.
4. הכניסו מסנני מיקרופייבר (1.2 מיקרומטר) למחזיקי המסננים והדקו אותם היטב.
5. הפעילו את המעגל עם חיץ KH, כדי לוודא שכל האוויר מוסר, והשתמשו במהדק צינורות בקרת זרימה כדי לכוונן את הזרימה בצד לנגנדורף (איור 1A, B) ל~50 מ"ל/דקה. הזרימה האיטית יותר מאפשרת הקלה על קנולציה של אבי העורקים ומונעת את עקירת הלב לפני הקשירה. מקם מדחום בתוך המעגל באמצעות מחבר צינורות בצורת T כדי לפקח על טמפרטורת המאגר ב~ 37 ° C.

3. הקמת תוכנת Lab Chart (ניתוח נתונים)

1. ודא ש-Powerlab (מערכת איסוף נתונים) ומד זרימה מופעלים ומחוברים למחשב לפני פתיחת תוכנת ניתוח הנתונים.
2. פתח קובץ חדש.
3. הגדר איסוף נתונים על-ידי בחירת התפריט הנפתח הגדרות ובחירה באפשרות הגדרות ערוץ. בחרו לחץ אבי העורקים, זרימת אבי העורקים וקצב הלב (איור 2A).
4. הגדר כל ערוץ עם ההגדרות המוצגות באיור 2B.

4. הכנת בעל חיים לבידוד לב חולדה

הערה: המתודולוגיה לבידוד לב חולדה וזילוח עבור לבבות שאינם DBD ושאינם DCD לאחסון סטטי קר מתוארת להלן. השיטות למכשור לב על מעגל הזלוף דומות יחסית ללא קשר לשיטת התרומה בה משתמשים. ההבדלים בפרוטוקול תרומת לב של חולדות DBD ו-DCD מתרחשים בעיקר מרגע כניסת ההרדמה לתוקף ועד להוצאת הלב מהחיה.

1. לשקול את החיה, להבטיח כי משקלו הוא >330 גרם. טווח המשקל האידיאלי עבור חולדות זכרים הוא 330-420 גרם.
2. מתן זריקה תוך צפקית של קטמין (80 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג). ודא שמישור כירורגי מתאים של הרדמה מבוסס על היעדר רפלקס דוושה (רפלקס צביטת בוהן) ורפלקס מצמוץ עיניים.
3. מניחים את החיה במצב שכיבה, מאבטחים את הגפיים עם קלטת. לתת חמצן לחיה דרך חרוט האף.
4. יש את מיכל המתכת של KH חוצץ קרח ומיכל מתכת קטן עם קרח בתחנת הניתוח. השרו גזה בגודל 7.5 ס"מ x 7.5 ס"מ במאגר KH והניחו אותה על המיכל בקרח.
5. לאחר אישור מישור כירורגי הולם של הרדמה, לגלח את העור באתר החתך הכירורגי ולנקות את העור עם אספטי כגון betadine או 70% אלכוהול. בצע חתך רוחבי לאורך הבטן (laparotomy) והזז את הקיבה והמעיים הצידה כדי לאפשר גישה לווריד הכליה השמאלי. יש להזריק 1500 IU הפרין ולהפעיל לחץ על אתר ההזרקה עד לדימום מפסיק. יש להמתין 1-2 דקות עד שההפרין יזרום לפני שתמשיך בשאיבת הלב.
6. פתח את חלל החזה על ידי חיתוך דרך כלוב הצלעות משני הצדדים וחיתוך על פני הסרעפת. החזיקו והרימו בזהירות את גוש הלב-ריאה תוך כדי חיתוך לאורך אבי העורקים היורד, וודאו שקשת אבי העורקים נשארת שלמה. זה יאפשר מספיק אורך אבי העורקים להישאר עבור קנולציה.
7. החולדה מורדמת על ידי הסרת הלב והריאות בזמן הרדמה. השקיעו את גוש הלב-ריאה בגוש הקרח KH כדי לאפשר ללב לעצור.

5. שימורי הלב למעגל זילוח הלב העובד המבודד

1. מעבירים את גוש הלב-ריאה לגזה על קרח. מנתחים עודפי שומן סביב אבי העורקים, חותכים את אבי העורקים כדי להשאיר אורך 3-5 מ"מ לקנולציה, ומבצעים חתך קטן ~ 1-2 מ"מ בעורק הריאה. זה יאפשר נתיב לשפכים הכליליים.
2. הניחו את גוש הלב-ריאה החתוך (בעודו עדיין על קרח) ישירות מתחת לצינוריות. כוונן את הזרימה מצד לנגנדורף באמצעות מהדק צינורות בקרת זרימה כדי להקל על קנולציה של אבי העורקים. בזהירות צינור אבי העורקים על הצינורית השמאלית, להחזיק אותו עם מהדק שחור, ולקשור אותו עם תפר משי 2-0.
3. הגדל את הזרימה מזילוח לנגנדורף על ידי פתיחה מלאה של מהדק צינורות בקרת הזרימה. פתח את מהדק העומס שלאחר מכן. ודא שיש זרימה רציפה מתא לנגנדורף. התחל לנטר את פעילות הלב באמצעות תוכנה.
   הערה: אם ערך זרימת אבי העורקים בתצוגת מד הזרימה הוא <10 מ"ל/דקה, ודא שעורק הריאה הוא בגודל מספיק. עקב/ערך נמוך של זרימת אבי העורקים יכול גם להצביע על כך שצינורית אבי העורקים הוחדרה רחוק מדי.
4. התאימו את גוש הלב-ריאה כך שהמשטח הקדמי של הריאות פונה למפעיל. קשרו את אונת הריאה השמאלית בתפר משי 2-0 וחתכו עודפי רקמת ריאה שמאלית. קשרו את אונות הריאה הנותרות בטאטוא אחד בתפר משי 2-0 וחתכו את הרקמה. סובב את הלב כך שהריאות הקשורות יהיו לכיוון הגב.
5. בעזרת מספריים קטנים של Vannas, חותכים קצה של 2-3 מ"מ של תוספתן פרוזדורים שמאלי, ומבטיחים שיושג פתח קטן לתוך האטריאה. בזהירות לצבוע את תוספתן פרוזדורים שמאל לצינורית השמאלית, להחזיק אותו עם מהדק שחור, ולקשור אותו עם תפר משי 2-0. איור 3A מראה את המיקום של שתי הצינוריות.
6. כוונן את מעיל המים של תא הלב כך שהלב ישב במרכז החדר.
7. פתח את מתמר הלחץ לאוויר ואפס את מתמר הלחץ בתוכנה על ידי בחירת התפריט הנפתח לחץ אבי העורקים > גשר מגבר > אפס. לחץ על אישור.
8. מבלבלים את הלב במצב לנגנדורף למשך 10 דקות. ודא כי זרימת אבי העורקים לנגנדוף מודדת בין 10-20 מ"ל / דקה (אידיאלי 20 מ"ל / דקה).
9. לפני החלפת מצב העבודה, ודא שאבן האוויר (מסנן כניסה מחליק) ממאגר החיץ Langendorff KH ממוקמת במאגר החיץ KH העובד.
10. העבר את הלב למצב עבודה על ידי סגירת המהדק הגדול המוביל לצינורית אבי העורקים ופתיחת הזרימה המובילה לתוספתן הפרוזדורים השמאלי. פתח ברז תלת-כיווני המוביל מעבודה מבלבלת. העבירו את צינור ההחזרה המשותף (החזרת חיץ KH למאגר) ממאגר לנגנדורף למאגר העובד.
11. מחוררים את הלב במצב עבודה למשך 15 דקות. ערכי זרימת אבי העורקים חייבים להיות באופן אידיאלי >30 מ"ל/דקה בתום זילוח של 15 דקות. לאחר שהלב התייצב, התחל להקליט נתונים בתוכנת ניתוח נתונים.
12. יש למדוד שפכים כליליים (זרימה כלילית) בדקה, 5 דקות, 10 דקות ו-15 דקות.
    הערה: ערכי הזרימה הכלילית צריכים להיות בין 10-20 מ"ל/דקה. זרימה כלילית גדולה מ-22 מ"ל/דקה מצביעה בדרך כלל על דליפה שמקורה בכלי ריאתי לא קשור. קצב הלב צריך להיות בין 200-300 פעימות לדקה. ניתן לאסוף שפכים כליליים לצורך ניתוח במורד הזרם של סמני פגיעה ברקמות (למשל, טרופונין-I, שחרור לקטט דהידרוגנאז).

6. מתן cardioplegia לאחסון סטטי קר של הלב

1. מלאו את תא הקרדיופלגיה (ממוקם בגובה של 60 ס"מ כדי להפיק לחץ זילוח של כ-40 מ"מ כספית) בתמיסת שימור לב ייעודית של 50 מ"ל (עם או בלי תוספת).
2. הנמיכו את מעיל המים וסגרו את הברז התלת-כיווני בצד מצב העבודה.
3. עצור את הזרימה לכיוון צינורית הפרוזדורים השמאלית על ידי סגירת המהדק.
4. פתח את הזרימה לצינורית אבי העורקים.
5. סגור את המהדק מצד לנגנדוף ועל העומס הבא.
6. פתח את המהדק מקו הקרדיופלגיה ושטף 15 מ"ל של קרדיופלגיה מקו הלחץ. סגור את הברז בקו הלחץ.
7. אפשר ללב להיות סמוק עם cardioplegia דרך צינורית אבי העורקים ולאסוף את השפכים הכליליים. הפעל cardioplegia במשך 3 דקות להקליט את נפח cardioplegia מנוהל.
8. הפסק להקליט נתונים בתוכנה ושמור את הקובץ.
9. לאחר 3 דקות, סגור את מהדק cardioplegia ואת מהדק כחול קטן המוביל צינורית אבי העורקים.
10. מניחים מהדק בולדוג על צינורית אבי העורקים ומהדק בולדוג שני על הצינורית השמאלית. נתקו את גוש צינורית הלב מהמעגל והניחו אותו בתוך המכילה קרדיופלגיה בקופסת קרח (איור 3B, C).
11. אחסנו את הלב במקרר למשך 6 שעות (או זמן האחסון הקר הרצוי).

7. זילוח לב לאחר אחסון סטטי קר

1. הכינו חיץ KH לפי סעיף 1.
2. הקדימו את מעגל הזלוף לפי סעיף 2.
3. פתח את הקובץ שנשמר מזילוח מקו הבסיס.
4. הסר בזהירות את גוש צינורית הלב מקופסת הקרח וחבר אותו למעגל הזילוח. לפני חיבור מחדש של צינורית אבי העורקים, השתמש במזרק 18 G קהה מלא בחיץ KH כדי להסיר אוויר מהצינורית. חבר תחילה את צינורית אבי העורקים, פתח את מהדק הצינור בצד לנגנדורף וודא שמהדק הצינור פתוח.
5. חבר מחדש את צינורית הפרוזדורים השמאלית, וודא שהאוויר הוסר מהצינורית לפני החיבור למעגל הזילוח. שמור על מהדק צד העבודה סגור עד שהגיע הזמן לעבור ממצב לנגנדורף למצב עבודה.
6. מחוררים את הלב במצב לנגנדורף למשך 15 דקות. הקפד להתחיל להקליט נתונים בתחילת הרפרפוזיה של לנגנדורף.
7. לפני המעבר למצב עבודה, מקם את שתי האבנים המבעבעות במאגר KH, פתח את הברז התלת-כיווני בצד העבודה, והעבר צינורות החזרה נפוצים למאגר העבודה.
8. סוגרים את מהדק לנגנדורף הלבן, פותחים את מהדק הצד הלבן ומערבבים את הלב למשך 30 דקות. למדוד ולאסוף שפכים כליליים בנקודות זמן ייעודיות לניתוח במורד הזרם (למשל, סמני פגיעה לבבית). הקפד להפסיק להפעיל מחדש את הקלטת התוכנה כדי להתחיל קטע חדש (או לחילופין, הוסף תגובה).
9. לאחר כ-15 דקות פרפוזיה של מצב עבודה, סגור את ההקשה התלת-כיוונית.
10. בסוף הרפרפוזיה, שמור את קובץ הנתונים, עצור את הזרימה דרך המעגל, ונתק את בלוק הלב. איסוף דגימות חדר שמאל לעיבוד היסטולוגי ו/או הקפאת הצמדה למחקרים עתידיים (למשל, מיצוי חלבונים למחקרי כתמים מערביים).
11. הסירו את המסננים ממחזיקי המסנן, רוקנו את החיץ מהמעגל ושטפו פעמיים ב-5 ליטר מים מזוקקים.
    הערה: למרות שזה לא הכרחי, זה עוזר לחמם מראש את המים המזוקקים במיכל גדול בתוך אמבט המים.

8. ניתוח התאוששות תפקודית

1. פתח את הקובץ LabChart.
2. סמן אזור של הקלטה של 30 שניות לפחות ולאחר מכן לחץ על Command > Add data selection OR Multiple add to data. פעולה זו תוסיף את הפרמטרים הרצויים לקובץ DataPad בתוך התוכנה.
3. בחר תפריט נפתח חלון > DataPad.
4. סמן והעתק את ערכי השחזור מ- DataPad לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח שחזור פונקציונלי. חשב התאוששות פונקציונלית כאחוז^מהערך הבסיסי המתאים ^1,6,7.

תוצאות

התוצאות מהזילוח הבסיסי יקבעו אם הניסוי הראשוני (טרום אחסון) היה מוצלח. זרימת אבי העורקים המוצגת במצב Langendorff צריכה להיות בין 14 - 22 מ"ל/דקה. זרימת לנגנדורף מוצגת כערך שלילי במד הזרימה עקב זילוח מדרדר של אבי העורקים. דוגמה לעקבות לנגנדורף מקובלים מוצגת באיור 4A...

Discussion

בהתחשב באופי הרגיש של תפקוד הלב הבסיסי, יש להקפיד לשמור על מתקן הזילוח נקי ועם רכיבים תואמים. לדוגמה, יש להשתמש בצינורות PVC נכונים. חומרי צינורות מסוימים, כגון סיליקון, יכולים לתרום לזרימת אבי העורקים והתכווצות נמוכה יותר, אשר עשויה להיות עקב אובדן חמצן דרך הצינור. בעוד שי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit	ADInstruments	MLT1199	Data Acquisition
Bridge Amp	ADInstruments	FE221	Data Acquisition
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 thermometer	Hanna Instruments	HI98509	Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12	Thomas Scientific	2848Y40	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.	Thomas Scientific	8847T08	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.	Thomas Scientific	8847T02	Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure	Coherent Scientific	14121	Surgical Equipment
Closed Connector	Thomas Scientific	8847E25	Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24	Specialist Medical Supplies	S195	Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	To make Krebs Buffer
Dual Channel Console	ADInstruments	TS402	Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD	Coherent Scientific	14114	Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated	Met-App Australia Pty Ltd	1352	Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)	Thermoline Scientific	TU3	Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter	Thomas Scientific	8847V08	Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor	John Morris	1015164	Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved	Coherent Scientific	WPI-501748	Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight	Coherent Scientific	WPI-501252	Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS	John Morris	1014414	Mounting screws for pump heads
Open-sided connector	Thomas Scientific	8847E05	Rig Construction
Paraformadehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g	VWR Chemicals	26764.26	To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software	ADInstruments	ML826	Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK	Merck Millipore	SX0004701	Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK	Merck Millipore	XX1104707	Rig Construction
Single Buret Clamp	Thomas Scientific	8847T32	Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler)	Sigma-aldrich	59277	Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector	Thomas Scientific	8847E35	Rig Construction
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm	Merck Millipore	SX0004700	Rig Construction
syringes 1 mL box/100	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm	Met-App Australia Pty Ltd	1356	Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410	ADInstruments	TS410	Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades	Coherent Scientific	WPI-500-086	Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray	Thermoline Scientific	TLWB-30	Rig Construction