単離された作業用ラット心臓モデルを使用して、ドナーの心臓保存戦略をテストする

要約

ドナーの心臓保存戦略をテストするための ex vivo で分離された作業ラット心臓プロトコルについて説明します。この論文では、げっ歯類のドナー心臓の静的冷蔵で使用するためのプロトコルについて説明します。しかしながら、このプロトコルは、循環器死および脳死後のドナー心臓にも使用することができる。

要約

ドナーの心臓保存ソリューションの最適化は、臓器の回収、輸送、移植中のドナー心臓の虚血再灌流障害を軽減する上で重要な役割を果たしてきました。私たちの研究室からの以前の研究では、ドナーの心臓保存溶液にトリニトリン酸グリセリルとエリスロポエチンを追加すると、長期の低温保存後および循環器死後の心臓の提供における心臓の機能回復が大幅に改善できることが示されました。この補充プロトコルは、オーストラリア、ベルギー、および英国周辺の移植ユニットで臨床使用に実施されています。ここでは、 ex vivo 単離されたワーキングラット心臓(IWRH)灌流回路を使用してサプリメント戦略をテストするためのプロトコルを概説します。この方法論を使用すると、サプリメント戦略は、長期の低温静的保存、脳死後の提供、および循環死後のドナーの心臓保存のコンテキストでテストできます。大動脈血流、冠状動脈血流、心拍出量、脈圧、および心拍数によって測定される心臓機能回復は、特定の保存戦略がドナー心臓の虚血再灌流損傷を最小化できるかどうかを判断できる。

概要

心臓移植の成功は、ドナーの心臓に用いられる保存方法に大きく左右されます。ドナーの心臓は、臓器の回収、輸送、および移植のプロセス全体を通じて虚血性損傷を受けます。ドナー臓器への虚血性損傷の程度は、適切なドナーの心臓保存戦略を選択することで軽減できます。冷静電保存(CSS)は、ドナーの心臓保存のための最も実現可能で一般的な方法であり続けています。ただし、CSSは必ずしもすべての心臓提供経路にとって最良の選択肢であるとは限りません。たとえば、循環死後 (DCD) 経路の提供によって調達された心臓は、常温機械灌流を使用して維持および生存率が評価されますが、脳死 (DBD) 経路後の提供によって調達された心臓は、CSS または低体温機械灌流を使用して保存できます。使用される保存戦略の別の重要な決定要因は、臓器の調達および輸送中に心臓が受ける温虚血(DCDの場合)または冷虚血(DBDの場合)の量です。

多くのセンターでは、虚血耐性を高め、移植後の心機能を改善するために、心臓保存液の追加薬理学的補給を使用しています。私たちの研究室のげっ歯類の研究では、エリスロポエチンと三硝酸グリセリルを心臓麻痺に補給すると、ドナー心臓の長期冷蔵保存後に心臓の機能回復が大幅に改善できることが示されました^1,2。その後、これらの研究はドナーの心臓温存に関するブタ研究に進み、常温^{機灌流3,4,5}を利用したDCD経路を介して調達された心臓の心臓麻痺溶液にエリスロポエチンとトリニトリン酸グリセリルを組み込むことにつながる前臨床の基礎を提供しました。現在、エリスロポエチンとトリニトリン酸グリセリルの補給は、CSS を組み込んだ臨床 DBD 心臓回復のためのオーストラリアの移植ユニットでも使用されています。以下に概説する単離されたワーキングラット心臓(IWRH)灌流プロトコルの全体的な目標は、実験室環境でドナーの心臓保存戦略をテストし、再灌流後にドナーの心臓機能を維持するための有効性をテストすることです。記載されている単離された作業ラット心臓プロトコルは、私たちの研究室内で20年以上にわたって使用されており、ドナーの心臓保存2,7,8,9を改善できる潜在的なサプリメントおよび/または戦略のスクリーニングに非常に有用であることが証明されています。

プロトコル

すべての動物は、National Health and Medical Research Council(オーストラリア)のガイドラインに従って人道的なケアを受けました。すべての動物実験は、ガーバン医学研究所(オーストラリア、シドニー)の動物倫理委員会によって承認されました。

1. クレブス・ヘンセライト(KH)緩衝液の調製

1. 2.36 M NaCl、0.094 M KCl、0.024 M MgSO₄、0.024 M KH₂PO₄を含むKHバッファーの20倍ストック溶液を2 L調製します。50 mLチューブに分注し、-20°Cで保存します。
2. 実験に先立ち、1900 mLの脱イオン水、100 mLの20倍ストックKH緩衝液、4.20 gのNaHCO₃ (25 mM)、および3.96 gのグルコース(11 mM)を含む1x KH緩衝液の2 L三角フラスコを2つ調製します。
   1. 緩衝フラスコを37°Cのウォーターバスに入れ、カルボゲン(酸素95%、二酸化炭素5%、流量2L/min)で溶液をエアストーン(スリップオンインレットフィルター)で5分間ガス化し、1M CaCl₂ (1.4 mM)を2.8 mL加えます。実験開始の少なくとも1時間前に溶液をバブリングし続けます。エアストーンの使用は、バッファーの均一な曝気を支援します。
   2. -20°Cの丸い金属皿に少量(~50mL)のバッファーを入れて冷却し、氷結バッファーの層を形成します。

2. 灌流回路の作製

1. すべてのチューブとガラス器具が清潔で、目に見える成長や汚染がないことを確認してください。
2. 1 cm H₂Oが1.36 mmHgに相当することを基準に、必要な灌流圧力に対応するようにガラスチャンバーの高さを設定します:ランゲンドルフから心臓まで100 cm(約75 mmHg)、心臓から心臓まで15 cm(約11 mmHg)、心臓から後負荷チャンバーまで100 cm(約75 mmHg)。
3. 心臓灌流の少なくとも10分前に、回路の周りのお湯の循環を開始します。
4. マイクロファイバーフィルター(1.2μm)をフィルターホルダーに入れ、しっかりと固定します。
5. KHバッファーで回路をプライミングし、すべての空気が除去されていることを確認し、フロー制御チューブクランプを使用してランゲンドルフ側の流量(図1A、B)を~50 mL/minに調整します。流れが遅いため、大動脈カニューレ挿入が容易になり、結束前に心臓が外れるのを防ぎます。T字型のチューブコネクタを介して回路内に温度計を配置し、~37°Cのバッファの温度を監視します。

3. ラボカルテ(データ分析)ソフトのセットアップ

1. データ分析ソフトウェアを開く前に、Powerlab(データ収集システム)と流量計の電源がオンになっていて、コンピューターに接続されていることを確認してください。
2. 新しいファイルを開きます。
3. データ収集を設定するには、[ 設定 ] ドロップダウン メニューを選択し、[ チャネル設定] を選択します。 [Aortic Pressure](大動脈圧)、[Aortic Flow](大動脈流量)、および [Heart Rate ](心拍数)を選択します(図2A)。
4. 図 2B に示す設定で各チャネルを設定します。

4. ラットの心臓分離のための動物の調製

注:冷静静的保存のための非DBDおよび非DCD心臓のラット心臓分離および灌流の方法論を以下に概説します。灌流回路への心臓計装の方法は、どのドネーション方法を使用するかに関係なく、比較的類似しています。DBDとDCDラットの心臓提供のプロトコルの違いは、主に動物の麻酔が効いた時点から心臓が動物から切除されるまでに発生します。

1. 動物の体重を量り、体重が>330gであることを確認します。雄ラットの理想的な体重範囲は330〜420 gです。
2. ケタミン(80 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)の腹腔内注射を投与します。.ペダル反射(つま先つまみ反射)とまばたき反射がないことに基づいて、適切な麻酔の手術面を確保します。
3. 動物を仰臥位に置き、手足をテープで固定します。ノーズコーンを介して動物に酸素を投与します。
4. 解剖ステーションにKHバッファーアイススラッシュメタルコンテナと氷入りの小さな金属コンテナを用意します。7.5 cm x 7.5 cmのガーゼをKHバッファーに浸し、氷を入れた容器に置きます。
5. 麻酔の適切な手術面が確認されたら、外科的切開部位の皮膚を剃り、ベタジンや70%アルコールなどの無菌薬で皮膚を洗浄します。腹部を横切って横切開を行い(開腹術)、胃と腸を横に移動して、左腎静脈にアクセスできるようにします。1500IUのヘパリンを注入し、出血が止まるまで注射部位に圧力をかけます。ヘパリンが循環するまで1〜2分待ってから、心臓の回収を続行します。
6. 両側の胸郭を切断し、横隔膜を横切って切断することにより、胸腔を開きます。下行する大動脈に沿って切断しながら、心肺ブロックを慎重に保持して持ち上げ、大動脈弓が無傷のままであることを確認します。これにより、カニューレ挿入のために十分な大動脈の長さを残すことができます。
7. ラットは、麻酔下で心臓と肺を切除することにより安楽死させます。心肺ブロックをKHバッファーアイススラッシュに沈めて、心臓が停止できるようにします。

5. 孤立した作動中の心臓灌流回路に心臓をカニューレで挿入する

1. 心肺ブロックを氷の上のガーゼに移します。大動脈の周りの余分な脂肪を解剖し、大動脈をトリミングしてカニューレ挿入のために3〜5mmの長さを残し、肺動脈に小さな切開を~1〜2mm行います。これにより、冠状動脈流出物への道が可能になります。
2. トリミングされた心肺ブロック(氷上)をカニューレの真下に配置します。ランゲンドルフ側からの流れをフローコントロールチューブクランプで調整し、大動脈カニューレ挿入を容易にします。大動脈を左カニューレに慎重にカニューレし、黒いクランプで保持し、2-0シルク縫合糸で結びます。
3. ランゲンドルフ灌流からの流量を増加させるには、フロー制御チューブクランプを完全に開きます。アフターロードclを開きますamp。ランゲンドルフチャンバーから連続的な流れがあることを確認してください。ソフトウェアで心臓の活動のモニタリングを開始します。
   注:フローメーターディスプレイの大動脈流量が<10mL / minの場合は、肺動脈切開術が十分なサイズであることを確認してください。大動脈のフロートレース/値が低い場合は、大動脈カニューレが挿入されすぎていることを示している可能性もあります。
4. 肺の前面がオペレーターに向くように心肺ブロックを調整します。左肺葉を2-0シルク縫合糸で結び、余分な左肺組織を切り取ります。残りの肺葉を2-0シルク縫合糸で一気に結び、組織を切断します。結ばれた肺が後ろにくるように心臓を回転させます。
5. 小さなVannasはさみを使用して、左心房付属器の2〜3 mmの端を切り取り、心房への小さな開口部が達成されるようにします。左心房付属器を左カニューレに慎重にカニューレし、黒いクランプで保持し、2-0シルク縫合糸で結びます。 図3A は、両方のカニューレの配置を示しています。
6. 心臓がチャンバーの中心に収まるように、ハートチャンバーウォータージャケットを調整します。
7. ソフトウェアで圧力トランスデューサを空気に開き、ゼロ>ブリッジアンプの大動脈圧ドロップダウンメニューを選択して>圧力トランスデューサをゼロにします。[OK] をクリックします。
8. ランゲンドルフモードで心臓を10分間灌流します。ランゲンドフ大動脈流量が10〜20 mL / min(理想的には20 mL / min)を測定することを確認します。.
9. 作業モードを切り替える前に、ランゲンドルフKHバッファーリザーバーからのエアストーン(スリップオンインレットフィルター)が作業KHバッファーリザーバーに配置されていることを確認してください。
10. 大動脈カニューレにつながる大きなクランプを閉じ、左心房付属器につながる流れを開くことにより、心臓を作業モードに切り替えます。作業用灌流液からつながる3方向タップを開きます。共通のリターンチューブ(KHバッファーをリザーバーに戻す)をランゲンドルフリザーバーから作業用リザーバーに移します。
11. 作業モードで心臓を15分間灌流します。大動脈血流の値は、理想的には15分間の灌流終了時に>30 mL / minでなければなりません。.心臓が安定したら、データ解析ソフトウェアでデータの記録を開始します。
12. 冠状動脈流出(冠状動脈の流れ)を1分、5分、10分、15分で測定します。
    注:冠状動脈流量の値は10〜20mL / minである必要があります。冠状動脈の流れが 22 mL/min を超える場合は、通常、結ばれていない肺血管から漏れが発生していることを示します。心拍数は200〜300bpmである必要があります。冠状動脈流出物は、組織損傷マーカー(トロポニン-I、乳酸デヒドロゲナーゼ放出など)の下流分析のために収集できます。

6.心臓の冷静な貯蔵のための心臓麻痺の投与

1. 心臓麻痺チャンバー(60 cmの高さに配置され、約40 mmHgの灌流圧力が得られる)に、50 mLの指定された心臓保存溶液(サプリメントの有無にかかわらず)を満たします。.
2. ウォータージャケットを下げ、作業モード側の三方タップを閉じます。
3. クランプを閉じて、左心房カニューレへの流れを止めます。
4. 大動脈カニューレへの流れを開きます。
5. クランプをLangendoff側とアフターロードから閉じます。
6. 心臓麻痺ラインからクランプを開き、圧力ラインから15mLの心臓麻痺を洗い流します。.圧力ラインのタップを閉じます。
7. 大動脈カニューレを介して心臓を心臓麻痺で洗い流し、冠状動脈の廃液を採取します。心臓麻痺を3分間実行し、投与された心臓麻痺の量を記録します。
8. ソフトウェアへのデータの記録を停止し、ファイルを保存します。
9. 3分後、心臓麻痺クランプと大動脈カニューレにつながる小さな青いクランプを閉じます。
10. 大動脈カニューレにブルドッグクランプを、左カニューレに2つ目のブルドッグクランプを装着します。心臓カニューレブロックを回路から外し、アイスボックス内の心臓麻痺を含むビーカーに入れます(図3B、C)。
11. 心臓を冷蔵庫に6時間(または希望の冷蔵保存時間)保管します。

7.冷静電気保存後の心臓再灌流

1. セクション1に従ってKHバッファーを準備します。
2. セクション2に従って灌流回路をプライミングします。
3. ベースライン灌流から保存したファイルを開きます。
4. アイスボックスからハートカニューレブロックを慎重に取り外し、灌流回路に固定します。大動脈カニューレを再接続する前に、KHバッファーで満たされた鈍い端の18Gシリンジを使用して、カニューレから空気を取り除きます。.最初に大動脈カニューレを接続し、ランゲンドルフ側のチューブクランプを開き、アフターロードチューブクランプが開いていることを確認します。
5. 左心房カニューレを再接続し、灌流回路に接続する前にカニューレから空気が除去されていることを確認してください。ランゲンドルフから作業モードに切り替えるまで、作業サイドクランプを閉じたままにします。
6. ランゲンドルフモードで心臓を15分間灌流します。ランゲンドルフ再灌流の開始時にデータの記録を開始してください。
7. 作業モードに切り替える前に、両方の泡立つ石をKHバッファーに置き、作業側の3方向タップを開き、共通のリターンチューブを作業リザーバーに移します。
8. 白いランゲンドルフクランプを閉じ、白い作業サイドクランプを開き、心臓を30分間灌流します。ダウンストリーム分析のために、指定された時点で冠状動脈流出物を測定および収集します(例:心臓損傷マーカー)。新しいセグメントを開始するには、ソフトウェア録画を停止-再開してください(または、コメントを追加してください)。
9. 約15分間の作業モード再灌流で、三方向タップを閉じます。.
10. 再灌流の終了時に、データファイルを保存し、回路を通る流れを停止し、心臓ブロックを切断します。組織学的処理のために左心室サンプルを採取し、および/または将来の研究のためにスナップ凍結します(例:ウェスタンブロット研究のためのタンパク質抽出)。
11. フィルターホルダーからフィルターを取り外し、回路からバッファーを排出し、5 Lの蒸留水で2回洗い流します。
    注:必須ではありませんが、蒸留水をウォーターバス内の大きな容器にあらかじめ温めるのに役立ちます。

8. 機能回復の解析

1. LabChartファイルを開きます。
2. 録音が 30 秒以上ある領域を強調表示し、[ コマンド] > [データ選択の追加] または [データに複数追加] をクリックします。これにより、ソフトウェア内のDataPadファイルに必要なパラメータが追加されます。
3. [DataPad] > [Window] ドロップダウン メニューを選択します。
4. DataPad からリカバリ値をハイライト表示してスプレッドシートにコピーし、機能リカバリ分析を行います。機能回復を、それぞれのベースライン値 ^1,6,7 のパーセンテージとして計算します。

結果

ベースライン灌流の結果により、初期実験 (事前保存) が成功したかどうかが決まります。ランゲンドルフモード中に表示される大動脈の流れは、14〜22 mL / minである必要があります。.ランゲンドルフフローは、大動脈の逆行性灌流により、流量計に負の値として表示されます。許容可能なランゲンドルフトレースの例を 図4Aに示します。

ディスカッション

心臓のベースライン機能の敏感な性質を考えると、灌流装置を清潔で互換性のあるコンポーネントに保つように注意する必要があります。たとえば、正しいPVCチューブを使用する必要があります。シリコーンなどの一部のチューブ材料は、大動脈の流れと収縮性の低下に寄与する可能性がありますが、これはチューブを介した酸素の損失が原因である可能性がありま...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit	ADInstruments	MLT1199	Data Acquisition
Bridge Amp	ADInstruments	FE221	Data Acquisition
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 thermometer	Hanna Instruments	HI98509	Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12	Thomas Scientific	2848Y40	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.	Thomas Scientific	8847T08	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.	Thomas Scientific	8847T02	Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure	Coherent Scientific	14121	Surgical Equipment
Closed Connector	Thomas Scientific	8847E25	Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24	Specialist Medical Supplies	S195	Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	To make Krebs Buffer
Dual Channel Console	ADInstruments	TS402	Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD	Coherent Scientific	14114	Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated	Met-App Australia Pty Ltd	1352	Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)	Thermoline Scientific	TU3	Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter	Thomas Scientific	8847V08	Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor	John Morris	1015164	Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved	Coherent Scientific	WPI-501748	Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight	Coherent Scientific	WPI-501252	Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS	John Morris	1014414	Mounting screws for pump heads
Open-sided connector	Thomas Scientific	8847E05	Rig Construction
Paraformadehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g	VWR Chemicals	26764.26	To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software	ADInstruments	ML826	Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK	Merck Millipore	SX0004701	Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK	Merck Millipore	XX1104707	Rig Construction
Single Buret Clamp	Thomas Scientific	8847T32	Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler)	Sigma-aldrich	59277	Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector	Thomas Scientific	8847E35	Rig Construction
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm	Merck Millipore	SX0004700	Rig Construction
syringes 1 mL box/100	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm	Met-App Australia Pty Ltd	1356	Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410	ADInstruments	TS410	Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades	Coherent Scientific	WPI-500-086	Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray	Thermoline Scientific	TLWB-30	Rig Construction