単離された作業用ラット心臓モデルを使用して、ドナーの心臓保存戦略をテストする

要約

ドナーの心臓保存戦略をテストするための ex vivo で分離された作業ラット心臓プロトコルについて説明します。この論文では、げっ歯類のドナー心臓の静的冷蔵で使用するためのプロトコルについて説明します。しかしながら、このプロトコルは、循環器死および脳死後のドナー心臓にも使用することができる。

要約

ドナーの心臓保存ソリューションの最適化は、臓器の回収、輸送、移植中のドナー心臓の虚血再灌流障害を軽減する上で重要な役割を果たしてきました。私たちの研究室からの以前の研究では、ドナーの心臓保存溶液にトリニトリン酸グリセリルとエリスロポエチンを追加すると、長期の低温保存後および循環器死後の心臓の提供における心臓の機能回復が大幅に改善できることが示されました。この補充プロトコルは、オーストラリア、ベルギー、および英国周辺の移植ユニットで臨床使用に実施されています。ここでは、 ex vivo 単離されたワーキングラット心臓(IWRH)灌流回路を使用してサプリメント戦略をテストするためのプロトコルを概説します。この方法論を使用すると、サプリメント戦略は、長期の低温静的保存、脳死後の提供、および循環死後のドナーの心臓保存のコンテキストでテストできます。大動脈血流、冠状動脈血流、心拍出量、脈圧、および心拍数によって測定される心臓機能回復は、特定の保存戦略がドナー心臓の虚血再灌流損傷を最小化できるかどうかを判断できる。

概要

心臓移植の成功は、ドナーの心臓に用いられる保存方法に大きく左右されます。ドナーの心臓は、臓器の回収、輸送、および移植のプロセス全体を通じて虚血性損傷を受けます。ドナー臓器への虚血性損傷の程度は、適切なドナーの心臓保存戦略を選択することで軽減できます。冷静電保存(CSS)は、ドナーの心臓保存のための最も実現可能で一般的な方法であり続けています。ただし、CSSは必ずしもすべての心臓提供経路にとって最良の選択肢であるとは限りません。たとえば、循環死後 (DCD) 経路の提供によって調達された心臓は、常温機械灌流を使用して維持および生存率が評価されますが、脳死 (DBD) 経路後の提供によって調達された心臓は、CSS または低体温機械灌流を使用して保存できます。使用される保存戦略の別の重要な決定要因は、臓器の調達および輸送中に心臓が受ける温虚血(DCDの場合)または冷虚血(DBDの場合)の量です。

多くのセンターでは、虚血耐性を高め、移植後の心機能を改善するために、心臓保存液の追加薬理学的補給を使用しています。私たちの研究室のげっ歯類の研究では、エリスロポエチンと三硝酸グリセリルを心臓麻痺に補給すると、ドナー心臓の長期冷蔵保存後に心臓の機能回復が大幅に改善できることが示されました^1,2。その後、これら....

プロトコル

すべての動物は、National Health and Medical Research Council(オーストラリア)のガイドラインに従って人道的なケアを受けました。すべての動物実験は、ガーバン医学研究所(オーストラリア、シドニー)の動物倫理委員会によって承認されました。

1. クレブス・ヘンセライト(KH)緩衝液の調製

1. 2.36 M NaCl、0.094 M KCl、0.024 M MgSO₄、0.024 M KH₂PO₄を含むKHバッファーの20倍ストック溶液を2 L調製します。50 mLチューブに分注し、-20°Cで保存します。
2. 実験に先立ち、1900 mLの脱イオン水、100 mLの20倍ストックKH緩衝液、4.20 gのNaHCO₃ (25 mM)、および3.96 gのグルコース(11 mM)を含む1x KH緩衝液の2 L三角フラスコを2つ調製します。
   1. 緩衝フラスコを37°Cのウォーターバスに入れ、カルボゲン(酸素95%、二酸化炭素5%、流量2L/min)で溶液をエアストーン(スリップオンインレットフィルター)で5分間ガス化し、1M CaCl₂ (1.4 mM)を2.8 mL加えます。実験開始の少なく....

ディスカッション

心臓のベースライン機能の敏感な性質を考えると、灌流装置を清潔で互換性のあるコンポーネントに保つように注意する必要があります。たとえば、正しいPVCチューブを使用する必要があります。シリコーンなどの一部のチューブ材料は、大動脈の流れと収縮性の低下に寄与する可能性がありますが、これはチューブを介した酸素の損失が原因である可能性がありま.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit	ADInstruments	MLT1199	Data Acquisition
Bridge Amp	ADInstruments	FE221	Data Acquisition
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 thermometer	Hanna Instruments	HI98509	Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12	Thomas Scientific	2848Y40	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.	Thomas Scientific	8847T08	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.	Thomas Scientific	8847T02	Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure	Coherent Scientific	14121	Surgical Equipment
Closed Connector	Thomas Scientific	8847E25	Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24	Specialist Medical Supplies	S195	Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	To make Krebs Buffer
Dual Channel Console	ADInstruments	TS402	Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD	Coherent Scientific	14114	Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated	Met-App Australia Pty Ltd	1352	Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)	Thermoline Scientific	TU3	Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter	Thomas Scientific	8847V08	Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor	John Morris	1015164	Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved	Coherent Scientific	WPI-501748	Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight	Coherent Scientific	WPI-501252	Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS	John Morris	1014414	Mounting screws for pump heads
Open-sided connector	Thomas Scientific	8847E05	Rig Construction
Paraformadehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g	VWR Chemicals	26764.26	To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software	ADInstruments	ML826	Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK	Merck Millipore	SX0004701	Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK	Merck Millipore	XX1104707	Rig Construction
Single Buret Clamp	Thomas Scientific	8847T32	Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler)	Sigma-aldrich	59277	Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector	Thomas Scientific	8847E35	Rig Construction
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm	Merck Millipore	SX0004700	Rig Construction
syringes 1 mL box/100	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm	Met-App Australia Pty Ltd	1356	Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410	ADInstruments	TS410	Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades	Coherent Scientific	WPI-500-086	Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray	Thermoline Scientific	TLWB-30	Rig Construction